3.2.1基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章：基因工程3.2基因工程的基本

操作程序（一）基因工程的基本操作程序目录TABLEOFCONTENTS01目的基因的筛选与获取02基因表达载体的构建03将目的基因导入受体细胞04目的基因的检测与鉴定目的基因的筛选与获取01一

目的基因的筛选与获取一

1.目的基因在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。苏云金芽孢杆菌产生Bt基因伴胞晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)表达破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫导入抗虫棉培育棉花细胞1概念：2实例：主要是编码特定蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关基因一

目的基因的筛选与获取一

1.目的基因注意：不是所有的基因都编码蛋白质或肽链。（了解）基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。结构基因的功能：具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。转录基因的功能：只有转录功能，没有翻译功能。能转录形成tRNA和rRNA调控基因的功能：不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。Bt毒蛋白基因是从苏云金芽孢杆菌中分离出来的抗虫基因。当害虫食用含有转基因的植物时，Bt基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道，在消化酶的作用下，蛋白质能够降解成相对分子质量比解，最后造成害虫死亡。由于Bt毒蛋白对哺乳动物无毒害作用，因而广泛用于抗虫转基因植物。蛋白酶抑制剂基因广泛存在于植物中它生的抑制剂可与害虫消化道中的蛋白酶结合形复合物，从而阻断或降低蛋白酶的活性，使昆虫不能正常摄取、消化食物中的蛋白质。这种复合物还能刺激昆虫分泌过量的消化酶，引起害虫的厌食反应。淀粉酶抑制剂基因产生的粉酶抑制剂可以抑制昆虫消化道中的淀粉酶活性,使害虫不能消化所摄取的淀粉，从而阻断害虫的能量来源。植物凝集素基因控制植物合成一种糖蛋白糖蛋白可与昆虫肠道黏膜上的某种物质结而影响害虫对营养物质的吸收和利用。资料卡：可用于转基因植物的抗虫基因如何选择？一

目的基因的筛选与获取一

2.筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。P271.3发酵工程及其应用在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。一

目的基因的筛选与获取一

3.获取目的基因的方法测序技术序列数据库序列比对工具利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因DNA测序仪核苷酸序列比对氨基酸序列比对美国国家生物信息中心测定核酸和蛋白质序列以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。认识基因结构和功能的技术方法：一

目的基因的筛选与获取一

3.获取目的基因的方法前提：方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成DNA合成仪

蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成1人工合成目的基因2通过构建基因文库来获取目的基因3常用PCR特异性地快速扩增目的基因一

目的基因的筛选与获取一4.利用PCR获取和扩增目的基因PCR（polymerasechainreaction）聚合酶链式反应是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。DNA半保留复制。体外（PCR扩增仪/PCR仪）。对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。可以在短时间内大量扩增目的基因。原理：操作环境：目的：优点：模拟体内DNA复制过程一

目的基因的筛选与获取一4.利用PCR获取和扩增目的基因参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸体内DNA复制所需的基本条件解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物体外复制怎么改进？一

目的基因的筛选与获取一4.利用PCR获取和扩增目的基因参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸体内DNA复制所需的基本条件解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物体外复制怎么改进？体外用高温代替体外需用耐高温的DNA聚合酶引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20〜30个核苷酸。体外复制的引物一般为DNA单链。复制的原料实为dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同时水解产生能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP。一

目的基因的筛选与获取一4.利用PCR获取和扩增目的基因微量离心管缓冲液PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。DNA模板四种脱氧核苷酸(dNTP)引物分别与两条模板链结合的2种引物耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）一

目的基因的筛选与获取一4.利用PCR获取和扩增目的基因微量离心管缓冲液离心处理后一

目的基因的筛选与获取一4.利用PCR获取和扩增目的基因耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶作用下合成新DNA链。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，当长度相同，但G-C含量高，需更高温度。PCR反应过程：一

目的基因的筛选与获取一4.利用PCR获取和扩增目的基因905072℃延伸905072℃变性905072℃复性

由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）结果一

目的基因的筛选与获取一4.利用PCR获取和扩增目的基因PCR过程可以在PCR扩增仪中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。PCR扩增技术任务一图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：1．PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。不是完整的模板DNA分子；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。PCR扩增技术任务一2.图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’第3轮；1/4。PCR扩增技术任务一4．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，都不合理，请分别说明理由。第1组：

；第2组：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效3．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。PCR扩增技术任务一5．要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。6．如果循环n次，则共需消耗多少对引物？共需消耗2n－1对引物。非目标DNA数目目标DNA数目循环次数1234567246810121400282252114非目标DNA数目目标DNA数目循环次数1202403624885102261252714114n2n2n-2nPCR扩增技术任务一PCR中的数量关系小结复制次数123nDNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n含其中一种引物的DNA分子数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同时含两种引物的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的对数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1目标DNA分子数0＝21－20＝22－42＝23－62n－2n1．下列有关获取目的基因的方法，叙述错误的是()A．从基因文库中直接获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性B．如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以利用化学方法直接人工合成C．PCR技术的原理是DNA的半保留复制，需DNA连接酶催化DNA合成D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会2/2完成C2．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，不正确的是()A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C．体内DNA复制需要能量，PCR也需要能量D．二者遵循的碱基互补配对原则相同2/2完成B3．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()①从基因文库中获取目的基因②利用PCR扩增目的基因③逆转录④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①② B．②③C．③④ D．①③2/2完成B4．PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列叙述正确的是()A．双链DNA在高温下氢键和磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链B．温度降低后，单链DNA和引物结合的部分碱基序列相同C．以2条DNA单链为模板，以4种NTP为原料，经耐高温酶在高温下合成2个新的DNAD．设置PCR仪的温度进行反应可重复循环多次，DNA呈指数式扩增2/2完成D5、某研究小组利用PCR技术扩增一段目的基因，已知该目的基因片段长度为500bp，初始模板DNA分子数量为2个。若PCR反应共进行10