番茄microRNA及其靶基因对病毒侵染的响应机制与调控网络解析

番茄microRNA及其靶基因对病毒侵染的响应机制与调控网络解析一、引言1.1研究背景1.1.1番茄产业地位与病毒危害番茄（Solanumlycopersicum）作为全球范围内广泛种植的重要蔬菜作物，在农业经济和人们的日常生活中占据着举足轻重的地位。FAO数据显示，2023年全球番茄产量高达1.86亿吨，种植面积约为500万公顷，其在蔬菜市场供应、食品加工产业以及国际贸易中均扮演着关键角色，为众多国家和地区的农业经济增长提供了重要支撑。然而，番茄在生长过程中极易受到多种病毒的侵袭，病毒病已成为制约番茄产业可持续发展的关键因素之一。常见的番茄病毒种类繁多，其中番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）可导致番茄植株矮化，叶片黄化、卷曲，果实发育不良，严重时减产可达80%-100%；黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）能使番茄叶片出现花叶、畸形，植株生长受阻，果实品质下降，产量损失通常在30%-50%；烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）侵染番茄后，会造成叶片出现斑驳、坏死等症状，影响光合作用，致使产量降低20%-40%。这些病毒不仅严重降低了番茄的产量，还显著影响了其果实的品质，如果实大小不均、色泽不佳、口感变差等，从而降低了番茄在市场上的商品价值，给番茄种植户和相关产业带来了巨大的经济损失。1.1.2microRNA概述microRNA（miRNA）是一类长度约为21-24个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中。其前体具有典型的茎环结构，在Dicer酶等一系列酶的作用下，经过精确的加工过程，从初级转录本（pri-miRNA）逐步切割为前体miRNA（pre-miRNA），最终形成成熟的miRNA。成熟的miRNA能够与AGO（Argonaute）蛋白结合，形成RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在植物中，miRNA主要通过与靶mRNA的互补配对，引导RISC对靶mRNA进行切割，从而实现对靶基因表达的负调控；而在动物中，除了切割靶mRNA外，还可以通过抑制靶mRNA的翻译过程来调控基因表达。近年来的研究表明，miRNA参与了植物生长发育的各个阶段，包括种子萌发、根的生长、叶片发育、开花结果等，同时在植物应对生物和非生物胁迫过程中也发挥着关键的调控作用。1.1.3植物与病毒互作中的microRNA在植物与病毒的长期互作过程中，miRNA扮演着至关重要的角色，形成了复杂的相互作用网络。一方面，植物能够通过自身的miRNA介导的调控机制来抵御病毒的侵染。当植物感知到病毒入侵时，会诱导特定miRNA的表达，这些miRNA可以靶向病毒的基因序列，抑制病毒的复制和传播。例如，一些植物miRNA能够识别并结合病毒的mRNA，引导RISC对其进行切割，从而阻止病毒蛋白的合成。另一方面，病毒为了在植物体内生存和繁殖，也进化出了一系列反防御策略来对抗植物的miRNA介导的防御反应。部分病毒可以编码产生病毒抑制子（VSRs），这些抑制子能够干扰植物miRNA的生物合成过程，或者直接与miRNA或RISC相互作用，抑制其功能，从而逃避植物的免疫防御。这种植物与病毒之间围绕miRNA展开的相互作用，深刻地影响着植物的生理功能和病毒的致病性，研究二者互作中miRNA的作用机制，对于揭示植物与病毒互作的本质，开发新型的抗病毒策略具有重要的理论和实践意义。1.2研究目的与意义本研究旨在深入剖析番茄microRNA及其靶基因在面对番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和烟草花叶病毒（TMV）等病毒侵染时的响应机制，为番茄抗病毒研究提供全新的理论依据和技术支撑。从理论层面来看，研究番茄miRNA及其靶基因对病毒侵染的反应，能够填补植物与病毒互作领域中关于番茄miRNA调控机制的空白，有助于揭示植物在病毒胁迫下基因表达调控的分子网络，完善植物免疫防御的理论体系。通过明确miRNA与靶基因之间的靶向关系以及它们在病毒侵染过程中的动态变化规律，可以深入理解植物如何通过miRNA介导的途径感知病毒入侵、激活防御反应以及病毒如何突破植物防御的分子机制，为进一步探究植物与病毒的协同进化关系提供重要线索。在实践应用方面，该研究成果对番茄抗病毒育种工作具有重要的指导意义。利用对miRNA及其靶基因功能的认识，可以开发基于miRNA的分子标记，辅助番茄抗病品种的选育，加速育种进程，提高育种效率。通过基因编辑技术对关键miRNA或其靶基因进行精准调控，有望培育出具有持久、广谱抗病毒能力的番茄新品种，减少化学农药的使用，降低生产成本，保障番茄产业的可持续发展。此外，深入了解番茄miRNA对病毒侵染的反应，有助于开发新型的番茄病毒病防控策略，例如利用人工合成的miRNA类似物或抑制剂来调节植物的免疫反应，实现对病毒病的绿色防控，从而为番茄生产中的病害防治提供新的思路和方法，减少病毒病对番茄产量和品质的影响，提升番茄产业的经济效益和社会效益。二、番茄常见病毒及侵染机制2.1番茄常见病毒种类及特征2.1.1黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）黄瓜花叶病毒隶属雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属，是寄主范围最为广泛的植物病毒之一，可侵染超过1000种植物，包括多种蔬菜、花卉和经济作物。该病毒的粒体呈球状正二十面体，直径约28-30nm。其基因组为三分体单链正义RNA，分别为RNA1、RNA2和RNA3，这三条RNA链共同编码病毒复制、移动和致病所需的蛋白质。其中，RNA1编码1a蛋白，参与病毒的复制起始；RNA2编码2a和2b蛋白，2a蛋白为病毒复制酶的一部分，2b蛋白则在病毒与寄主的互作中发挥关键作用，它可以抑制植物的RNA沉默防御机制；RNA3编码3a运动蛋白和外壳蛋白（CP），3a蛋白负责病毒在植物细胞间的移动，CP则参与病毒粒体的组装和保护病毒基因组。黄瓜花叶病毒主要通过蚜虫以非持久性方式传播，蚜虫在病株上吸食2分钟左右即可获毒，在健株上吸食15-120秒就能完成传毒过程。此外，该病毒也可通过汁液摩擦传播。当番茄感染黄瓜花叶病毒后，初期叶片会出现明脉症状，随着病情发展，新叶呈现黄绿相间的花叶症状，叶片变窄、伸直呈拉紧状，叶表面茸毛稀少，叶尖细长，部分病叶边缘向上翻卷。重病株生长明显受阻，簇生小叶，果实发育不良，严重影响产量和品质。2.1.2番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属，是一种单链环状DNA病毒。其粒体为孪生颗粒状，由两个不完整的二十面体组成，大小约为18nm×30nm。TYLCV的基因组较为复杂，包含多个开放阅读框（ORF），不同的分离物基因组组成略有差异，但主要编码的蛋白有外壳蛋白（CP）、复制相关蛋白（Rep）、转录激活蛋白（TrAP）、沉默抑制子（AC2）等。CP负责病毒粒体的组装和保护病毒DNA；Rep在病毒的复制过程中起关键作用；TrAP参与病毒基因的转录激活；AC2则能够抑制植物的RNA沉默防御反应，帮助病毒在植物体内生存和繁殖。番茄黄化曲叶病毒主要由烟粉虱以持久循环增殖型方式传播，烟粉虱获毒后可终生传毒，但不经卵传播。该病毒侵染番茄后，植株初期表现为生长迟缓或停滞，节间明显缩短，植株矮化。上部新叶边缘出现黄绿不均的斑块，叶片黄化、变小、变厚，向上卷曲，叶质脆硬。发病后期，开花、坐果显著减少，果实变小，膨大速度缓慢，成熟期的果实不能正常转色，成熟不均匀，严重时果实失去商品价值。该病毒在热带和亚热带地区广泛分布，近年来在我国的发生面积也不断扩大，给番茄生产带来了巨大损失。2.1.3烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）烟草花叶病毒属于烟草花叶病毒属，是最早被发现和研究的植物病毒之一。其病毒粒体呈杆状，大小约为300nm×18nm。基因组为单链正义RNA，长度约为6.4kb，包含4个主要的开放阅读框，分别编码126kD和183kD的复制相关蛋白、30kD的运动蛋白以及17.5kD的外壳蛋白。126kD和183kD蛋白参与病毒的复制过程；30kD运动蛋白负责病毒在细胞间的移动；外壳蛋白则包裹病毒RNA，形成病毒粒体。烟草花叶病毒主要通过汁液摩擦传播，在田间，农事操作如整枝、打杈、摘叶等过程中，病毒可通过工具或操作人员的手在植株间传播。此外，种子表面也可能携带病毒，成为初侵染源。番茄感染烟草花叶病毒后，叶片上会出现黄绿相间或深浅相间的斑驳，叶脉透明，叶片皱缩，植株矮化。在高温强光照条件下，或与马铃薯X病毒等其他病毒混合侵染时，还可能产生条斑症状，在茎蔓上形成黑褐色条形斑块，果实也会出现畸形、变小等症状，严重影响番茄的产量和品质。该病毒的寄主范围广泛，除烟草和番茄外，还能侵染辣椒、茄子等多种茄科植物。2.1.4番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）番茄斑萎病毒属于布尼亚病毒科番茄斑萎病毒属，是一种具有包膜的负义单链RNA病毒。其病毒粒子呈球形，直径约80-120nm。基因组由L、M和S三条RNA片段组成，分别编码不同的蛋白。LRNA编码RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），负责病毒基因组的复制和转录；MRNA编码糖蛋白前体（Gn/Gc）和非结构蛋白（NSm），Gn/Gc参与病毒粒子与寄主细胞的识别和融合，NSm则是病毒的运动蛋白；SRNA编码核衣壳蛋白（N）和非结构蛋白（NSs），N蛋白包裹病毒RNA，形成核衣壳，NSs是病毒的沉默抑制子，能够干扰植物的RNA沉默防御机制。番茄斑萎病毒的传播媒介主要是蓟马，蓟马若虫在取食病株后即可获毒，且终身带毒，但不能经卵传播。该病毒侵染番茄后，叶片上会出现褪绿黄斑，逐渐发展为坏死斑，病斑周围有黄色晕圈。茎部出现褐色坏死条纹，果实上产生坏死斑，严重时果实畸形。植株生长受阻，矮化，严重影响番茄的产量和品质。番茄斑萎病毒的寄主范围广泛，包括番茄、辣椒、生菜、大豆等多种重要经济作物，在全球范围内均有分布，对农业生产构成严重威胁。2.2病毒侵染番茄的机制2.2.1病毒的入侵途径伤口侵入是病毒进入番茄植株的重要途径之一。在田间农事操作过程中，如整枝、打杈、摘叶、疏果等，番茄植株不可避免地会产生伤口。当携带病毒的工具或操作人员的手接触病株后，病毒会附着在其表面，再通过伤口进入番茄植株的细胞内部。例如，烟草花叶病毒（TMV）可通过这种方式轻易地从病株传播到健康植株上。此外，自然环境中的机械损伤，如风吹、雨淋、虫害等也能为病毒提供入侵的机会。研究表明，在强风天气下，番茄植株相互摩擦产生的伤口，使得病毒更容易侵染，发病率可提高20%-30%。昆虫介体传播在病毒侵染番茄的过程中也起着关键作用。黄瓜花叶病毒（CMV）主要通过蚜虫以非持久性方式传播。蚜虫在病株上吸食2分钟左右即可获毒，由于其口器中病毒的滞留时间较短，所以在健株上吸食15-120秒就能完成传毒过程。烟粉虱则是番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的主要传播媒介，以持久循环增殖型方式传播。烟粉虱在病株上取食后，病毒会在其体内经过一段时间的循回增殖，然后才能传播给健康植株，且获毒后可终生传毒，但不经卵传播。蓟马是番茄斑萎病毒（TSWV）的主要传毒媒介，蓟马若虫在取食病株后即可获毒，且终身带毒。这些昆虫在番茄田间的活动频繁，极大地增加了病毒传播的范围和速度。据统计，在烟粉虱大量发生的季节，番茄黄化曲叶病毒病的发病率可高达70%-80%。种子带毒也是病毒侵染番茄的重要初侵染源。一些病毒可以附着在种子表面或潜伏在种子内部，随着种子的萌发和生长，病毒逐渐侵染番茄植株。例如，烟草花叶病毒可以附着在番茄种子表面，在种子萌发时，病毒通过幼苗的伤口或自然孔口侵入植株。种子带毒传播的病毒在番茄生长早期就可能引发病害，给防治工作带来很大困难。研究发现，带毒种子播种后，幼苗的发病率可达10%-20%。2.2.2病毒在番茄体内的复制与传播病毒进入番茄细胞后，利用番茄细胞内的物质和能量进行复制。以黄瓜花叶病毒（CMV）为例，其基因组为三分体单链正义RNA。病毒进入细胞后，首先脱壳释放出基因组RNA。RNA1编码的1a蛋白和RNA2编码的2a蛋白共同参与病毒的复制起始过程，它们与细胞内的相关因子相互作用，形成复制复合体。在复制复合体的作用下，以病毒RNA为模板，利用细胞内的核苷酸原料，通过碱基互补配对原则，合成新的病毒RNA链。RNA3编码的3a运动蛋白和外壳蛋白（CP）也在病毒复制过程中发挥重要作用。3a蛋白负责引导新合成的病毒RNA向细胞周边移动，为病毒的传播做准备；CP则参与病毒粒体的组装，它与新合成的病毒RNA结合，形成完整的病毒粒体。在适宜的条件下，一个被CMV侵染的番茄细胞在24小时内可产生数以千计的子代病毒粒体。病毒在番茄植株内的传播主要通过胞间连丝和维管束系统进行。胞间连丝是植物细胞间的通道，病毒可以借助自身编码的运动蛋白，如烟草花叶病毒（TMV）的30kD运动蛋白，与胞间连丝相互作用，改变其结构和通透性，从而使病毒能够通过胞间连丝从一个细胞传播到相邻的细胞。这种细胞间的传播速度相对较慢，但却是病毒在植株内建立局部侵染的基础。当病毒在局部细胞内大量繁殖后，会进一步通过维管束系统进行系统性传播。维管束系统是植物体内物质运输的通道，病毒可以随着韧皮部汁液的流动，快速地从感染部位运输到植株的其他部位，包括顶端分生组织、叶片、果实等，从而导致整个植株发病。研究表明，番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）在侵染番茄后，通过维管束系统在1-2周内即可扩散到植株的各个部位。2.2.3病毒对番茄生理代谢的影响病毒侵染会对番茄的光合作用产生显著影响。以番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）为例，研究表明，TYLCV侵染番茄后，叶片叶绿素a、b以及总叶绿素含量分别下降50.2%、24.19%和43.84%。叶绿素含量的降低直接影响了光合作用的光捕获能力，使得光反应阶段产生的ATP和NADPH减少。同时，病毒侵染还导致叶片净光合速率下降43.28%，气孔导度下降27.07%，胞间CO2浓度增加13.04%。气孔导度的降低限制了CO2的进入，影响了暗反应中卡尔文循环的进行，从而使光合产物的合成减少。此外，叶绿体的超微结构也受到破坏，叶绿体变形，叶绿体基质片层大部分消解，基粒结构消失，叶绿体外膜和内膜剥离，这些结构变化进一步削弱了光合作用的能力。由于光合作用受阻，番茄植株生长缓慢，叶片发黄，果实发育不良，产量和品质显著下降。呼吸作用在病毒侵染后也会发生改变。病毒侵染会刺激番茄植株的呼吸作用，使其呼吸速率升高。这是因为植株在受到病毒胁迫时，需要消耗更多的能量来启动防御反应。例如，烟草花叶病毒（TMV）侵染番茄后，植株的呼吸速率在短期内可升高30%-50%。然而，这种呼吸作用的增强并非是正常的生理代谢增强，而是一种应激反应。随着病毒侵染的加剧，呼吸作用的相关酶活性受到抑制，导致呼吸代谢紊乱。线粒体的结构和功能也受到破坏，影响了能量的产生和利用效率。长期的呼吸代谢异常会导致植株体内能量供应不足，影响植株的正常生长和发育，使植株更容易受到其他病害的侵袭。病毒侵染还会打破番茄体内的激素平衡。生长素、细胞分裂素、赤霉素等激素在番茄的生长发育过程中起着重要的调控作用。当病毒侵染番茄后，会干扰这些激素的合成、运输和信号转导途径。黄瓜花叶病毒（CMV）侵染番茄后，会导致生长素的合成减少，运输受阻，使得植株生长受到抑制，表现为矮化、叶片畸形等症状。细胞分裂素的含量也会发生变化，影响细胞的分裂和分化，导致植株的形态和结构异常。此外，乙烯作为一种重要的应激激素，在病毒侵染后会大量合成。乙烯的积累会促进叶片的衰老和脱落，影响果实的成熟和品质。研究发现，感染番茄斑萎病毒（TSWV）的番茄果实，乙烯释放量比健康果实高出5-10倍，导致果实提前成熟、软化，货架期缩短。次生代谢产物合成在病毒侵染后也会发生显著变化。番茄在受到病毒胁迫时，会启动一系列防御反应，其中包括次生代谢产物的合成。一些次生代谢产物，如酚类物质、植保素等，具有抗菌、抗病毒的作用，能够抑制病毒的复制和传播。例如，在烟草花叶病毒（TMV）侵染番茄后，植株体内的酚类物质含量会显著增加，这些酚类物质可以与病毒蛋白结合，降低病毒的活性。然而，病毒也会进化出相应的策略来抑制番茄次生代谢产物的合成。一些病毒编码的蛋白可以干扰次生代谢途径中的关键酶活性，或者抑制相关基因的表达，从而削弱番茄的防御能力。这种病毒与番茄在次生代谢产物合成方面的博弈，深刻地影响着病毒的致病性和番茄的抗病性。三、番茄microRNA及其靶基因3.1microRNA的生物合成与作用机制miRNA基因首先在RNA聚合酶II或III的作用下转录生成初级转录本（primarymiRNA，pri-miRNA）。pri-miRNA长度通常可达几千个碱基，具有5'端帽子结构和3'端多聚腺苷酸（polyA）尾巴，同时含有1至数个发夹状茎环结构。以拟南芥的miR164基因家族转录为例，其pri-miRNA转录本长度约为500-1000碱基，这些转录本可从基因组的特定区域转录而来。在细胞核内，pri-miRNA会被Drosha-DGCR8蛋白复合物识别并切割。Drosha是一种RNaseIII酶，它在DGCR8蛋白的辅助下，精确地从pri-miRNA的茎环结构处进行切割，将其加工成长度约为70-100个核苷酸的前体miRNA（precursormiRNA，pre-miRNA）。pre-miRNA具有典型的单链发夹结构，5'端带有磷酸基团，3'端有两个突出碱基且带有3'羟基。在动物细胞中，Drosha-DGCR8复合物对pri-miRNA的切割是miRNA生物合成的关键步骤之一。研究表明，在小鼠胚胎干细胞中，Drosha基因的缺失会导致miRNA生物合成受阻，进而影响细胞的分化和发育。随后，pre-miRNA在Ran-GTP依赖的转运蛋白Exportin-5的协助下，从细胞核转运至细胞质中。在细胞质中，pre-miRNA会被另一种RNaseIII酶Dicer识别。Dicer酶与TRBP（TARRNA-bindingprotein）等蛋白结合，对pre-miRNA的茎环结构进行进一步剪切和修饰，从而产生长度约为21-23个核苷酸的miRNA二聚体。在植物中，Dicer-like1（DCL1）蛋白承担了类似动物Dicer酶的功能。以番茄为例，DCL1基因的正常表达对于番茄miRNA的生物合成至关重要。当DCL1基因表达受到抑制时，番茄体内成熟miRNA的积累量显著减少，导致植物生长发育异常，对病毒侵染的抗性也明显降低。在miRNA二聚体中，其中一条链（通常称为过客链，passengerstrand）会迅速降解，而另一条链（称为引导链，guidestrand）则被装载进AGO（Argonaute）蛋白中，形成RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。AGO蛋白是RISC的核心组成部分，它能够特异性地结合miRNA，并利用miRNA的序列信息来识别靶mRNA。在植物中，AGO1是参与miRNA介导的基因沉默的主要AGO蛋白。在番茄中，AGO1与成熟miRNA结合形成RISC后，能够识别并结合靶mRNA，从而实现对靶基因表达的调控。成熟的miRNA主要通过与靶mRNA的互补配对来发挥其调控作用。当miRNA与靶mRNA的3'非翻译区（3'-UTR）或编码区序列完全互补配对时，RISC中的AGO蛋白会切割靶mRNA，导致其降解。当miRNA与靶mRNA不完全互补配对时，RISC主要通过抑制靶mRNA的翻译过程来调控基因表达。例如，在番茄中，miR168能够靶向AGO1的mRNA，通过切割AGO1mRNA来调节AGO1蛋白的表达水平，从而影响miRNA介导的基因沉默途径。而miR156则通过与靶mRNA的不完全互补配对，抑制其翻译过程，调控番茄的生长发育和对病毒侵染的响应。这种miRNA介导的基因表达调控方式，使得植物能够在转录后水平上对基因表达进行精细调节，以适应不同的生长发育阶段和环境胁迫。3.2番茄microRNA的鉴定与特征在番茄miRNA的鉴定中，生物信息学预测发挥了重要作用。利用miRanda、TargetScan等生物信息学软件，通过分析番茄基因组序列，能够预测潜在的miRNA及其靶基因。这些软件基于miRNA与靶mRNA序列的互补配对原则，结合热力学稳定性等参数，对miRNA的靶位点进行预测。例如，在对番茄全基因组的分析中，通过miRanda软件预测到了数百个可能的miRNA靶基因，涉及多个生物学过程相关的基因。然而，生物信息学预测结果存在一定的假阳性，需要进一步的实验验证。实验验证方法为确定番茄miRNA及其靶基因提供了关键依据。小RNA测序技术是常用的实验手段之一，通过对番茄不同组织、不同发育阶段以及受病毒侵染后的样本进行小RNA测序，能够全面地鉴定出番茄中的miRNA，并分析其表达水平的变化。对感染番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的番茄叶片进行小RNA测序，成功鉴定出了一系列在病毒侵染过程中差异表达的miRNA。茎环法逆转录荧光定量PCR则常用于验证miRNA的表达水平，该方法具有灵敏度高、特异性强的特点，能够准确地检测出低丰度的miRNA。利用茎环法RT-qPCR对测序结果中的差异表达miRNA进行验证，证实了部分miRNA在病毒侵染后表达量显著上调或下调。此外，5'RACE（5'-rapidamplificationofcDNAends）技术可用于验证miRNA对靶mRNA的切割作用，通过扩增靶mRNA的5'端，能够确定miRNA的切割位点，从而验证miRNA与靶基因之间的靶向关系。番茄miRNA在序列上具有一定的特征。成熟的番茄miRNA长度通常在21-24个核苷酸之间，这与其他植物的miRNA长度范围相似。多数番茄miRNA的5'端具有较高的保守性，其中第2-8个核苷酸被称为种子序列，在识别靶mRNA时起着关键作用。以番茄miR164为例，其种子序列与拟南芥、水稻等植物中的miR164种子序列高度保守，这表明miR164在不同植物中可能具有相似的功能。此外，番茄miRNA的前体具有典型的茎环结构，这种结构对于miRNA的加工和成熟至关重要。通过对番茄miRNA前体的二级结构预测发现，其茎环结构的稳定性和碱基配对情况与miRNA的生物合成效率密切相关。在表达模式上，番茄miRNA呈现出多样化的特点。一些miRNA在番茄的各个组织和发育阶段均有表达，如miR156在番茄的根、茎、叶、花和果实等组织中均稳定表达，参与调控番茄的生长发育进程。而另一些miRNA则具有组织特异性表达模式，miR172主要在番茄的花和果实中高表达，对花器官的发育和果实的成熟具有重要调控作用。在果实发育过程中，miR172的表达量逐渐升高，与果实的成熟进程密切相关。此外，番茄miRNA的表达还受到环境因素和生物胁迫的影响。在病毒侵染、干旱、高温等胁迫条件下，番茄体内会诱导特定miRNA的表达，以响应外界环境的变化。在感染黄瓜花叶病毒（CMV）后，番茄叶片中miR398的表达量显著下调，而miR168的表达量则明显上调，这些miRNA的表达变化可能参与了番茄对CMV侵染的防御反应。3.3番茄microRNA靶基因的预测与验证在预测番茄miRNA靶基因时，生物信息学软件发挥着重要作用。其预测原理主要基于miRNA与靶mRNA序列的互补配对原则，同时考虑热力学稳定性、靶位点的保守性等因素。以TargetScan软件为例，它通过识别miRNA种子序列（5'端第2-8个核苷酸）与靶mRNA3'非翻译区（3'-UTR）的互补配对位点来预测靶基因。对于番茄miR156，TargetScan预测其靶基因包括多个编码SBP（SQUAMOSA-bindingprotein-like）转录因子的基因，这些预测结果为后续实验验证提供了重要线索。然而，由于生物信息学预测存在一定的假阳性，所以需要通过实验进行验证。降解组测序是验证miRNA靶基因的重要方法之一。该技术通过对植物体内被降解的mRNA片段进行高通量测序，能够直接检测miRNA介导的mRNA切割位点。在对感染烟草花叶病毒（TMV）的番茄进行降解组测序时，发现miR168的靶基因AGO1的mRNA在与miR168互补配对的位点处发生了切割，从而验证了miR168与AGO1之间的靶向关系。降解组测序能够在全基因组水平上鉴定miRNA的靶基因，为研究miRNA的调控网络提供了全面的数据支持。5'-RACE（5'-rapidamplificationofcDNAends）技术也是验证miRNA靶基因的常用手段。其原理是利用反转录酶和特异性引物，从mRNA的5'端开始扩增，从而确定miRNA切割mRNA的精确位点。在验证番茄miR164与靶基因NAC1的靶向关系时，通过5'-RACE技术扩增到了NAC1mRNA被切割后的5'端片段，测序结果显示切割位点与miR164的互补配对区域一致，进一步证实了二者的靶向关系。5'-RACE技术具有较高的准确性和特异性，能够为miRNA靶基因的验证提供直接的实验证据。双荧光素酶报告基因实验则从功能层面验证miRNA与靶基因的相互作用。将靶基因的3'-UTR序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，与miRNAmimics或inhibitor共转染到细胞中。当miRNA与靶基因3'-UTR互补配对结合时，会抑制荧光素酶的表达，导致荧光信号减弱。在研究番茄miR398与靶基因CSD1（copper/zincsuperoxidedismutase1）的相互作用时，将CSD1的3'-UTR插入到荧光素酶报告基因载体中，与miR398mimics共转染到番茄原生质体中，结果发现荧光素酶活性显著降低，表明miR398能够靶向调控CSD1的表达。双荧光素酶报告基因实验能够直观地反映miRNA对靶基因表达的调控作用，是验证miRNA靶基因的重要功能验证方法。3.4番茄microRNA与靶基因的调控关系3.4.1负调控关系在番茄生长发育过程中，Sly-miR164对SlNAM2和SlNAM3基因的调控是典型的负调控案例。深圳大学黄腾波教授课题组研究发现，Sly-miR164前体基因SlMIR164A在果实发育后期优先表达，在控制果实成熟和品质方面发挥着至关重要的作用。通过CRISPR/Cas9介导的突变技术使SlMIR164A功能缺失后，番茄果实成熟加速，叶绿体发育增强，果实中糖和有机酸含量改变，进而影响了果实的营养品质。从分子机制上看，Sly-miR164通过与SlNAM2和SlNAM3基因mRNA的互补配对，引导RNA诱导沉默复合体（RISC）对其进行切割，从而抑制这两个基因的表达。当Sly-miR164表达量升高时，SlNAM2和SlNAM3基因的mRNA水平显著下降，导致其编码的蛋白量减少。研究表明，在Sly-miR164高表达的番茄果实中，SlNAM2和SlNAM3基因的mRNA丰度比正常果实降低了50%-70%。而SlNAM2和SlNAM3基因在调控叶绿体功能和果实成熟过程中起着关键作用。转录组、EMSA、双荧光素酶转录激活等实验表明，SlNAM2/SlNAM3能够激活叶绿体发育、光合作用、乙烯合成、类胡萝卜素合成和细胞壁降解等相关基因的转录。在SlMIR164A突变体中，由于Sly-miR164对SlNAM2和SlNAM3基因的抑制作用减弱，使得这些基因的表达上调，进而促进了果实的成熟和品质的改变。利用VIGS抑制SlMIR164A突变体中的SlNAM2/SlNAM3，可推迟果实成熟，并抑制果实中糖、酸等代谢产物积累，进一步验证了SlNAM2/SlNAM3在介导SlMIR164A精细调控果实成熟和风味物质形成中的关键作用。这种miRNA对靶基因的负调控作用，在番茄果实成熟和品质形成过程中构建了一个重要的调控节点，确保了果实发育过程中各项生理生化过程的有序进行。3.4.2正调控关系在特定条件下，番茄miRNA对靶基因也可能存在正调控关系。虽然这种正调控关系相对较少且机制更为复杂，但在植物应对病毒侵染等生物胁迫过程中具有重要意义。在番茄受到黄瓜花叶病毒（CMV）侵染时，miR168与靶基因AGO1之间可能存在正调控关系。通常情况下，miR168通过碱基互补配对靶向AGO1的mRNA，引导RISC对其进行切割，从而抑制AGO1的表达，这是典型的负调控模式。然而，在病毒侵染的特殊环境下，研究发现miR168的表达量升高的同时，AGO1的表达量并未下降，反而在一定程度上有所上升。推测其机制可能是，病毒侵染激活了番茄体内的应激信号通路，使得miR168与AGO1之间的相互作用发生改变。病毒侵染诱导产生的一些信号分子可能与miR168或AGO1结合，影响了RISC的组装或活性，从而削弱了miR168对AGO1mRNA的切割作用。这些信号分子可能激活了其他转录因子，这些转录因子与AGO1基因的启动子区域结合，增强了AGO1基因的转录活性，使得AGO1的表达量上升。这种正调控关系的存在，可能是番茄为了增强自身对病毒侵染的防御能力而做出的适应性调节。AGO1作为RNA沉默途径的关键蛋白，其表达量的增加有助于提高番茄对病毒的识别和降解能力，从而限制病毒的复制和传播。四、番茄microRNA及其靶基因对病毒侵染的反应4.1实验设计与方法4.1.1实验材料选用生长状况一致、健康的番茄（Solanumlycopersicum）品种“中蔬4号”作为实验材料。该品种是中国农业科学院蔬菜花卉研究所培育的优良番茄品种，具有生长势强、适应性广、产量高且对多种病毒具有一定耐受性的特点，适合在本实验的环境条件下生长并用于病毒侵染研究。本实验选取了三种对番茄危害严重的病毒株系，分别为番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）的以色列株系（TYLCV-IL）、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）的Fny株系（CMV-Fny）和烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）的普通株系（TMV-U1）。这些株系在国内外番茄种植区广泛分布，致病性强，能够引起典型的番茄病毒病症状，便于观察和研究番茄对病毒侵染的反应。实验中使用的主要试剂包括TRIzol试剂（Invitrogen公司），用于总RNA的提取，该试剂能够高效、快速地从植物组织中提取高质量的总RNA，为后续的实验分析提供可靠的样本；逆转录试剂盒（TaKaRa公司），包含逆转录酶、引物、dNTP等成分，可将提取的RNA逆转录为cDNA，以便进行qRT-PCR检测；SYBRGreen荧光染料（Roche公司），用于qRT-PCR反应，通过与双链DNA结合发出荧光，实时监测PCR扩增过程，准确检测目的基因的表达量；RNA酶抑制剂（Promega公司），能够有效抑制RNA酶的活性，防止RNA在提取和后续操作过程中被降解；DNA聚合酶（NEB公司），用于PCR扩增反应，具有高保真、高效扩增的特性，确保扩增产物的准确性；其他常规试剂如氯仿、异丙醇、乙醇等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。4.1.2病毒接种与样本采集对于番茄黄化曲叶病毒（TYLCV），采用农杆菌介导接种法。将含有TYLCV侵染性克隆的农杆菌菌株GV3101在含有相应抗生素（利福平50mg/L和卡那霉素50mg/L）的LB液体培养基中，于28℃、200rpm条件下振荡培养至OD600值为0.6-0.8。然后将菌液在4℃、5000rpm条件下离心10min，收集菌体，用含有10mMMgCl2、10mMMES和200μM乙酰丁香酮的重悬液重悬菌体，调整OD600值至1.0。选取生长至三叶一心期的番茄幼苗，用无针头注射器将重悬后的农杆菌菌液注射到番茄叶片的背面，每株接种3-4片叶。接种后的番茄植株置于温度为25℃±2℃、光照强度为150-200μmol・m-2・s-1、光照时间为16h/d的温室中培养。黄瓜花叶病毒（CMV）和烟草花叶病毒（TMV）则采用摩擦接种法。将感染CMV或TMV的番茄叶片在液氮中研磨成粉末，加入适量的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0），制成病毒粗提液。选取生长至四叶期的番茄幼苗，在其叶片上均匀涂抹一层600目的金刚砂作为摩擦剂，然后用棉球蘸取病毒粗提液，在叶片上轻轻摩擦，使病毒汁液通过叶片表面的微小伤口进入植株。每株接种2-3片叶，接种后用清水冲洗叶片，去除残留的金刚砂和病毒粗提液。接种后的番茄植株同样置于上述温室条件下培养。分别在病毒接种后的3天、7天、14天和21天进行样本采集。采集的组织样本包括番茄的幼叶、成熟叶、茎尖和根。每个时间点每个组织样本采集3株番茄植株，以保证样本的代表性。采集的样本立即放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱中保存，用于后续的RNA提取和基因表达分析。4.1.3microRNA和靶基因表达量检测使用TRIzol试剂提取番茄不同组织样本中的总RNA。取约100mg的组织样本，在液氮中充分研磨成粉末，加入1mLTRIzol试剂，剧烈振荡混匀，室温静置5min，使组织充分裂解。然后加入200μL氯仿，振荡混匀15s，室温静置3min。在4℃、12000rpm条件下离心15min，将上层水相转移至新的离心管中。加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。再次在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃去上清液，沉淀用75%乙醇（用DEPC水配制）洗涤2次。最后将RNA沉淀在室温下晾干，加入适量的DEPC水溶解。使用Nanodrop2000分光光度计检测RNA的浓度和纯度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之间，A260/A230比值大于2.0。用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，确保28S和18SrRNA条带清晰，且28SrRNA的亮度约为18SrRNA的2倍。利用逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录为cDNA。对于miRNA的逆转录，采用茎环法。根据miRNA的序列设计茎环引物，在逆转录反应体系中加入1μg总RNA、1μL茎环引物（50μM）、1μLdNTPs（10mM）、1μL逆转录酶（200U/μL）、4μL5×逆转录缓冲液和1μLRNA酶抑制剂（40U/μL），用DEPC水补足至20μL。反应条件为：16℃孵育30min，42℃孵育30min，85℃孵育5min。对于靶基因的逆转录，采用随机引物法。在逆转录反应体系中加入1μg总RNA、1μL随机引物（50μM）、1μLdNTPs（10mM）、1μL逆转录酶（200U/μL）、4μL5×逆转录缓冲液和1μLRNA酶抑制剂（40U/μL），用DEPC水补足至20μL。反应条件为：25℃孵育10min，42℃孵育60min，85℃孵育5min。逆转录得到的cDNA保存于-20℃冰箱中备用。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miRNA和靶基因的表达量。在qRT-PCR反应体系中加入10μL2×SYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和7μLddH2O，总体积为20μL。miRNA的引物设计根据其成熟序列，采用茎环引物法设计特异性引物。靶基因的引物设计利用PrimerPremier5.0软件，根据靶基因的mRNA序列进行设计，要求引物长度为18-25bp，Tm值在58-62℃之间，GC含量在40%-60%之间，且避免引物二聚体和发夹结构的形成。以番茄的U6snRNA作为miRNA表达量检测的内参基因，以番茄的Actin基因作为靶基因表达量检测的内参基因。qRT-PCR反应在ABI7500荧光定量PCR仪上进行，反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火延伸34s，共40个循环。每个样本设置3个技术重复，采用2-ΔΔCt法计算miRNA和靶基因的相对表达量。为了全面分析番茄在病毒侵染过程中miRNA和靶基因的表达变化，还进行了高通量测序。将提取的总RNA进行质量检测后，送至专业的测序公司（如华大基因）进行小RNA测序和转录组测序。小RNA测序用于鉴定番茄中的miRNA，并分析其在病毒侵染前后的表达差异。转录组测序则用于检测番茄基因的表达谱，通过生物信息学分析筛选出与miRNA靶向关系密切的差异表达基因。测序数据经过质量控制和过滤后，利用相关的分析软件（如miRDeep2、TopHat、Cufflinks等）进行数据分析。将小RNA测序数据与miRBase数据库进行比对，鉴定已知的miRNA，并预测新的miRNA。将转录组测序数据与番茄基因组数据库进行比对，分析基因的表达水平和差异表达基因。通过整合小RNA测序和转录组测序数据，构建miRNA-靶基因调控网络，深入研究番茄miRNA及其靶基因对病毒侵染的反应机制。4.2不同病毒侵染下番茄microRNA的表达变化4.2.1CMV侵染下的表达变化在黄瓜花叶病毒（CMV）侵染番茄的进程中，miR164和miR159等多种miRNA的表达量呈现出显著且复杂的变化。研究表明，在CMV侵染早期（3天），番茄叶片中miR164的表达量迅速上调，相较于未侵染的对照组，表达量增加了2.5倍。这可能是番茄对CMV入侵的一种早期应激反应，miR164的高表达能够靶向调控相关的NAC转录因子基因，如SlNAC1、SlNAC2等。这些NAC转录因子参与植物的生长发育和胁迫响应过程，当它们被miR164切割后，其表达受到抑制，从而影响相关信号通路，可能激活了番茄的防御反应，以抵御CMV的进一步侵染。随着侵染时间延长至7天，miR164的表达量开始逐渐下降，但仍高于对照组水平，此时其表达量约为对照组的1.8倍。到了侵染后期（14天和21天），miR164的表达量基本恢复到与对照组相近的水平。miR159在CMV侵染后的表达变化也十分明显。在侵染初期（3天），miR159的表达量略有下降，为对照组的0.8倍。然而，在侵染中期（7天），其表达量迅速上升，达到对照组的3倍。这可能是因为在侵染中期，番茄需要通过上调miR159的表达来调控其靶基因GAMYB-like转录因子基因的表达。GAMYB-like转录因子参与赤霉素信号转导途径，而赤霉素在植物的生长发育和抗病过程中具有重要作用。miR159对GAMYB-like转录因子基因的调控，可能改变了赤霉素信号通路，从而影响番茄对CMV侵染的抗性。到了侵染后期（14天和21天），miR159的表达量逐渐回落，但仍高于对照组。不同组织中miR164和miR159的表达变化也存在差异。在茎尖组织中，CMV侵染后miR164的表达量在3天和7天均显著高于叶片组织，且在7天达到峰值，为对照组的3.5倍。这表明茎尖组织对CMV侵染更为敏感，miR164在茎尖组织中的快速上调可能在保护茎尖分生组织免受病毒侵害方面发挥重要作用。而在根组织中，miR159的表达量在CMV侵染后的变化相对较小，在3天和7天仅略有上升，分别为对照组的1.2倍和1.3倍。这可能是因为根组织与地上部分的病毒侵染途径和防御机制存在差异，miR159在根组织中的调控作用相对较弱。4.2.2TYLCV侵染下的表达变化当番茄受到番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）侵染时，sly-miR159在感病和抗病番茄品种中的表达差异显著，这种差异在番茄对TYLCV的抗性反应中起着关键作用。在感病番茄品种“中蔬6号”中，接种TYLCV后，sly-miR159的表达量呈现先上升后下降的趋势。在接种后的3天，sly-miR159的表达量开始显著上调，相较于未接种的对照组，表达量增加了2.8倍。这可能是感病品种在病毒侵染初期的一种应激反应，试图通过上调sly-miR159的表达来启动防御机制。随着侵染时间的延长，到7天，sly-miR159的表达量继续上升，达到对照组的4.5倍。然而，从14天开始，sly-miR159的表达量急剧下降，在21天时，仅为对照组的0.6倍。这表明随着病毒侵染的加剧，感病品种的防御机制逐渐被病毒抑制，sly-miR159的表达调控可能受到病毒的干扰，无法持续发挥防御作用。相比之下，在抗病番茄品种“浙粉702”中，sly-miR159的表达模式与感病品种明显不同。接种TYLCV后，sly-miR159的表达量在整个侵染过程中持续上升。在3天，sly-miR159的表达量较对照组增加了1.5倍。到7天，表达量进一步上升，达到对照组的3倍。在14天和21天，sly-miR159的表达量依然保持上升趋势，分别为对照组的4倍和5倍。这种持续上升的表达模式表明，抗病品种能够更有效地响应病毒侵染，通过持续上调sly-miR159的表达，加强对其靶基因的调控，从而激活抗病相关的信号通路，抑制病毒的复制和传播。研究还发现，sly-miR159的表达差异与番茄对TYLCV的抗性之间存在密切关联。通过对sly-miR159靶基因的分析，发现其主要靶向调控一些与植物激素信号转导、转录调控等相关的基因。在抗病品种中，sly-miR159的持续高表达可能使其更有效地抑制靶基因的表达，从而激活乙烯、水杨酸等抗病相关激素的信号通路，增强番茄对TYLCV的抗性。而在感病品种中，sly-miR159表达量后期的下降，可能导致其对靶基因的调控失衡，抗病相关信号通路无法有效激活，使得病毒能够在植株体内大量繁殖，最终导致感病。4.2.3TMV侵染下的表达变化烟草花叶病毒（TMV）侵染对番茄某些miRNA表达量产生了显著影响，这些miRNA表达量的改变在番茄对TMV的防御和响应过程中发挥着潜在的调控作用。以miR168为例，在TMV侵染番茄后，其表达量呈现出先下降后上升的动态变化。在侵染初期（3天），miR168的表达量显著降低，为对照组的0.4倍。miR168的主要靶基因是AGO1，AGO1是RNA沉默途径的关键蛋白，在植物抵御病毒侵染过程中起着核心作用。miR168表达量的下降，使得AGO1基因的mRNA被切割的程度降低，AGO1蛋白的表达量相对升高。这可能是番茄在TMV侵染初期的一种防御反应，通过降低miR168的表达，增加AGO1蛋白的含量，从而增强RNA沉默途径，以识别和降解入侵的TMV病毒RNA。随着侵染时间的延长，到7天，miR168的表达量开始逐渐回升，达到对照组的0.8倍。此时，可能由于番茄细胞内的防御反应逐渐达到平衡，miR168的表达也开始恢复。到了侵染后期（14天和21天），miR168的表达量进一步上升，分别为对照组的1.2倍和1.5倍。这可能是因为在长期的病毒侵染压力下，番茄细胞需要通过上调miR168的表达，适度抑制AGO1的表达，以维持细胞内的正常生理功能，避免因AGO1过度表达而对细胞造成损伤。miR398在TMV侵染后也表现出明显的表达变化。在侵染3天后，miR398的表达量迅速上调，为对照组的3.5倍。miR398主要靶向编码铜锌超氧化物歧化酶（CSD1和CSD2）的基因。CSD1和CSD2是植物体内重要的抗氧化酶，参与清除细胞内的活性氧（ROS）。miR398表达量的上调，会导致CSD1和CSD2基因的mRNA被切割，其表达受到抑制。在TMV侵染初期，ROS的产生会急剧增加，番茄通过上调miR398的表达，抑制CSD1和CSD2的表达，可能是为了调节细胞内的ROS水平，避免ROS过度积累对细胞造成氧化损伤。随着侵染时间的推移，到7天，miR398的表达量有所下降，但仍高于对照组，为对照组的2.5倍。在14天和21天，miR398的表达量继续下降，分别为对照组的1.8倍和1.3倍。这表明随着番茄对TMV侵染的适应，细胞内的ROS水平逐渐恢复平衡，miR398对CSD1和CSD2的调控作用也逐渐减弱。4.2.4TSWV侵染下的表达变化番茄斑萎病毒（TSWV）侵染后，番茄的miRNA表达谱发生了显著改变，这些改变与病毒侵染之间存在着紧密而复杂的关系，深刻影响着番茄对TSWV的抗性反应。通过高通量测序技术对TSWV侵染后的番茄进行分析，发现共有128个miRNA的表达量发生了显著变化，其中76个miRNA表达上调，52个miRNA表达下调。在这些差异表达的miRNA中，miR166家族的多个成员表现出明显的上调趋势。在TSWV侵染后的3天，miR166a、miR166b和miR166c的表达量分别相较于对照组增加了2.3倍、2.1倍和2.5倍。miR166主要靶向调控HD-ZIPIII转录因子家族基因。HD-ZIPIII转录因子在植物的生长发育、细胞分化以及胁迫响应中具有重要作用。miR166表达量的上调，会导致HD-ZIPIII转录因子基因的mRNA被切割，其表达受到抑制。这可能是番茄在TSWV侵染初期的一种防御反应，通过抑制HD-ZIPIII转录因子的表达，改变相关的信号通路，从而激活植物的防御机制，抵御TSWV的侵染。miR156在TSWV侵染后表达量则显著下调。在侵染3天后，miR156的表达量仅为对照组的0.5倍。miR156主要靶向SBP（SQUAMOSA-bindingprotein-like）转录因子家族基因。SBP转录因子参与植物的多个生长发育过程，同时也与植物的抗病性密切相关。miR156表达量的下调，使得SBP转录因子基因的mRNA被切割的程度降低，其表达量相对升高。这可能会激活一系列与生长发育和抗病相关的基因表达，从而影响番茄对TSWV的抗性。随着侵染时间的延长，miR156的表达量持续维持在较低水平，在7天、14天和21天分别为对照组的0.4倍、0.35倍和0.3倍。这表明在整个TSWV侵染过程中，miR156表达量的下调可能持续影响着番茄的生理状态和防御反应。进一步的研究表明，这些miRNA表达谱的改变与番茄对TSWV的抗性密切相关。通过对差异表达miRNA的靶基因进行功能富集分析，发现这些靶基因主要参与植物激素信号转导、氧化还原过程、细胞壁合成与修饰等生物学过程。在TSWV侵染后，miRNA表达谱的改变可能通过调控这些生物学过程，影响番茄细胞的生理功能和代谢途径，从而改变番茄对TSWV的抗性。上调表达的miR166通过抑制HD-ZIPIII转录因子的表达，可能影响细胞壁的合成与修饰，增强细胞壁的强度，阻止病毒的进一步入侵。而miR156表达量的下调，使得SBP转录因子表达升高，可能激活植物激素信号转导通路，促进乙烯、水杨酸等抗病相关激素的合成，从而增强番茄对TSWV的抗性。4.3番茄microRNA靶基因对病毒侵染的响应4.3.1靶基因表达量的变化在黄瓜花叶病毒（CMV）侵染番茄的进程中，miR164的靶基因SlNAM3和miR159的靶基因SlMyb33的表达量呈现出显著的变化。在CMV侵染早期（3天），番茄叶片中miR164表达量迅速上调，与此同时，其靶基因SlNAM3的表达量显著下降，相较于未侵染的对照组，表达量降低了60%。这是因为miR164通过与SlNAM3mRNA的互补配对，引导RNA诱导沉默复合体（RISC）对其进行切割，从而抑制了SlNAM3的表达。随着侵染时间延长至7天，miR164的表达量虽有所下降但仍维持在较高水平，此时SlNAM3的表达量持续处于低水平，为对照组的35%。到了侵染后期（14天和21天），miR164的表达量基本恢复到对照水平，SlNAM3的表达量也逐渐回升，分别达到对照组的65%和80%。miR159的靶基因SlMyb33在CMV侵染后的表达变化也十分明显。在侵染初期（3天），miR159表达量略有下降，而SlMyb33的表达量则略有上升，为对照组的1.2倍。这可能是由于miR159对SlMyb33的抑制作用减弱，使得SlMyb33的表达得到一定程度的释放。然而，在侵染中期（7天），miR159表达量迅速上升，此时SlMyb33的表达量急剧下降，仅为对照组的0.4倍。这表明miR159对SlMyb33的负调控作用在侵染中期显著增强。到了侵染后期（14天和21天），miR159表达量逐渐回落，SlMyb33的表达量也逐渐升高，分别为对照组的0.7倍和0.85倍。不同组织中，SlNAM3和SlMyb33的表达变化也存在差异。在茎尖组织中，CMV侵染后SlNAM3的表达量在3天和7天下降幅度均大于叶片组织，在7天达到最低值，仅为对照组的20%。这表明茎尖组织对CMV侵染更为敏感，miR164对SlNAM3的抑制作用在茎尖组织中更为显著。而在根组织中，SlMyb33的表达量在CMV侵染后的变化相对较小，在3天和7天仅略有上升和下降，分别为对照组的1.1倍和0.9倍。这可能是因为根组织与地上部分的病毒侵染途径和防御机制存在差异，miR159对SlMyb33的调控作用在根组织中相对较弱。4.3.2靶基因功能与病毒侵染的关联番茄microRNA靶基因在植物防御反应、激素信号转导、代谢途径等过程中发挥着关键作用，它们与病毒侵染之间存在着紧密的联系。以miR164的靶基因SlNAM3为例，其在植物防御反应中扮演着重要角色。SlNAM3属于NAC转录因子家族，这类转录因子在植物应对生物胁迫过程中起着核心调控作用。当番茄受到黄瓜花叶病毒（CMV）侵染时，miR164表达量上调，导致SlNAM3表达量下降。SlNAM3表达量的降低会影响一系列防御相关基因的表达，从而削弱番茄的防御能力。研究表明，SlNAM3能够直接调控病程相关蛋白基因（PR基因）的表达，PR基因编码的蛋白具有抗菌、抗病毒等功能，是植物防御反应的重要组成部分。当SlNAM3表达受到抑制时，PR基因的表达量显著下降，使得番茄对CMV的抗性降低。此外，SlNAM3还参与调控植物细胞壁的合成和修饰，细胞壁是植物抵御病毒入侵的第一道防线，SlNAM3表达异常会导致细胞壁结构和功能受损，病毒更容易突破细胞壁进入细胞内部。miR159的靶基因SlMyb33在激素信号转导途径中具有重要作用。SlMyb33是一种MYB转录因子，参与赤霉素（GA）信号转导途径。在正常生长条件下，SlMyb33能够与GA信号通路中的关键元件相互作用，调控下游基因的表达，从而影响植物的生长发育。当番茄受到病毒侵染时，miR159表达量的变化会导致SlMyb33表达异常，进而干扰GA信号转导。在番茄受到烟草花叶病毒（TMV）侵染时，miR159表达量上调，SlMyb33表达量下降。这使得GA信号通路受阻，植物体内GA含量降低，影响了植物的生长和防御反应。GA不仅参与植物的生长发育过程，还在植物的抗病反应中发挥作用。GA含量的变化会影响植物体内其他激素的平衡，如生长素、水杨酸等，这些激素在植物应对病毒侵染的过程中协同作用，共同调节植物的防御反应。因此，SlMyb33表达的异常会通过影响激素信号转导，改变植物的生理状态，从而影响番茄对病毒侵染的抗性。在代谢途径方面，一些miRNA靶基因参与了番茄的碳代谢和氮代谢过程。miR399的靶基因PHO2参与磷代谢调控。当番茄受到番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）侵染时，miR399表达量发生变化，导致PHO2表达异常。PHO2的异常表达会影响磷的吸收、转运和分配，进而影响植物的生长和防御能力。磷是植物生长所必需的营养元素之一，在植物的光合作用、能量代谢和信号转导等过程中起着重要作用。TYLCV侵染导致的磷代谢紊乱，会使番茄植株生长缓慢，光合作用效率降低，从而削弱了番茄对病毒的抵抗能力。此外，一些参与碳代谢的基因也受到miRNA的调控，在病毒侵染过程中，这些基因的表达变化会影响植物的能量供应和物质合成，进一步影响番茄对病毒的响应。4.4病毒侵染对番茄microRNA-靶基因调控网络的影响4.4.1调控网络的构建在构建番茄miRNA-靶基因调控网络时，综合运用生物信息学分析和实验验证的方法，以确保网络的准确性和可靠性。通过生物信息学预测，利用psRNATarget、miRanda等软件对番茄miRNA的靶基因进行预测。这些软件依据miRNA与靶mRNA序列的互补配对原则，同时考虑热力学稳定性、靶位点的保守性等因素来筛选潜在的靶基因。在预测番茄miR164的靶基因时，psRNATarget软件通过对番茄基因组的扫描，发现了多个与miR164种子序列互补配对的基因，其中包括SlNAM1、SlNAM2和SlNAM3等NAC转录因子基因。在实验验证方面，小RNA测序和转录组测序技术发挥了重要作用。对正常生长的番茄植株以及分别感染黄瓜花叶病毒（CMV）、番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）和烟草花叶病毒（TMV）的番茄植株进行小RNA测序和转录组测序。小RNA测序能够全面鉴定番茄中的miRNA，并分析其在病毒侵染前后的表达差异。转录组测序则可以检测番茄基因的表达谱，筛选出在病毒侵染过程中差异表达的基因。通过整合小RNA测序和转录组测序数据，能够确定在病毒侵染条件下，miRNA与靶基因之间的表达相关性。对感染CMV的番茄植株进行测序分析，发现miR164在病毒侵染后表达量显著上调，而其靶基因SlNAM3的表达量则明显下降，二者呈现出显著的负相关关系。此外，还利用双荧光素酶报告基因实验、5'-RACE（5'-rapidamplificationofcDNAends）等实验进一步验证miRNA与靶基因之间的靶向关系。双荧光素酶报告基因实验能够直观地反映miRNA对靶基因表达的调控作用。将靶基因的3'-UTR序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，与miRNAmimics或inhibitor共转染到番茄原生质体中。当miRNA与靶基因3'-UTR互补配对结合时，会抑制荧光素酶的表达，导致荧光信号减弱。通过检测荧光素酶活性的变化，即可验证miRNA与靶基因之间的靶向关系。在验证miR164与SlNAM3的靶向关系时，将SlNAM3的3'-UTR插入到荧光素酶报告基因载体中，与miR164mimics共转染到番茄原生质体中，结果发现荧光素酶活性显著降低，表明miR164能够靶向调控SlNAM3的表达。5'-RACE技术则用于确定miRNA对靶mRNA的切割位点，通过扩增靶mRNA的5'端，能够直接验证miRNA与靶基因之间的切割关系。利用5'-RACE技术对SlNAM3mRNA进行扩增，结果显示在与miR164互补配对的位点处发生了切割，进一步证实了miR164与SlNAM3之间的靶向关系。通过以上生物信息学分析和实验验证的方法，成功构建了正常和病毒侵染下番茄miRNA-靶基因调控网络。在正常生长条件下，番茄miRNA-靶基因调控网络呈现出一种相对稳定的状态，各个miRNA与靶基因之间通过精确的调控关系维持着植物的正常生长发育。而在病毒侵染后，调控网络发生了显著变化，一些miRNA及其靶基因的表达水平改变，它们之间的调控关系也随之调整，形成了一个动态的响应病毒侵染的调控网络。在感染TYLCV的番茄植株中，miR159的表达量显著上调，其靶基因SlMyb33的表达量则明显下降，这种变化导致了相关信号通路的改变，从而影响了番茄对TYLCV的抗性反应。4.4.2网络变化分析通过对比正常与病毒侵染条件下番茄miRNA-靶基因调控网络中节点和边的变化，深入分析病毒对miRNA-靶基因调控关系的影响，揭示病毒侵染过程中基因调控网络的动态变化规律。在节点变化方面，病毒侵染导致番茄miRNA-靶基因调控网络中部分节点的度值发生显著改变。度值是指节点与其他节点之间连接的边的数量，反映了节点在网络中的重要性。在正常生长的番茄植株中，miR156的度值相对较高，它与多个SBP（SQUAMOSA-bindingprotein-like）转录因子基因存在靶向关系，在植物的生长发育过程中发挥着关键作用。然而，当番茄受到番茄斑萎病毒（TSWV）侵染后，miR156的度值明显下降。这是因为在TSWV侵染过程中，miR156的表达量显著下调，其对SBP转录因子基因的调控作用减弱，导致一些原本与miR156存在靶向关系的SBP转录因子基因在网络中的连接边减少。这种节点度值的变化表明，病毒侵染改变了miR156在调控网络中的地位和作用，进而影响了相关的生物学过程。SBP转录因子参与植物的多个生长发育过程以及抗病反应，miR156度值的下降可能会导致SBP转录因子表达失控，从而影响番茄对TSWV的抗性。从边的变化来看，病毒侵染使得番茄miRNA-靶基因调控网络中一些边的权重发生改变。边的权重代表了miRNA与靶基因之间调控关系的强度。以番茄受到黄瓜花叶病毒（CMV）侵染为例，在正常情况下，miR164与靶基因SlNAM3之间存在较强的负调控关系，边的权重较大。然而，在CMV侵染早期，miR164的表达量迅速上调，虽然其与SlNAM3之间仍然保持负调控关系，但边的权重进一步增大。这意味着在病毒侵染早期，miR164对SlNAM3的抑制作用显著增强。随着侵染时间的延长，到了侵染后期，miR164的表达量逐渐恢复正常，其与SlNAM3之间边的权重也随之减小，调控关系强度减弱。这种边权重的动态变化反映了在病毒侵染过程中，miRNA与靶基因之间调控关系的动态调整，以适应植物在不同侵染阶段的生理需求。在病毒侵染早期，增强miR164对SlNAM3的抑制作用可能是植物为了启动防御反应，抑制病毒的进一步侵染。而在侵染后期，随着植物对病毒侵染的适应，调控关系强度的减弱可能是为了维持植物的正常生长发育，避免过度的防御反应对植物造成损伤。通过对网络中节点和边变化的综合分析，还发现病毒侵染会导致番茄miRNA-靶基因调控网络的拓扑结构发生改变。在正常生长条件下，调控网络呈现出一定的层级结构和模块化特征，不同的模块对应着不同的生物学过程。在病毒侵染后，网络的层级结构变得更加复杂，一些新的节点和边出现，形成了新的调控模块。在感染烟草花叶病毒（TMV）的番茄植株中，原本在正常条件下不直接相连的miR168和编码热激蛋白的基因HSP70之间出现了新的连接边。进一步研究发现，在TMV侵染过程中，miR168的表达变化会影响AGO1的表达，而AGO1又与HSP70之间存在间接的调控关系，从而导致miR168与HSP70之间形成了新的联系。这种拓扑结构的改变表明，病毒侵染打破了原有的基因调控平衡，促使番茄通过重新构建调控网络来应对病毒胁迫。新形成的调控模块可能参与了番茄对病毒侵染的特异性防御反应，或者调节植物的生理代谢过程，以适应病毒侵染后的环境变化。五、讨论5.1番茄microRNA及其靶基因对病毒侵染反应的特异性与普遍性在番茄受到不同病毒侵染时，其miRNA及其靶基因的表达变化既呈现出特异性，也存在一定的普遍性。从特异性角度来看，不同病毒侵染会引发番茄体内独特的miRNA及其靶基因表达模式。在黄瓜花叶病毒（CMV）侵染番茄的进程中，miR164在侵染早期（3天）表达量迅速上调，而在烟草花叶病毒（TMV）侵染时，miR168在侵染初期（3天）表达量显著降低。这表明不同病毒侵染会激活番茄体内不同的miRNA介导的防御反应，这些miRNA通过靶向特定的靶基因，调控不同的信号通路，以应对特定病毒的入侵。这种特异性反应可能与病毒的侵染方式、基因组结构以及致病机制等因素密切相关。CMV是一种RNA病毒，主要通过蚜虫传播，其侵染可能首先激活了与蚜虫取食相关的信号通路，进而诱导mi