【生物】纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得第2课时课件-2025-2026学年高二下学期生物浙科版选择性必修3

第二节

纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得第一章

发酵工程第2课时本章学习目标1.阐明使用无菌技术可获得纯净的微生物培养物。2.概述分离和纯化微生物的平板划线法和稀释涂布平板法。3.举例说明通过调整培养基的配方，可有目的地培养某种微生物。4.概述测定微生物数量的稀释涂布平板法和显微镜计数法。5.举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。获得了目标微生物的纯种，就为深入研究这种微生物奠定了基础。接下来可能需要知道这种微生物的繁殖速度，但微生物的个体微小，很难直接观察到它们的数目变化。同时发现，平板上的菌落即使是分开的，也可能难以数清其数量。如果菌落太多，准确数出菌落数并不容易，这会导致最终的计算结果出现较大误差。而菌液稀释度过大，菌落数少，虽然容易准确计数菌落数，但可能存在较大的随机误差。要解决这个问题可以从两个方面着手：一是在保证能准确计数的前提下减小稀释度；二是将相同稀释度下的多组数值取平均值后再进行计算。情境导入当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。1.稀释涂布平板法2.显微镜直接计数法——间接计数法——直接计数法1.间接计数法—稀释涂布平板法选择30-300个菌落的平板进行计数；每个稀释度至少取3个平板取其平均值；统计的菌落往往比活菌的实际数目低；统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。计数原则:

当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量计算公式:每g样品中的菌落数＝(C÷V)×MM代表稀释倍数C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)例：某同学在稀释倍数为106

的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4（234÷0.1）×106=2.34×109答B例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是25、32、18，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（25+32+18）/30.1×105=2.5×107个稀释涂布平板法可测定微生物的数量

某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。请评价这两位同学的实验结果的有效性：1.甲同学____________________________________；

原因是____________________________________。2.乙同学____________________________________；

原因是____________________________________。实验操作不合理未设置重复实验组结果计算不合理21与另外两组数值相差太大，应舍去稀释涂布平板法可测定微生物的数量借助于显微镜、血细胞计数板也能在显微镜下直接对菌液中的酵母细胞进行计数。图是一种较常用的血细胞计数板。缺点：a.不能区分死菌和活菌→偏大。b.不适于对运动细菌的计数。c.个体小的细菌在显微镜下难以观察。优点：快速、直观血细胞计数板：细菌计数板：常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。对细菌等较小的细胞进行观察和计数。显微镜计数法可测定微生物的数量血细胞计数板

血细胞计数板中间被一个短横槽隔为两半，每个半边上刻有一个方格网(图A)。每个方格网上有9个大方格，只有中间一个大方格为计数室，供计数用。计数室(大方格)长和宽各为1mm，深度为0.1mm计数室请试着计算大方格的容积是多少？并换算成微升、毫升。（1）抽样检测法估算试管中的酵母菌总数图A显微镜计数法可测定微生物的数量大方格中方格小方格25(中格)×16(小格)不管计数室是哪一种,每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。16(中格)×25(小格)取四角的四个中方格(100个小方格)计数取四个角和中央的五个中方格(80个小方格)的细胞数。计数室（1)抽样检测法估算试管中的酵母菌总数：显微镜计数法可测定微生物的数量若使用的血细胞计数板(规格为1mm×1mm×0.1mm)每个计数室分为25个中方格，每个中方格又分为16个小方格，将样液稀释100倍后计数，发现计数室四个角及中央共5个中方格内的酵母菌总数为20个，则培养液中酵母菌的密度为_______________。1×108个/mL（1）抽样检测法估算试管中的酵母菌总数试着总结两种计数室估算1mL样品中酵母菌数的公式是什么？显微镜计数法可测定微生物的数量=80×400×104×稀释倍数A1+A2+A3+A4+A51mL样品中酵母菌数=A1+A2+A3+A4+A580×400÷0.1mm3×稀释倍数A1、A2、A3、A4、A5分别为五个中方格中的酵母菌数。25×16型A1A2A3A4A51mm3=10-3mL（1）抽样检测法估算试管中的酵母菌总数显微镜计数法可测定微生物的数量=100×400×104×稀释倍数A1+A2+A3+A416×25型A1A2A4A31mL样品中酵母菌数=A1、A2、A3、A4分别为四个中方格中的酵母菌数。A1+A2+A3+A4100×400÷0.1mm3×稀释倍数1mm3=10-3mL（2）抽样检测法估算试管中的酵母菌总数显微镜计数法可测定微生物的数量当小方格中的酵母菌过多时，可以增大稀释倍数然后再计数，即计数前应摇匀→取样→稀释→计数。用无菌水稀释至每小格细胞数目为5~10个稀释100倍（3）如果一个小方格内酵母菌数量过多，难以数清，应当采取什么措施？显微镜计数法可测定微生物的数量①对于压在边线上的酵母菌应取相邻两边及顶角计数。②对于已经出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算；已死亡的酵母菌不计数。③每个样品一般计数三次，取其平均值。(遵循平行重复原则)（4）对于压在中方格界线上的酵母菌和酵母菌芽体，应当怎样计数？显微镜计数法可测定微生物的数量选择培养基：在培养基中添加（或减去）某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其他微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。1.概念：2.方法：分离得到酵母菌、霉菌等分离固氮菌分离自养型微生物不加含碳有机物的培养基不加氮源的培养基加入青霉素的培养基（1）在培养基中加入某种化学物质。分离得到金黄色葡萄球菌加入高浓度食盐的培养基（2）改变培养基中的营养成分。（3）改变微生物的培养条件。耐高温微生物高温环境下培养厌氧型微生物兼性厌氧型无氧环境下培养调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物类型条件分离得到的菌种（1）改变培养条件（2）添加某种化学物质（3）营养缺陷70～80℃的高温水生栖热菌加入青霉素酵母菌、霉菌等真菌高浓度食盐金黄色葡萄球菌不加含碳有机物不加氮源自养型微生物固氮菌调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3实验原理：因为微生物分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强，若在培养基中加入在酸性情况下呈黄色、碱性情况下呈红色的酚红指示剂，就可根据菌落周围是否出现红色区域，进一步鉴定尿素分解菌。方法：呈碱性，遇酚红指示剂呈红色。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。液体培养基：可以直接看液体的变色情况；固体培养基：活动：能分解尿素的微生物的分离与计数1.利用选择培养基分离能产生脲酶的微生物。2.观察微生物代谢改变环境pH的现象。3.利用稀释涂布平板法对微生物进行计数。目的要求材料用具土壤样品，蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1mol/LHCl，琼脂，琼脂糖，葡萄糖，KHPO4，酚红，蒸馏水，尿素溶液，三角瓶，烧杯，培养皿，有塞试管，试管架，移液器，G6玻璃砂漏斗，装有75%酒精的广口瓶，涂布器，酒精灯，火柴，高压灭菌锅，恒温培养箱等。活动：能分解尿素的微生物的分离与计数活动：能分解尿素的微生物的分离与计数1.制备培养基。方法步骤葡萄糖0.1gNacl0.48gKH2PO40.48gNa2HPO42.1g酚红1mg琼脂2g蒸馏水60ml①提供无机盐；②调节pH活动：能分解尿素的微生物的分离与计数2.灭菌。3.倒平板。方法步骤酒精灯旁活动：能分解尿素的微生物的分离与计数4.制备土壤细菌悬液。方法步骤A.梯度稀释菌液

10-21mL1mL1mL1mL1mL10-310-410-510-610-79mL无菌水99mL无菌水1g活动：能分解尿素的微生物的分离与计数5.接种。方法步骤④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。微量移液器（枪）：可精准吸取少量液体，有不同量程，配合对应规格的一次性灭菌枪头使用活动：能分解尿素的微生物的分离与计数6.培养。将培养皿倒置，置于37℃恒温培养箱中培养24~48h。方法步骤5.实验结果：LB培养基尿素培养基在估算土壤中能分泌脲酶的微生物的数量时，应统计哪个稀释度的培养皿？为什么？应统计稀释度为10-3的3个培养皿中的菌落数后取平均值。因为这个浓度的培养皿中菌落数比较适中，计数的结果误差较小。活动：能分解尿素的微生物的分离与计数5.实验结果：LB培养基尿素培养基这些微生物能够合成脲酶而将尿素分解成氨。氨可使培养基的碱性增强，使含酚红指示剂的培养基变成红色。活动：能分解尿素的微生物的分离与计数合理，因为自生固氮微生物能在固氮酶的作用下，将N2转化为可利用的氮源，故可在没有氮源的培养基上生长。活动：能分解尿素的微生物的分离与计数微生物的数量测定选择培养基的作用微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得选择培养基微生物的选择培养科学实例筛选原则选择培养基的概念及举例稀释涂布平板法的操作过程间接计数法—稀释涂布平板法直接计数—计数板计数法土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基的制备实验设计（1）土壤取样（2）样品的稀释（3）稀释涂布平板法接种（4）微生物的培养与观察实验结果课堂小结随堂小测1.臭豆腐是中国传统美食。制作时，需要将豆腐浸入含有乳酸菌、芽孢杆菌等微生物的卤汁中发酵。为探究卤汁中细菌的种类和数量，某兴趣小组采用如图方法进行实验。下列说法正确的是(

)A.实验前，微生物培养的器皿、接种工具、操作者的手等应进行灭菌B.若用该方法培养了3组，菌落数分别为65、63、64，则可以推测每毫升卤汁中所含细菌数约为6.4×106个C.该方法测得的结果通常比实际值大D.若使用显微镜直接计数，统计结果通常比实际值大答案：D解析：消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物；灭菌则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物,操作者的手应进行消毒处理,A错误。该方法培养的3组培养基上的菌落均适合计数,故每毫升卤汁中