3.2.1基因工程及其技术（PCR）课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章基因工程第一节基因工程及其技术

——聚合酶链式反应（PCR)技术一、聚合酶链式反应（PCR）技术1．概念

目的DNA片段（目的基因）的体外扩增技术。

DNA复制的过程解旋酶双链打开DNA聚合酶3’3’5’5’3’5’以母链为模板进行碱基互补配对解旋合成子链复旋游离的脱氧核苷酸2．反应条件条件作用一定量的模板DNA引物对4中脱氧核苷酸dNTP缓冲液热稳定DNA聚合酶（Taq酶）Mg2+作为DNA复制的模板使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料提供相对稳定的pH环境催化合成DNA子链真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活（1）引物

引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA模板链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的聚合酶链式反应（PCR），需要引物是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。（2）dNTP（提供能量和原料）dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简式如下：ATCGP

~

P

~

P脱氧核糖含氮碱基磷酐键脱氧核苷酸Therewasatimewhentoamplify（扩增）DNA,Youhadtogrowtonsandtonsoftinycells.ThenalongcameaguynamedDr.KaryMullis,Saidyoucanamplifyinvitro（体外）justaswell.Justmixyourtemplate（模板）withabuffer（缓冲液）andsomeprimers（引物）Nucleotides（核苷酸）andpolymerases（聚合酶）,too.Denaturing（变性）,annealing（退火）,andextending（延伸）.Wellit’samazingwhatheatingandcoolingandheatingwilldo.PCR,whenyouneedtodetectmutations（基因突变）.PCR,whenyouneedtorecombine（基因重组）.PCR,whenyouneedtofindoutwhothedaddyis.PCR,whenyouneedtosolveacrime.中文歌词：从前你要扩增DNA，总有培养大批细胞的重任要你背。这时有个家伙叫KaryMullis博士的，他钻出来说体外合成也一样OK！只要把你的模板混上缓冲液，再加些引物，还有核苷和聚合酶。变性，退火，和延伸。加热~冷却~加热~太神奇了！当你想要检测突变，来啊做PCR吧！当你想要基因重组，来啊做PCR吧！

当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊做PCR吧!当你想要侦破大案，来啊做PCR吧！

3．反应过程阅读教材78页的PCR反应过程，结合课件给出的模板和引物，自己画出第一次循环的过程。学生活动引物1对3＇5＇3＇5＇3．反应过程（1）变性在约94℃高温下，作为模板的双链DNA解旋（变性）为两条单链DNA。（2）退火反应体系的温度降至约55℃，2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。（3）延伸反应体系的温度回升到约72℃（Taq酶催化作用的最适反应温度），4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则，在Taq酶的作用下连接到引物3′端之后，使引物链延伸，并形成互补的DNA双链。3．反应过程第3次循环；8个；2n。

仔细观察图3-1-8的聚合酶链式反应示意图，思考下列问题：（1）第几次循环后可以得到目的基因？（2）第3次循环后可以得到多少DNA片段？（3）第n次循环后可以得到多少DNA片段？学生活动项目DNA复制PCR不同点场所

酶

特点

设备

引物

产物相同点原料

复制原理

模板项目DNA复制PCR不同点场所细胞内试管中

酶解旋酶、DNA聚合酶等TaqDNA聚合酶

特点半保留半不连续全链复制半保留全连续局部区域复制

设备无严格控制温度变化的温控设备

引物RNA片段，不保留在复制的子链中DNA片段，保留在复制的子链中

产物核基因组引物界定的片段相同点原料四种脱氧核苷酸

复制原理严格遵循碱基互补配对原则

模板DNA为模板5’5’3’3’5’5’3’3’第1次5’5’5’5’3’3’3’3’第2次3’3’5’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’第3次3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’5’3’3’5’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’5’5’第4次1个3个4个1个3个4个思考讨论：复制次数123nDNA分子数含引物的DNA分子数含引物1（或2）的DNA分子数同时含引物1和2的DNA分子数消耗引物数量两条链等长的DNA分子数DNA分子种类思考讨论：复制次数123nDNA分子数含引物的DNA分子数含引物1（或2）的DNA分子数同时含引物1和2的DNA分子数消耗引物数量两条链等长的DNA分子数DNA分子种类2482n2482n1372n-10262n-226142n+1-20022n-2n2455【例1】“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有()A.8个B.6个C.4个D.2个A二、利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定（1）尝试运用PCR仪扩增DNA片段。（2）关注PCR技术的应用。（3）学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法和技术。实验目的（2）器材

PCR仪、微量取液器、PCR管、枪头等。PCR仪PCR管（3）试剂DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液。微量取液器的结构和使用方法微量取液器是一类精确移取微量液体的器具。微量取液器一般可分为两种。一种是固定容量的，常用的有100μL、200μL等多种规格。另一种是可调容量的取液器，常用的有5μL、10μL、20μL、200μL等几种。使用微量取液器时，用拇指和食指旋转取液器上部的旋钮，使数字窗口出现所需要移取溶液的体积的数字。然后，按照微量取液器的使用说明进行规范操作。技能指导（1）在0.2mLPCR管内配置50μL反应体系实验步骤所加试剂体积dNTP混合物（2.5μmol·mL-1）4μL10×PCR缓冲液5μL正向引物（10μmol·mL-1）2μL反向引物（10μmol·mL-1）2μLDNA模板1μLTaq酶1μL（1U）双蒸水35μL（2）设置程序进行扩增步骤温度作用时间①94℃预变形5min②94℃变性1min③55℃退火1min④72℃延伸2min⑤重复步骤②~④，30个循环⑥72℃延伸7~10min预变性的目的：以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率

①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。②在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢；反之，越快。

③通过凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录电泳结果。电泳鉴定实验原理（2）器材

琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外透射仪、微孔加热器（微量恒温仪）、微量取液器、PCR管、枪头等。琼脂糖凝胶电泳系统配制琼脂糖溶液制备凝胶电泳加样根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，（一般配制质量体积比0.8%～1.2%）。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂（蓝色））混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳实验步骤——琼脂糖凝胶电泳2.条数核心探讨实验步骤采用微量取液器配制PCR反应体系设置程序进行扩增配制琼脂糖凝胶液制备凝胶加样缓冲液加PCR产物电泳采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录电泳结果课堂小结1．PCR技术变性退火延伸在约94℃高温下，作为模板的双链DNA解旋（变性）为两条单链DNA。反应体系的温度降至约55℃，2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。温度回升到约72℃，4种dNTP根据碱基互补配对原则，在Taq酶的作用下连接到引物3'端，引物链延伸，形成互补的DNA双链。非编码区非编码区编码区（1）原核生物基因非编码区

组成：编码区上游与编码区下游

功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号终止子：终止RNA的合成编码区：编码蛋白质的合成一.目的基因的筛选与获取---基因的结构信使RNA启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点开始转录终止子：终止转录非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345加工mRNA前体成熟mRNA不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列编码序列=外显子12345启动子终止子一.目的基因的筛选与获取---基因的结构（2）真核生物基因转录【例2】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。(1）第1组：_______________________________