CN112166187B 治疗微小残留癌的方法 （西奈山伊坎医学院）

2020.11.25PCT/US2019/0240972019.03.26WO2019/191115EN2019.10.03JulioAAguirre-Ghiso.Ta本申请公开了治疗受试者中微小残留癌的方法。所述方法涉及使受试者中的扩散癌细胞其中所述接触在所述受试者的所述被接触的DCC残留癌。本申请还公开了涉及使受试者中的DCC所述受试者中的DCC以治疗所述受试者中的微小2;制复合物2亚单位增强子抑制剂或溴结构域抑制7.根据权利要求1所述的用途，其中所述接触通过向所述受试者施用所述PERK抑制剂其中所述BMP7衍生蛋白为如SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的14.根据权利要求1所述的用途，其中所述PERK抑制剂不抑制EIF2AK1、EIF2AK2或34[0001]本申请要求2018年3月26日提交的美国临时专利申请系列号62/648,166的优先[0002]本发明是在由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所授予的R01CA109182，U54UnfoldedProteinResponse:FromStressPathwaytoHomeostaticRegulation,”Science334:1081-1086(2011)andRon等,“SignalIntegrationIntheEndoplasmicReticulumUnfoldedProteinResponse,”Nat.Rev.Mol.CellBiol.8:519-529(2007))。引起的翻译负荷增加而对内质网和氧化条件产生需求做出应答的机制(Blais等,“ActivatingTranscriptionFactor4isTranslationallyRegulatedbyHypoxicStress,”Mol.Cell.Biol.24:7469-7482(2004)；Chevet等,“EndoplasmicReticulumStress-ActivatedCellReprogramminginOncogenesis,”CancerDiscov.5:586-597(2015)；Tameire等,“CellIntrinsicandExtrinsicActivatorsoftheUnfoldedProteinResponseinCancer:MechanismsandTargetsforTherapy,”Semin.CancerBiol.33:3-15(2015)；Hart等,“ERStress-MediatedAutophagyPromotesMyc-Martin-Perez等,“ActivatedERBB2/HER2LicensesSensitivitytoApoptosisUpon1766-1777(2014)；Rajasekhar等,“PostgenomicGlobalAnalysisofTranslationalControlInducedbyOncogenicSignaling,”Oncogene23:3248-3264(2004)；Rajasekhar等,“OncogenicRasandAktSignalingContributetoGlioblastomaFormationbyDifferentialRecruitmentofExistingmRNAstoPolysomes,”Mol.Cell12:889-901(2003)；Rojo等,“4E-BindingProtein1,ACellSignalingHallmarkinBreastCancerthatCorrelatesWithPathologicGradeandPrognosis,”Clin.CancerRes.13:81-89(2007)；andSequeira等,“InhibitionofeIF2alphaDephosphorylationInhibitsErbB2-InducedDeregulationofMammary的信号传导和翻译起始来提升ER客户蛋白的载量(Hart等,“ERStress-Mediated5AutophagyPromotesMyc-DependentTransformationandTumorGrowth,”J.Clin.Invest.122:4621-4634(2012)；Ozcan等,“LossoftheTuberousSclerosisComplexTumorSuppressorsTriggerstheUnfoldedProteinResponsetoRegulateInsulinSignalingandApoptosis,”Mol.Cell29:541-551(2008)；andTameire等,“CellIntrinsicandExtrinsicActivatorsoftheUnfoldedProteinResponseinCancer:MechanismsandTargetsforTherapy,”Semin.CancerBiol.33:3-15(2015))。已进一步显示PERK和IRE1α-XBP-1通路有助于适应缺氧和微环境应激(Bi等,“ERStress-RegulatedTranslationIncreasesTolerancetoExtremeHypoxiaandPromotesTumorGrowth,”EMBOJ.24:3470-3481(2005)；Blais等,“ActivatingTranscriptionFactor4isTranslationallyRegulatedbyHypoxicStress,”Mol.Cell.Biol.24:7469-7482(2004)；Chen等,“XBP1PromotesTriple-NegativeBreastCancerby“Xbox-BindingProtein1RegulatesAngiogenesisinHumanPancreaticResponseProtectsHumanTumorCellsDuringHypoxiaThroughRegulationofthe“ATF6alpha-Rheb-mTORSignalingPromotesSurvivalofDormantTumorCellsInPathwayisCriticalforTumourCellSurvivalandProliferationinResponsetoNutrientDeprivation,”EMBOJ.29:行适应。护乳腺上皮细胞(Avivar-Valderas等,“PERKIntegratesAutophagyandOxidativeStressResponsestoPromoteSurvivalDuringExtracellularMatrixDetachment,”路的快速活化关联(Avivar-Valderas等,“RegulationofAutophagyduringECM(41):4932-40(2013))的ATF4和CHOP转录程序(Avivar-Valderas等,“PERKIntegratesAutophagyandOxidativeStressResponsestoPromoteSurvivalDuring展示出了增强的PERK磷酸化和自噬(Avivar-Valderas等,“PERKIntegratesAutophagyandOxidativeStressResponsestoPromoteSurvivalDuringExtracellularPrecursorCellsPre-ExistinHumanBreastDCISandRequireAutophagyforSurvival,”PloSOne5:e10240(2010))，并且PERK在乳腺上皮中的条件性消除延迟了由HER2原癌基因引起的乳腺癌变(Bobrovnikova-Marjon等,“PERKPromotesCancerCell3881-3895(2004)andBobrovnikova-Marjon等,“PERK-DependentRegulationofLipogenesisDuringMouseMammaryGlandDevelopmentandAdipocyte6提升肿瘤细胞中的蛋白毒性水平，激活JNK和IRE信号传导并使HER2+癌细胞能够应对这种应激(Singh等,“HER2-mTORSignaling-DrivenBreastCancerCellsRequireER-(Cerami等,“ThecBioCancerGenomicsPortal:AnOpenPlatformforExploring有14％的HER2扩增的人乳腺肿瘤显示出P赖于PERK和/或其他UPR通路来存活[0006]休眠的(静息的)肿瘤细胞也被显示依赖于PERK和ATF6信号传导来存活(Ranganathan等,“DualFunctionofPancreaticEndoplasmicReticulumKinaseinTumorCellGrowthArrestandSurvival,”CancerRes.68:3260-3268(2008)；Ranganathan等,“FunctionalCouplingofp38-InducedUp-RegulationofBiPandActivationofRNA-DependentProteinKinase-LikeEndoplasmicReticulumKinaseandSchewe等,“ATF6alpha-Rheb-mTORSignalingPromotesSurvivalofDormantReticulumStressEngendersImmune-Resistant,LatentPancreaticCancer方面的方法可以被用来预防微小残留癌在所述受试者中发展成侵7图1B显示对细胞角蛋白、Ki67(增殖)和GADD34(ER应激)进行了染色的来自不同位置(淋巴非特异性条带。图2D显示了在48小时后，在不存在(-)或存在应激(低剂量毒胡萝卜内酯(thapsigargin)，Tg2nM)的情况下，MCF10A-HER2细胞中LY4的剂量-应答细胞活力曲线性中的总骨髓细胞(在两个下肢中)的作用。图2G显示了LY4对治疗2周的MMTV-HER2雌性中[0016]图3A-3G显示了在单个扩散的肿瘤细胞水平上，LY4PERK抑制降低了肺和骨髓中到。图3D显示了使用抗HER2抗体通过IHC染色检测的并每个肺切片/动物±s.d(n＝6)定量6)定量的孤立扩散肿瘤细胞(DTC)的图像和定量结果(右图)。比例尺，25μm。p由Mann-剂(DMSO)或LY4(2μM)处理孔。这些图显示在第8天以±s.d形式测得的活细胞百分比(n=8剂和LY4处理的动物中的单个宏转移的基准化面积(n＝21和15)。p由Mann-Whitney检验得的图像和图表示出了每个肺切片/动物的P-Rb+微转移的百分比(n＝4和6)。图4D的图像显亚群中PERK(EIF2AK3)被上调。使用cBioPortal分析TCGA乳腺癌数据中的HER2+病例(58个肿瘤)。图5B显示了全标本FVB正常乳腺与用赋形剂和LY4处理的MMTV-neu乳腺全标本比较的胭脂红染色代表性图像。图5C显示了组织学结构(从正常的空导管到DCIS样乳腺上皮内6A显示了来自赋形剂和LY4处理的动物的全标本乳腺胭脂红染色和H&E染色乳腺切片的代计显著性(p)。图6C显示了乳腺切片中上皮腔标志物细胞角蛋白8/18(CK8/18)和肌上皮标n=为用于测定来自赋形剂和LY4处理的动物的MMTV-neu肿瘤裂解物中P-PERK水平的蛋白质印LY4(2μM)处理孔10天。该图显示了每个腺泡(n＝20)中P组蛋白H3阳性细胞的百分比±9P-HER2阳性边缘与P-PERK和P-EIF2α的染色重叠。比例尺，100μm。图9B显示了来自MMTV-9C显示了在赋形剂和LY4处理的乳腺肿瘤中的代表性P-HER2和总HER2IHC染色。该图显示MCF10A-HER2细胞饥饿过夜，并进行+/-LY4(2μM)处理，然后在收集前加入+/-EGF(100ng/[0023]图10A-10C显示了MCF10A-HER2细胞中P-HER2水平的定量。图10A显示了用于定量乳腺肿瘤切片中P-HER2水平的评分系统。根据这些代表性图像中显示的确定分数，将IHC实验的示意图，该体内实验被设计为在MMTV-neu/HER2+小鼠模型中评估阿贝西尼(abemaciclib)和LY4的先后处理效果。MMTV-neu/11C的图显示了通过H&E染色检测并在5个肺切片/动物(n＝8)中定量的宏转移(>100个细测并在每个肺切片/动物中定量的微转移(2-100个细胞)的数量±s.d.(n＝8)。p由Matt-验得到。CDK4/6抑制剂阿贝西尼与LY4组合治疗黑素瘤细胞差异性地影响了2D和3D培养物中的体外将5,000个细胞接种在基质胶上。在图12D-12E中，WM35黑色素瘤细胞用阿贝西尼预处理5细胞接种在基质胶上。图12G表明，当用阿贝西尼诱导生长停滞时，细胞会上调PERK靶标[0026]图13A-13C证实了BMP7-F9对ERK/p38活性比以及与休眠特征基因相关的各种mRNA的效应。图13A显示了如通过蛋白质印迹法在HEp3HNSCC细胞中确定的，与对照相比，以[0027]图14A-14E显示了体外和体内BMP7-F9如何诱导T-HEp3细胞的生长停滞。图14A显示BMP7-F9对T-HEp3细胞的处理在体外将其增殖抑制了48小时，这通过细胞滴度蓝测定法[0028]图15A-15C显示了在疾病小鼠模型中对BMP7-F9处理的评估。图15A是用于评估疗受试者中微小残留癌的方法。该方法涉及使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与骨形态发生蛋白7(BMP7)衍生蛋白接触。使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与骨形态发生蛋白7(BMP7)衍[0032]在本领域中众所周知，肿瘤细胞可以以CTC和DTC的形式早期从原发性肿瘤扩献器官的罕见情况下，即使捐献者无疾病长达30年，接受者也发生了捐献者源性的转移(MacKie等,“FatalMelanomaTransferredinaDonatedKidney16Yearsafter[0033]对个体患者内的转移的肿瘤系统发生学和全基因组测序表明了原发性肿瘤向转移以及转移向转移的传播，这提供了证据证明连续性/线性生长模型不能解释个体患者中的后期(10年以上)复发(Gundem等,“TheEvolutionaryHistoryofLethalMetastaticProstateCancer,”Nature520:353-357(2015)andNaxerova等,“UsingTumourPhylogeneticstoIdentifytheRootsofMetastasisinHumans,”NatureRe“ReproducibleCopyNumberVariationPatternsAmongSingleCirculatingTumorGenomesInferredfromSingleCirculatingTumorCellsbyArray-CGHandNext-SequencingofCirculatingTumorCellsProvidesaWindowintoMetastatic[0035]此外，在人类中，CTC/DTC与原发癌的分期或大小无关(Krishnamurthy等,“DetectionofMinimalResidualDiseaseinBloodandBoneMarrowinEarlyStageBreastCancer,”Cancer116(14):3330-3337(2010),其全部内容通过引用并入本被证明可预测乳腺癌和前列腺癌中的转移和复发(Braun等,MarrowMicrometastasisinBreastCancer,”NEJM353:793-802(2005)；Hayes等,“CirculatingTumorCellsatEachFollow-upTimePointDuringTherapyofMetastaticBreastCancerPatientsPredictProgression-FreeandOverallTumorCellsPredictSurvivalBenefitfromTreatmentinMetastaticCastration-可以在肿瘤切除后数年发展出转移灶，因此认为休眠的DCC可能是导致癌症晚期复发的主在这类休眠中内在和/或外在机制驱使单个DCC或DCC小群体进入静息(可逆的生长停滞)。述癌细胞正在经历暂时的有丝分裂/生长停滞或衰等,“CombinedGenomeandTranscrCellsfromBoneMarrowofProstateCancerPatientsRevealsUnexpected[0039]本文所述的方法可以进一步涉及在所述接触之前检测所述受试者中的DCC的存(Sosa等,“MechanismsofD[0042]已经在术前13-72％的前列腺癌患者和术后5年以上20-57％的无疾病证据患者的骨髓中鉴定出了DTC(Morgan等,“DisseminatedTumorCellsinProstateCancerPatientsafterRadicalProstatectomyandwithoutEvidenceofDiseasePredictsBiochemicalRecurrence,”Clin.CancerRes.15:677-683(2009)andWeckermann等,“PerioperativeActivationofDisseminatedTumorCellsinBoneMarrowof淋巴瘤和黑色素瘤中很常见(Lam等,“TheRoleoftheMicroenvironment–DormantProstateDisseminatedTumorCellsintheBoneMarrow,”DrugDiscov.TodayBreastCancer,”Ecancermedicalscience7:320(2013)；Ellis等,“DetectionandIsolationofProstateCancerCellsfromPeripheralBloodandBoneMarrow,”Urology61:277-281(2003)；Morgan等,“DisseminatedTumorCellsinProstateCancerPatientsafterRadicalProstatectomyandwithoutEvidenceofDiseasePredictsBiochemicalRecurrence,”Clin.CancerRes.15:677-683(2009)；andPfitzenmaier等,“TelomeraseActivityinDisseminatedProstateCancerCells,”[0048]在实施本文描述的方法过程中，使受试者中的DCC接触以诱导或维持DCC的休这意味着在DCC中建立持续的非增殖状态或在DCC中继体2(HER2)的状态。HER2和基底样基团是在激素受体阴性乳腺癌中鉴定出的主要分子亚型(Schnitt,“ClassificationandPrognosisofInvasiveBreastCancer:FromMorphologytoMolecularTaxonomy,”ModernPathology23:S60-S64(2010),其全导前列腺癌干细胞样细胞的衰退(Kobayashi等,“BoneMorphogeneticProtein7inDormancyandMetastasisofProstateCancerStem-LikeCellsinBone,”[0055]人BMP7蛋白是TGF-β超家族中的一种分泌信号分子，最初因其能够诱导骨形成而[0063]人BMP7蛋白的合适变体选自下组：F93V/N110G；Y65G/I86L/T89A/N110G；Y65G/I86L/N110G/Y128F；Y65G/I86L/N110G/Y128W；Y65G/I86L/F93V/N110G/Y128W(BMP7-F9)；[0073]用于本文描述的方法的合适的BMP7衍生物蛋白包括人前体-BMP7的变体(即SEQ[0077]对于本文所述的功能测定法，用特定的前-BMP7蛋白或其变体治疗或者施用是指用特定的成熟BMP7的同型二聚体治疗或者施用，所述特定的成熟BMP7即野生型或其变体，所述同型二聚体通常与野生型人前-结构域处于非共价复合物的[0079]BMP7对受试者的作用可能取决于BMP受体2(BMPR2)，其表达已显示与前列腺癌患者的复发和骨转移呈负相关(Kobayashi等,“BoneMorphogeneticProtein7inDormancyandMetastasisofProstateCancerStem-LikeCellsinBone,”[0084]在一些实施方案中，所述化学治疗剂为选自曲妥珠单抗和拉帕替尼拉帕替尼是一种靶向表皮生长因子受体(EGFR)和HER2的酪氨酸激酶抑制剂。包括PD-1抑制剂(例如派姆单抗(Pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab))、PD-L1抑制剂侵害的细胞因子家族。IFN可以产生于并作用于肿瘤细胞和免疫细胞。I型IFN包括IFNα蛋InterferonsintheTreatmentofSolidTumors,”CancerTreat.Res.126:207–241酸酯、丙戊酸、伏立诺他(vorinostat)、贝利诺司他(belinostat)、LAQ824、帕比司他ProteinInhibitorsasaPotentialNewTherapyinCentralNervousSystem[0095]DCC/DTC微环境在增强休眠中起关键作用。核受体亚家族2F组成员1(NR2F1)是核应用于雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌患者的基因表达谱时，已显示该特征能预测更长的无转移期(Kim等,“DormancySignaturesandMetastasisinEstrogenReceptor用并入本文)。还在已经无症状7-18年的前列腺癌患者的休眠DTC中发现了这种休眠特征(Sosa等,“NR2F1ControlsTumourCellDormancyviaSOX9-andRARbeta-DrivenofSingleDisseminatedProstateCancerCellsRevealsTumorCellHeterogeneity[0096]在头颈部鳞癌细胞(HNSCC)患者源性异种移植(PDX)模型中，已显示NR2F1能在进EmergingAntimetastasisTherapeuticAlternatives,”Mol.Cell.Oncol.3(1):通过调节染色质重编程来限制诱导的多能干细胞(iPS)的重编程(Onder等,“ChromatinModifyingEnzymesasModulatorsofReprogramming,”Nature483(7391):598-602状态(Sosa等,“NR2F1ControlsTumourCellDorma强调了存在由NR2F1和微环境线索调控的精心设计的表观遗传程序，导致了肿瘤细胞的休[0097]已经显示DCC能表达高水平的PERK通路活化(Bragado等,“Microenvironments等,“RegulationofTumorCellDormancybyTissueMicroenvironmentsand(6):2889-92(2006)；andSchewe等,“ATF6alpha-Rheb-mTORSignalingPromotes其中所述接触根除所述受试者中的DCC以治疗所述受试者中映异构体和其他立体异构形式。每个手性中心可以根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-。[0123]包合物在Remington,TheScienceandP[0129]在一些实施方案中，与不抑制EIF2AK1、EIF2AK2或EIF2AK4的PERK抑制剂进行接RDEA119/BAY869766(参见，例如，Iverson等,“RDEA119/BAY869766:APotent,Selective,AllostericInhibitorofMEK1/2fortheTreatmentofCancer,”Cancer疗有效量是指能有效治疗所述受试者的所述病症和/或疾病的化合物的量。这样的量通常[0138]施用通常涉及施用药学上可接受的剂型，其是指本文所述化合物的剂型并且包剂。技术和配方通常可以在Remington’sPharmaceuticalSciences,MackPublishing[0139]在实施本公开所述的治疗方法中，所述药物(即，本公开所述的BMP7衍生蛋白和PERK抑制剂)可以任何合适的量包含在任何合适的运载体物质中。药物可以以占组合物总[0140]根据本公开所述的药物组合物可以被配制成在施用后立即或在施用后的任何预[0141]控释制剂包括(i)在很长的时间段内在体内产生基本恒定浓度的药物的制剂；(ii)在预定的滞后时间后，在很长的时间段内在体内产生基本恒定浓度的药物的制剂；(iii)通过在体内维持相对恒定的有效药物水平并同时使与所述活性药物物质[0142]在以下情形下优选以控释制剂形式进行给药：其中药物具有(i)狭窄的治疗指数(即导致有害副作用或毒性反应的血浆浓度与导致产生治疗效应的血浆浓度药物之间的差异很小；通常，治疗指数(TI)定义为是中值致死剂量(LD50)与中值有效剂量(ED50)的比述药物组合物在施用后会以受控方式释放所述药物(单个或多个单位片剂或胶囊组合物、[0149]适用于注射用途的药物形式包括无菌的水溶液或分散液和用于临时制备无菌注[0151]在一个实施方案中，施用可使受试者中可检测的休眠DCC的量提升至少约1％、者中的扩散癌细胞(DCC)与选自LY2、LY3和LY4的蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)抑制剂[0159]在另一个实施方案中，所述受试者已经被诊断出患有扩散肿瘤细胞和/或非转移[0161]当将化学治疗剂施用于所述受试者时，所述化学治疗剂可以是选自曲妥珠单抗[0165]在一个实施方案中，所述方法还涉及在所述接触之前检测所述受试者中DTC的存[0166]所述方法可以进一步涉及使所述受试者中的DCC/DTC与BMP7衍生蛋白接触。在一个实施方案中，通过向所述受试者施用所述BMP7衍生物蛋白来使所述受试者中的DCC/DTC中的扩散癌细胞(DCC)与选自LY2、LY3和LY4的蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)抑制剂接转染H2B-Dendra2质粒产生ZR75.1-MonomericGreen-to-RedPhotoactivatableFluorescentProteinInducedbyBlue养，将MCF10A-HER2、SKBR3和ZR75.1-H2B-Dendra2细胞铺板于生长因子降低的基质胶ofAutophagyduringECMDetachmentisLinkedtoaSelectiveInhibitionof[0180]小鼠、肿瘤生长和组织处理：FVB/N-Tg(MMTVneu)小鼠品系获自杰克逊实验室并在石蜡包埋之前在10％的福尔马林缓冲液中固定过夜。用26G针冲洗来自两个下肢的骨[0181]乳腺全标本染色：将固定在10％缓冲福尔马林中的乳腺在胭脂红明矾染液(胭脂[0182]IHC和IF：如先前所述进行石蜡包埋切片的IHC和IF(Avivar-Valderas等,“RegulationofAutophagyduringECMDetachmentisLinkedtoaSelectiveEDTA缓冲液(1mM，pH8)或Tris/EDTA(pH9)中进行热诱导的抗原修复。将玻片在0.1%对于IHC，在第一抗体孵育之前，进行了内源性过氧化物酶和抗生物素蛋白/生物素淬灭的附加步骤。使用的第一抗体为抗-细胞角蛋白8/1ActivationandeIF2alphaSerine51PhosphorylationtoPromoteSurvivalUnderStress,”Mol.CancerRes.13:1377-1388(2015),其全部内容通过引用并入本文)，P-EIF2A，切割的Caspase3，P-H3(SMA)，P-Rb(S249/T252)(SantaCruz,Dallas,TX)，HER2(Abcam,Cambridge,MA)，HER2 剂盒(VectorLaboratories,Bulingame,CA)对切片进行处理，并将DAB底物试剂盒用于过氧化物酶标记(VectorLaboratories)，然后将切片固定在VectaMount介质(VectorLaboratories)中。对于IF，将切片固定在ProLongGoldAntifade水性介质(Thermo[0183]在免疫细胞荧光的情况下，通过在多制备载玻片上以500rpm进行细胞离心3分钟[0184]在图10A中解释了对P-HER2水平的评分。对于乳腺导管中的CK8[0185]显微观察：通过使用NikonEclipseTS100显微镜、LeicaDM5500或共焦Leica[0186]TUNEL原位细胞死亡检测：使用原位细胞死亡检测试剂盒AP(Roche，Basel，羊血清中封闭1小时。然后加入TUNEL反应混合物，并在37℃下放1小时。通过与缓冲液I下孵育30分钟。在Tris缓冲盐水(TBS)中洗涤3次后，将载玻片在碱性(Ranganathan等,“FunctionalCouplingofp38-InducedUp-RegulationofBiPandActivationofRNA-DependentProteinKinase-LikeEndoplasmicReticulumKinase其全部内容通过引用并入本文)。使用以下其他抗体对膜进行印迹：P-PERK(T982)(Tenkerian等,“mTORC2BalancesAKTActivationandeIF2alphaSerine51PhosphorylationtoPromoteSurvivalUnderStress,”Mol.CancerRes.收集前将MCF10A-HER2细胞铺板于低粘附力平板中细胞进行血清和EGF饥饿并进行24小时的+/-LY4处理，然后再用+/-EGF(100ng/ml)刺激DTT(50mM)的SDS样品缓冲液孵育来释放结合的蛋白。对于内吞作用测定(Cihil等,“TheCell-BasedL-GlutathioneProtectionAssaystoStudyEndocytosisandRecyclingofPlasmaMembraneProteins,”J.Vis.Exp.e 酶消化成单细胞悬液。将来自MMTV-neu15-然后重悬于FACS缓冲液中。然后将细胞用抗-HER2-PE，抗-CD45-APC和DAPI染色，并使用BDFACSAria分选仪分选HER2+/CD45-细胞群。将分选的细胞以312,500个细胞/ml的浓度重悬于培养基中，然后将80μl与20μl悬浮剂(C1Fluidigm)混合。使用C1单细胞Preamp10-17μm进行单细胞分离。使用Ambion的单细胞至CTqRT-PCR试剂盒和20xTaqMan基因表达FAM-MGB测定法进行预扩增。将所得cDNA在C1DNA稀释剂1/3中进一步稀释，并使用96.96IFC(Fluidigm)、JunoSystem控制器和用于高通量qPCR的BiomarkHD进行基因表达分析。使用TaqMan快速高级预混液进行qPCR反应。使用Fluidigm实时PCR分析软件和Clustergrammer基于Web的工具进行分析(Fernandez等,“Clustergrammer,AWeb-BasedHeatmapVisualizationandAnalysisToolforHigh-DimensionalBiological[0190]生化测定：重组的人EIF2AK3(PERK)催化结构域(氨基酸536-1116；目录号PV5107)、GFP-eIF2α(目录号PV4809)底物和Terbium标记的磷酸化eIF2α抗体(目录号结构域(氨基酸584-1019)。在不存在2nM加入铽标记的磷酸化eIF2α抗体，并孵育90分钟。在EnvisonQMultilabel读板仪(PerkinElmer,Waltham,MA)中监控产生的荧光。从拟合的抑制曲线确定TR-FRET比率和得[0191]基于细胞的TR-FRET测定法：简而言之，将表达GFP-eIF2α的GripTiteTM293细胞制剂(Sigma目录号P8340)、磷酸酶抑制剂(Sigma目录号P2850)和2nM铽标记的抗-磷酸化eIF2抗体(Invitrogen目录号PM4312I)组成的缓冲液中裂解细胞。将细胞裂解物在室温下诱导ER应激，并将板在37℃下孵育6小时。然后吸出培养基，并将细胞在被动裂解缓冲液(PromegaCat#E194A)中在平板振荡器上裂解5分钟。使用萤光素酶测定试剂(Promega况下，监测Hela、HT‑1080和Bx‑PC‑3细胞在96孔板中的生长。使用CellTiter‑试剂Prism软件用Mann‑Whitney[0196]已经显示，PERK通路的激活是UPR诱导的与休眠表型相关的生长停滞和存活的关键效应子(Brewer等,“PERKMediatesCell‑CycleExitDuringtheMammalianUnfoldedProteinResponse,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:12625‑30(2000)；Ranganathan等,“DualFunctionofPancreaticEndoplasmicReticulumKinaseinTumorCellGrowthArrestandSurvival,”CancerRes.68:3260‑3268(2008)；andRanganathan等,“FunctionalCouplingofp38‑InducedUp‑RegulationofBiPandActivationofRNA‑DependentProteinKinase‑LikeEndoplasmicReticulumKinaseNeuProtooncogeneintheMammaryEpitheliumofTransgenicMiceInduces(2008)；Harper等,“MechanismofEarlyDisseminationandMetastasisinHer2+MammaryCancer,”Nature540:588‑592(2016)；Hosseini等,“EarlyDisseminationSeedsMetastasisinBreastCancer,”Nature540:552‑558(2016),这些文献中的全部内容均通过引用并入本文)。休眠DCC展示出E‑钙粘蛋白的损失和Twist1的表达(Harper等,“MechanismofEarlyDisseminationandMetastasisinHer2+MammaryCancer,”蛋白阴性DCC也被证明是静息的，并展示出CHOP(PERK诱导的基因)的上调(Pommier等,“UnresolvedEndoplasmicReticulumStressEngendersImmune‑Resistant,LatentPancreaticCancerMetastases,”Science360(6394):eaao4908(2018),其全部内容通过引用并入本文)。为了评估MMTV‑HER2自发转移模型中是否存在PERK通路活化水平与细胞周期停滞之间的这种相同的相关性，使用了两种不同的方法–使用免疫荧光(IF)的高分辨率成像和DCC和转移的单细胞分辨率的基因表达分析。进行了携带大肿瘤并因此携带休眠和增生DCC的动物的MMTV‑HER2肺组织切片的IF(Harper等,“MechanismofEarlyDisseminationandMetastasisinHer2+MammaryCancer,”Nature540:588‑592增殖的标志物)和GADD34(或PPP1r15A)呈阳性的DCC。GADD34是PERK诱导的应激基因，负责从翻译抑制(归因于eIF2α的磷酸化)到应激诱导的基因表达的程序化转变(Novoa等,“Stress‑InducedGeneExpressionRequiresProgrammedRecoveryfrom图像分析显示，HER2+转移性病变或具有低增殖指数(ki67low)的DCC表现出了高水平的ER应分析证实了小鼠模型中的发现，并且证实GADD34可能有助于鉴定转移部位中的UPR高/静息[0202]通过对MMTV-HER2小鼠肺中的DCC、微转移和宏转移进行单细胞靶向基因表达分肺处理成单细胞悬浮液，并分选HER2+/CD45-细胞(图2A)。然后如图2A所示，使用C1个单个DCC和90个原发性肿瘤细胞及其相应库进行高置信度(对HER2+单细胞进行IF和分子活剂和抑制剂)以及休眠基因的表达(Kim等,“DormancyEstrogenReceptorPositiveandNegativeBreastCancer,”PloSOne7:e35569(2012),其全部内容通过引用并入本文；B’chir等,“TheeIF2α/ATF4Pathwayis7683-99(2013)；Harper等,“MechanismofEarlyDisseminationandMetastasisinHer2+MammaryCancer,”Nature540:588-592(2016),所述文献的每一个的全部内容通过组，约占DTC的19％)，这些细胞显示出所有测试的ER应激基因(包括PERK本身)(带有Fam123b-Ddit3的框)随细胞增殖阴性调节剂如Rb1和TP53以及CDK抑制剂p21、p27、p16和p15(包括Cdkn2a-Rb1的框)一起强烈上调(图1C)。在这些细胞中也观察到了诸如NR2F1、SignaturesandMetastasisinEstrogenReceptorPositiveandNegativeBreast抑制剂和休眠基因，表明这些基因可能代表细胞从休眠中迁移出来或处于慢循环模式中。总体上，约40％的DCC与细胞周期抑制剂或休眠基因同时显示出高至中等水平的ER应激基因表达。这在使用磷酸化组蛋白H3和磷酸化Rb检测方法在进展性MMTV-HER2动物中检测到的休眠DCC的百分比范围内(Harper等,“MechanismofEarlyDisseminationandMetastasisinHer2+MammaryCancer,”Nature540:588-592(2016),其全部内容通过引具有PERK通路基因的显著激活表达的奇特[0204]以上实施例的结果促使了对选择性PERK抑制剂对休眠DCC命运和转移形成的作用Suppressor:GeneDoseDeterminesTumor-SuppressiveVersusTumorPromotingInhibitorSelectedforPreclinicalDevelopment,”ACSMed.Chem.Lett.4:964-968(2013),其全部内容通过引用并入本文)；在表达HER2的MCF10A细胞中有效降低了P-PERK下LY4仅将456种激酶中的20种激酶抑制了>50与之相比GSK2656157将80种激酶抑制了>50或者LY4仅将8种激酶抑制了>60与之相比GSK2656157将58种激酶抑制了>60％。这些次要靶标均不是其他任何已知的eIF2α激酶，即EIFPKR)和EIF2AK4(也称为GCN2)(表[0213]fAtkins等,“CharacterizationofaNovelPERKKinaseInhibitorwith[0217]bAtkins等,“CharacterizationofaNovelPERKKinaseInhibitorwith[0218]用媒介物或LY4(50mpk)每日腹膜内注射治疗24-32周龄的单胎MMTV-HER2雌性小体重无明显变化，这与最近的表明对血糖水平或胰脏功能没有效应的研究一致(Pytel等,“PERKIsaHaploinsufficientTumorSuppressor:GeneDoseDeterminesTumor-SuppressiveVersusTumorPromotingPropertiesofPERKinMelanoma,”PLoS有效应表示该抑制剂对骨髓细胞稳态或外周血白细胞没有显著效应(图2F)。[0219]PERK的抑制导致乳腺导管和胰腺组织中的P-PERK和P-eIF2α水平显著降低(尽管水平(Yu等,“TypeIInterferonsMediatePancreaticToxicitiesofPERK[0220]高百分比的MMTV-HER2动物发展成向肺转移，这可以在进展的早期开始(Guy等,“ExpressionoftheNeuProtooncogeneintheMammaryEpitheliumofTransgenicinHer2+MammaryCancer,”Nature540:588-592(2016),Hosseini等,“EarlyDisseminationSeedsMetastasisinBreastCancer,”Nature540:552-558(2016)；Linde等,“MacrophagesOrchestrateBreastCancerEarlyDisseminationand[0221]因此，在具有小和/或明显大肿瘤的动物中监测了LY4PERK抑制剂对转移性疾病在血液样品中检测HER2+循环肿瘤细胞(CTC)显示在媒介物和LY4治疗的动物之间没有显著先前研究的测量结果(Harper等,“MechanismofEarlyDisseminationandMetastasis有意义的是，LY4大大减少了通常与肺部血管相关的非增殖性(P-Rb阴性)单个DCC的数量，于休眠状态(Bragado等,“TGF-Beta2DictatesDisseminatedTumourCellFateinTargetOrgansThroughTGF-Beta-RIIIandP38Alpha/BetaSignalling,”DisseminationandMetastasisinHer2+MammaryCancer,”Nature540:588-592选择性地靶向能显示活跃的PERK和UPR信号传导的非增殖性休眠养物中对这种生物学进行了建模。将稳定表达与组蛋白H2B融合的可光转换荧光蛋白(Dendra2)的人ZR75.1HE息细胞中的周转缓慢(Wilson等,“HematopoieticStemCellsReversiblySwitchFromDormancytoSelf-RenewalDuringHomeostasisandRepair,”Cell135:1118-1129白从绿色变为红色荧光，变成绿色和红色的双阳性；变回绿色的细胞已经进行了分裂并稀释了H2B-DENDRA2-RED分子，而静息的细胞则保持H2B-DENDRA2GREEN和RED(Gurskaya等,“EngineeringofaMonomericGreen-to-RedPhotoactivatableFluorescentProteinInducedbyBlueLight,”Nat.Bi本文)。将以高密度(簇)接种在3DMatrigel基质中以模拟宏转移的细胞或以低密度(单细胞)接种在3DMatrigel基质中以模拟单个DCC的细胞进行光转化(100％)(图4D)。八天后，只有35％的高密度细胞为H2B-DENDRA2-RED阳性。相反，65％的低密度ZR75.1HER2+细胞为H2B-DENDRA2-RED阳性(图4E)，模仿了孤立DCC的静息状态(Bragado等,“TGF-Beta2DictatesDisseminatedTumourCellFateinTargetOrgansThroughTGF-Beta-RIIIandP38Alpha/BetaSignalling,”Na引用并入本文)。用PERK抑制剂LY4处理对以高密度接种的ZR75.1HER2+的活力没有显著效些数据表明，孤立的肿瘤细胞环境中的固有的和/或ECM依赖性的信号引发了对PERK信号传移。在MMTV-HER2模型中，发现HER2驱动的进展在遗传上依赖于PERK激酶(Bobrovnikova-Marjon等,“PERK-DependentRegulationofLipogeneDevelopmentandAdipocyteDiff16314-16319(2008),其全部内容通过引用并入本文)，并且HER2+肿瘤已显示对蛋白毒性敏感并依赖于ERAD(Singh等,“HER2-mTORSignaling-DrivenBreastCancerCellsRequireER-AssociatedDegradationtoSurvive,”Sci.Signal.8内容通过引用并入本文)。此外，cBIO数据库(Cerami等,“ThecBioCancerGenomicsPortal:AnOpenPlatformforExploringMultidimensionalCancerGenomicsData,”CancerDiscovery2:401-404(2012),其全部内容通过引用并入本文)分析显示约14％的变中HER2诱导的乳腺肿瘤进展，在该病变中可以剖析从增生性乳腺到DCIS和浸润性癌的不同进展阶段(Lu等,“MechanismofInhibitionofMMTV-neuandMMTV-wnt1InducedMammaryOncogenesisbyRARalphaagonistAM580,”Oncogene29(25):3665-76(2010)；Mulleret.al.,“Single-StepInductionofMammaryAdenocarcinomainTransgenic“MechanismofEarlyDisseminationandMetastasisinHer2+MammaryCancer,”[0225]对24周龄的单胎雌性乳腺的分析表明，经媒介物治疗的MMTV-HER2动物表现出具18表达的不均匀水平评估发现，对照HER2+动物中的增生性病变显示出不同程度的导管腔行检测，阳性)在MMTV-HER2小鼠中的经媒介物治疗的增生中分布不均。相反，LY4治疗的MMTV-HER2动物表现出在腔层(其通常围绕空导管腔)和肌上皮细胞的外部连续层中细胞角仍处于完全的细胞停滞状态(定义为在两周内肿瘤体积仅翻倍一次，LY4治疗组中为43%,[0227]在Matrigel中用LY4处理具有HER2过表达的人癌细胞(MCF10A-HER2或ZR75.1)或的增殖水平的显著变化(图7F)。结论是，早期的[0229]由于HER2+肿瘤对蛋白毒性敏感(Singh等,“HER2-mTORSignaling-DrivenBreastCancerCellsRequireER-AssociatedDegradationtoSurvive,”会由于ER客户蛋白负荷的增加而影响最佳HER2活性。在肿瘤中检测残基Y1221/1222处的HER2磷酸化显示，其他人报道的P-HER2阳性区域(DiGiovanna等,“ActiveSignalingby10A)，发现LY4治疗的肿瘤显示出比对照动物显著更低水平的P-HER2(图9C)。HER2信号与EGFR和HER3形成同型二聚体或异型二聚体进行信号传导(MoasserMM,“TheOncogeneHER2:ItsSignalingandTransformingFunctionsanditsRoleinHumanCancerPathogenesis,”Oncogene26(45):6469-87(2007)andNegr未观察到对总HER2水平或与EGFR的异二聚化有明显的效应。由于LY4对HER家族成员AKT或S6激酶中的任一个的活性位点没有直接抑制作用(表8)，所以这种效应应该归因于PERK抑后保留在质膜上(Hommelgaard等,“AssociationwithMembraneProtrusionsMakesErbB2anInternalization-ResistantReceptor,”MolBiolCell.15(4):1557-67试LY4是否会干扰HER2受体的激活机制，进行了表面生物素化测定以测量细胞表面上受体的存在，并通过可逆性表面生物素化来测定受体的内吞作用(Cihil等,“TheCell-BasedL-GlutathioneProtectionAssaystoStudyEndocytosisandRecyclingofPlasma的磷酸化HER2和总HER2的增加(图9F)。该数据以及Singh等人的“HER2-mTORSignaling-DrivenBreastCancerCellsRequireER-AssociatedDegradationtoSurvive,”当的UPR功能通过影响最佳的受体定位和激活来维持适当的HER2下游信号否可用于使休眠诱导的癌细胞呈UPR高并对LY4敏感。该设想得到了以下发现瘤切片中GADD34+细胞的显著增加(水平(对照)。原发性肿瘤中的测量值可用作由阿贝西尼引起的与静息相关的UPR的替代生物标志物。如所预期的，用LY4治疗消除了在治疗的动物原发性肿瘤中GADD34的表达(图11B)。先后用阿贝西尼(休眠样诱导期)和LY4(休眠DCC根除期)依次治疗小鼠导致了与用组合是一种有希望的治疗策略，可通过靶向能重新激活和植下这些病变的静息DCC来预防[0236]在HER2+乳腺癌模型中的多项研究得出结论，认为HER2+乳腺癌的PERK信号传导得以存活和适应(Bobrovnikova-Marjon等,“PERKPromotesCancerCellProliferationandTumorGrowthbyLimitingOxidativeDNADamage,”Oncogene29(27):3881-95(2010)；Singh等,“HER2-mTORSignaling-DrivenValderas等,“PERKIntegratesAutophagyandOxidativeStressResponsestoPromoteSurvivalDuringExtracellularMatrixDetachment,”Mol.Cell.Biol.31:3616-3629(2011)；andAvivar-Valderas等,“RegulationofAutophagyDuringECM在于手术边缘中的以及以靶器官中休眠扩散癌细胞形式存在的静息肿瘤细胞(Bragado等,“TGF-Beta2DictatesDisseminatedTumourCellFateinTargetOrgansThroughTGF-Beta-RIIIandP38Alpha/BetaSignalling,”Nat.Cell.BiChéry等,“CharacterizationofSingleDisseminatedProstateCancerCellsRevealsTumorCellHeterogeneityandIdentifiesDormancyAssociatedCancerCellDormancy:AnAwakeningField,Sosa等,“NR2F1ControlsTumourCellDormancyViaSOX9-andRARbeta-Driven并入本文)，激活了PERK信号传导，从而伴随其他ER应激通路存活(Adomako等,“IdentificationofMarkersthatFunctionallyDefineaQuiescentMultipleMyelomaCellSub-PopulationSurvivingBortezomibTreatment,”BMCCancer1(2015)；Ranganathan等,“DualFunctionofPancreaticEndoplasmicReticulumKinaseinTumorCellGrowthArrestandSurvival,”CancerRes.68:3260-3268andActivationofRNA-DependentProteinKinase-LikeEndoplasmicReticulumandEliminatesQuiescentMultipleMyelomaCellsSurvivingProteasomeInhibitorTherapy,”CancerRes.69:1545‑1552(2009)；andChéry等,“CharacterizationofSingleDisseminatedProstateCancerCellsRevealsTumorCellHeterogeneityandIdentifiesDormancyAssociatedPathways,”Oncotarget5“UnresolvedEndoplasmicReticulumStressEngendersImmune‑Resistant,Latent引用并入本文)通过显示存在于肝脏(和其他模型)中的胰腺DCC会在静息态时激活UPR，从而验证了这项工作。于明显的肿瘤探及之前(Husemann等,“SystemicSpreadIsanEarlyStepinBreastCancer,”CancerCell13:58‑68(2008)；Pavlidis等,“CancerofUnknownPrimaryDisseminationandMetastasisinHer2+MammaryCancer,”Nature540:588‑592(2016)；andHosseini等,“EarlyDisseminationSeedsMetastasisinBreast所有转移：早期转移(在确证肿瘤明显之前)或与确证的原发性肿瘤生长同时发生的转移 细胞多重qPCR揭示，这些DCC显示出GADD34(蛋白质)和大量的ER应激基因(包括PERK本身)因(如ATF4和GADD34)的优先翻译(Young等,“UpstreamOpenReadingFramesDifferentiallyRegulateGeneSpecificTranslationintheIntegratedStress地，已证明UPR诱导的G1阻滞是通过抑制细胞周期蛋白D1的翻译引起的(Brewer等,“MammalianUnfoldedProtein入本文)。使用人HER2+癌细胞系的3D器官发生实验证实了LY4对静息单癌细胞的选择性杀的人转移细胞亚群也显示GADD34和Ki67之间呈负相关，验证了在小鼠中发现的相关性。这些数据表明，与NR2F1一起时(Borgen等,“NR2F1StratifiesDormantDisseminated全部内容通过引用并入本文)，GADD34在单独时或与NR2F1联合使用时可充当休眠/UPR高动机制逃避抗增殖疗法(Aguirre-Ghiso等,“MetastasisAwakening:TargetingDormantCancer,”Nat.Med.19:276-277(2013)；Naumov等,“IneffecTreatmentonSolitaryDormantMammaryCarcinomaCellsorLate-DevelopingPromotesHeterogeneityandDrugResistanceinSquamousCellCarcinoma,”Cell160:963-976(2015)；andFluegen等,“PhenotypicHeterogeneityofDisseminatedTumourCellsisPresetbyPrimaryTumourHypoxicMicroenvironments,”Nat.CellBiol.19(2):120-132(201根除(其中这些细胞通常也处于休眠状态)，(Bragado等,“TGF-Beta2DictatesDisseminatedTumourCellFateinTargetOrgansThroughTGF-Beta-RIIIandP38Alpha/BetaSignalling,”Nat.Cell.Biol.15:1351-1361(2013)；Chéry等,“CharacterizationofSingleDisseminatedProstateCancerCellsRevealsTumorCellHeterogeneityandIdentifiesDormancyAssociatedPathways,”Oncotarget5通过引用整体并入本文)，进一步强调了这样的概念：PERK抑制是一种抗休眠DCC的疗法276-277(2013),其全部内容通过引用并入本文)，其可用于辅助剂设置中以消除休小残留疾病(Aguirre-Ghiso等,“MetastasisAwakening:TargetingDormantCancer,”应性降低(Singh等,“HER2-mTORSignaling-DrivenBreastCancerCellsRequir的内吞作用可以通过物理上降低细胞表面受体的浓度来减少许多质膜定位受体的信号输出(SorkinandZastrow,“EndocytosisandSignaling:IntertwiningMolecu