CN112469426B 噬菌体组合物和试剂盒及相关方法 （布莱阿姆青年大学）

2021.01.25PCT/US2019/0338442019.05.23WO2019/226950EN2019.11.28US2015297648A1,2015.10.22用于影响哺乳动物受试者肠道微生物组的组合物可以包含药学上可接受的载体以及大于或等于1x104PFU/mL或PFU/mg的噬菌体，所述噬肠道微生物组有关的致肥胖细菌和/或炎性细及将所述噬菌体与药学上可接受的载体按照大于或等于1x104PFU/mL或PFU/mg的量进行组合。方法可以包括在有或没有共同施用所公开的益生菌的情况下向哺乳动物受试者施用所公开的受试者的肠道微生物组中致肥胖细菌和/或炎性持代谢健康和/或支持哺乳动物受试者的肠道微22.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多种噬菌体的一种或多种以大于或等于3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述多种噬选自由以下(i)和(ii)组成的组的至3和5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述至少一对噬菌体包含第五噬菌体和第六噬6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述至少一对噬菌体包含第七噬菌体和第八噬7.根据权利要求4_6的任一项所述的组合物，其中所述多种噬菌体的一种或多种以大4[0002]本申请要求于2018年5月23日提交的题为“用于以噬菌体治疗慢性疾病的方法和[0003]本发明总体上涉及包含一种或多种噬菌体的组合物、包含所述组合物的试剂盒、以及制备所述组合物的方法和使用或施用所述组合物以影响哺乳动物受试者肠道微生物[0005]为了提高他们的生活质量，一些超重或肥胖的个体采用了限制热量的饮食和/或5[0008]这些研究和其他研究表明肠道微生物组在我们的消化和代谢健康中发挥着作[0009]该领域的大多数研究都依靠宿主之间的全粪便移植来确定生理状态与相关肠道况至少部分地由所述受试者的消化道中的一种或多种细菌的过量和/或一种或多种额外细6[0014]本公开的多个方面的组合物或其噬菌体可用于和/或有效于改变哺乳动物受试者菌体递送或配置到所述受试者的消化道或肠道微生物组中的方式向所述受试者施用所述他细菌的浓度可以有效于：增加能量和/或改善体力(stamina)、改善排便(bowelmovement)的规律性和容易性(大便较软和/或便秘频次降低/减少)、降低食欲/食物渴望、[0017]本公开的一个或多个方面(或实施方案)包括具有药学上可接受的载体和一种或多种噬菌体的组合物，所述一种或多种噬菌体以任意合适的量和/或浓度包括在所述组合组合物或其一种或多种噬菌体递送或配置到哺乳动物(优选人类)受试者的消化道或肠道等于1x104的一种或多种噬菌体，(ii)大于或等于1x104噬菌斑形成单位的一种或多种噬菌7或菌株)可以是相同细菌或不同细菌。所述多种细体。所述一种或多种噬菌体的量可以是(i)当以将所述组合物或其一种或多种噬菌体递送或配置到哺乳动物(优选人类)受试者的消化道或肠道微生物组中的方式向所述受试者施等于1x104PFU/毫克(PFU/mg)的一种或多种噬菌体。所述一种或多种噬菌体可以具有趋向菌体。所述两种或更多种噬菌体的每一种的量可以是(i)当以将所述组合物或其两种或多种噬菌体递送或配置到哺乳动物(优选人类)受试者的消化道或肠道微生物组中的方式向升(PFU/mL)的、两种或更多种噬菌体的每一种，(vmg)的、两种或更多种噬菌体的每一种。所述两种或更多种噬菌体的每一种可以具有趋向8所述两种或更多种噬菌体的每一种的趋向性可以是相似或相同的趋向性，或不同的趋向[0023]在一个方面，所述组合物包含药学上可接受的载体以及大于或等于1x106或的载体以及大于或等于1x104噬菌斑形成单位/毫mg)或其他合适的计量单位的一种或多种噬菌体，所述噬菌体具有包括与哺乳动物的肠道[0026]在另一方面，所述一种或多种噬菌体包括Optium_17、Optium_34、Optium_86、包括以下的一种或多种：大肠杆菌(Escherichiacoli)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)(也被分类为产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes))、弗氏柠檬酸杆菌9[0032]在至少一个方面，所述一种或多种噬菌体以大于或等于1x105、1x106、1x107、的细菌包括以下中的一种或多种：阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、大肠杆菌pneumoniae)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、抗坏血克吕沃尔氏菌(Kluyveraascorbata)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)或雷根斯堡约克氏菌(Yokenella(Clostridiumramosum)或沃氏嗜胆菌(Bilophilawadsworthia)中的一种或多的第四噬菌体。在前述组合物的至少一个方面，所述第一噬菌体可以包括Optimum_18、少产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)(也被分类为产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes))的趋向性的第五噬菌体、具有包括至少抗坏血克吕沃尔氏菌(Kluyveraascorbata)的趋向性的第六噬菌体、具有包括至少弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)的趋向性的第七噬菌体、和/或具有包括至少雷根斯堡约克氏菌(Yokenella所述一种或多种噬菌体具有与SEQIDNO1_19中的一个(优选SEQIDNO1_15中的一个)NO1_19中的一个(优选SEQIDNO1_15中的一个)的趋向性元件具有大于或等于80％、的基因组，确定所述一个或多个噬菌体与具有相关趋向性的第二噬菌体的相关性宿主细胞受体附着特异性和/或具有小于或等于97％的基因组序列同一性，优选小于或等[0041]本公开的试剂盒可包括组合物和益生菌和/或益生元。在所述试剂盒的至少一个方面，所述组合物包含药学上可接受的载体以及大于或等于1x104(或1x105等)PFU/mL或歧杆菌属物种(Bifidobacteriumsp.)和乳杆菌属物种(Lac(Bacteroidesfragilis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、长双歧杆菌(Lactobacilluscasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)或乳酸双歧杆菌地包括以下中的一种或多种：婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、植物乳杆菌菌(Lactobacillusbulgaricus)、乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)或粪肠球菌包括人罗斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)、嗜黏蛋白艾克曼氏菌(Akkermansia方面，所述试剂盒的益生菌可以另外地或可替代地包括毛螺菌(Lachnospiraceae)科的一杆菌(Lactobacillusreuteri)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、假儿茶双歧杆菌(Lactobacillusbrevis)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)或乳酸双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)。在至少一个方面，所施用的益生菌可以另外地或可替代地包括以下中的一种或多种：婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、德氏乳杆菌菌(Lactococcuscremoris)或粪肠球菌(Entero乳动物受试者施用所述组合物另外地或替代地促进或诱导所述哺乳动物受试者的体重减或支持所述哺乳动物受试者的消化道微生物组内的健康平[0051]图1是显示了具有以阴沟肠杆菌菌株B29定植的、用噬菌体处理了8周的肠道微生物群的小鼠与具有以阴沟肠杆菌菌株B29定植的、但未用噬菌体处理的肠道微生物群的对[0052]图2A图2I示出了来自17个个体的四周试验的结果，所述个体服用每日单剂量的(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平的图示。图2I示出了参与者的甘油三酯水平的图[0054]图4A–4I示出了显示不同的噬菌体株对阴沟肠杆菌菌株B29的溶解活性和趋向性理的肠道微生物组的小鼠与具有以阴沟肠杆菌菌株B29定植的肠道微生物组的未处理的对数值都固有地包含某些误差，所述误差必定是由它们各自的测试测量中的标准偏差引起而且还可能与整个身体的低水平炎症增加有关，这可能会损害胰岛素应答性和/或导致多[0061]从肥胖人的消化道分离出的革兰氏阴性条件致病菌阴沟肠杆菌菌株B29是移植到胖人的消化道微生物群中含量增加，并且在患有2型糖尿病的女性的消化道微生物群中的化道中变形菌门数量的药剂的组合物来调节，特别是降低消化道中变形菌门数量的策略。所述公开‘501主要关注用于降低消化道中的变形菌群的抗生素和用于进一步影响消化道在致肥胖细菌引起的体重增加相当的体重减轻。虽然体重增加与将阴沟肠杆菌菌株B29引宿主微生物组中靶向去除阴沟肠杆菌菌株B29或任何其他单一致肥胖细菌可引起或诱发体而产生有利于体重增加或其他不良影响的改变的微生物群酶(AST)水平)和/或支持消化道微生物组内的健康平衡中的一种或多种噬菌体的每一种具有狭窄的趋向性，其仅杀死细菌属和/或细菌物种的特糖耐量改善以及炎性标志物的减少。尽管不希望受任何[0070]用本发明的噬体组合物对人类受试者的治疗也显示出以下有益效果：(i)增加能包装到衣壳中以形成病毒体颗粒并优选通过裂解事件离开宿主细胞用于靶向哺乳动物消化道中单一的或狭窄范围的细菌属和/或种或菌株并降低其浓度。在Optimum_126和/或Optium_712多种噬菌体的任何一种或多种和/或发展对其的抗性之前，可将这种组合物用于靶向和杀死哺乳动物消化道中的单一或狭窄范围的细菌菌体可以各自靶向不同的单一或狭窄范围的细菌属和/或种或菌株。这种组合物可用于靶向例如哺乳动物的消化道中的多种细菌属和/或种或菌株并降低其浓度，优选地不与所述菌体可以各自对不同的单一或狭窄范围的细菌属和/或种或菌株具有趋向性，并且对优选沟肠杆菌菌株B29具有趋向性的噬菌体，并且最优选地所述噬菌体选自Optium_18、种，优选为粘质沙雷菌具有趋向性的噬菌体，更优选地所述噬菌体选自Optimum_148、属物种，优选为大肠杆菌具有趋向性的噬菌体，更优选地所述噬菌体选自Optium_212、述噬菌体组的每一个。在细菌有时间适应所述多种噬菌体的任何一种或多种和/或发展对时间适应所述多种噬菌体的任何一种或多种和/或发展对其的抗性之前，可将这种组合物用于靶向和杀死哺乳动物消化道中三个或更多个组中的每一个的靶标细菌属和/或种或菌菌体的任何一种或多种和/或发展对其的抗性之前，可将这种组合物用于靶向和杀死哺乳动物消化道中四个上述组中的每一个的靶标细菌属菌、抗坏血克吕沃尔氏菌、弗氏柠檬酸杆菌和/或雷根斯堡约克氏菌的至少一种具有趋向些实施方案中，第一噬菌体包括在第一组噬菌体中，所述第一组噬菌体包括选自由Optimum_126和Optimum_71一些实施方案中，第一噬菌体包括在第一组噬菌体中，所述第一组噬菌体包括选自由[0096]第一噬菌体和/或第一组噬菌体可以包含在具有第二噬菌体和/或第二组噬菌体[0097]在第二噬菌体和/或第二组噬菌体对肠杆菌属物种，优选阴沟肠杆菌具有趋向性Optimum_126和Optimum_712中[0098]在第二噬菌体和/或第二组噬菌体对埃希氏杆菌属物种，优选大肠杆菌具有趋向[0099]在第二噬菌体和/或第二组噬菌体对沙雷氏菌属物种，优选粘质沙雷菌具有趋向[0100]在第二噬菌体和/或第二组噬菌体对克雷伯氏菌属物种，优选克雷伯氏肺炎菌具噬菌体的每一种或每一组可以选自剩余的噬菌体组，所述剩余的噬菌体组对肠杆菌属物体，所述噬菌体包括Optium_46、Optium_116、Optium_304、Optium_356、Optium_812和[0103]在一些实施方案中，所述组合物包含选自以下的仅一种噬菌体或多种噬菌体：Optium_24、Optium_27、Optium_35、Optium_46、Optium_67、Optium_82、Optium_116、[0105]在优选的实施方案中，为了彼此具有更大遗传多样性和/或附着或感染的方式而另外选择噬菌体。用多种遗传上不同的噬体和/或具有不同附着或感染模式的噬体靶向同和/或哺乳动物和/或人类消化道(微生物组)所共有的其他宿主靶标几乎没有或没有显著或多种另外的噬菌体组合使用。所述一种或多种另外的噬菌体可以具有(i)相同或(ii)不者，所述一个或多个另外的噬菌体可以具有比所述第一噬菌体的趋向性更广泛的趋向性另外的噬菌体组合使用。所述一种或多种另外的噬菌体可以具有(i)相同或(ii)不同的广泛的趋向性(例如，对于相同的多种细菌宿主药方使用和/或施用包含标准或通用噬体鸡尾酒(或混合物)的组合物，所述噬菌体可以总体上靶向并杀死受试者消化道微生物组中可能存在的任意的多种(可能有害或不利的)细活性试验是表征鉴定的噬体的裂解活性和/或趋向性的一种方法，但是在本领域中存在和[0115]掺入本公开内容的组合物中的噬菌体优选地不具有编码可能对人造成负面影响[0116]多种实施方案的噬菌体可以包括能够感染和裂解致肥胖的、炎性的和/或其他细或治疗性蛋白。抗菌蛋白和治疗性蛋白质的实例在PCT申请公开号WO2018/174810和WO后，益生菌微生物可以在整个消化道内定植新近清除的生态位并从而提供双重有益效果：体或噬菌体鸡尾酒)的活性或引起超过任何预防或治疗效应或益处的不良副作[0123]应当理解，所公开的组合物可以包含一种或多种(药学上可接受的)载体或赋形于制备悬浮液的药学上可接受的赋形剂混合的氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨醇酐单油酸剂。[0133]应当理解，本文公开的组合物和/或制剂包含足以(总体地或单独地)实现预期效体的每个单位以产生预期的效果(例如，减少实施方案，所述组合物的剂量可包括例如大于或等于1x104PFU/mL或PFU/mg的一种或多种噬菌体的组合物。替代剂量可包括大于或等于1x105、1x106、1x107、1x108、1x109或[0137]在至少一个实施方案中，所述组合物可以作为治疗方案的一部分被施用或接所述治疗方案可包括第一治疗阶段(或期)。所述第一治疗期可以包括根据第一给药方案(dosageschedule)施用或接收的组合物的第一次给药。第一给药方案可以是例如每日给[0139]在一些实施方案中，含有一种或多种噬菌体的组合物与益生菌和/或益生元共同[0142]本公开的实施方案另外包括用于制备本文公开的组合物的工艺和用于施用所述组合物的方法以减少哺乳动物(优选人)的肠[0143]用于制备本文公开的组合物的噬菌体组分的示例性工艺包括从环境来源分离所任何细菌毒素或毒力因子或整合酶基因(这可能表明噬体可能是溶原性的)。在表征过程本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的进行了基因修饰的基因组的噬体。天然存在的噬体的基因组可以通过重组DNA技术进行修因组可以通过重组DNA技术修饰以去除例如编码细菌毒力因子(例如毒素)的核酸序列。可例如，可以通过并行、同时或按顺序以分开的剂量施用每种组分来共同施用两种组分(例可以是干燥形式或悬浮在药学上可接受的载动物受试者的这种炎症和/或炎性标记物的减少有关、促进或诱导所述哺乳动物受试者的性标记物的减少有关、促进或诱导所述哺乳动物受中和/或共同施用的益生菌中一种或多种细菌的优选食物来源，以促进该微生物种群的生小鼠与具有以阴沟肠杆菌菌株B29定植的、但未用噬菌体处理的肠道微生物群的对照小鼠(黑线)接受饮用水中的噬菌体。所述噬菌体鸡尾酒包含大于或等于1x109PFU的Optium_[0173]在第8周结束时进行口服葡萄糖耐量测试，方法是通过口服填喂法施用葡萄糖溶[0175]使用17位年龄在25至59岁之间的个体(10位男性和7位女性)进行了为期四周的测试/试验，所述个体服用单次每日剂量的噬菌体鸡尾酒。所述鸡尾酒包括大于或等于1x108PFU的Optium_12、Optium_18、Optium_38、Optium_79、Optium_125、Optium_126、酶(ALT)降低了5.3天冬氨酸氨基转移酶(AST)降低了6.4以及甘油三酯降低了[0179]参与者记录的每日跟踪数据进一步指出了与组合物施用相关的以下益处和影总体而言，76％的参与者认为使用所述噬菌体鸡尾酒会产生积极影响(24％认为中性或不[0181]用于鉴定和表征包含在组合物中以减少与哺乳动物的肠道微生物组有关的细菌钨重金属溶液合并并置于电子显微镜格栅上并通过电子显微镜[0189]电子显微镜数据可用于确定噬体形态和结构分类。已测序的噬体DNA可被用于确认缺少任何细菌毒素和/或毒力因子和/或整合酶基因，并与具有相似趋向性的其他噬体释至每毫升1x106菌落形成单位(CFU/mL)的浓度，并用滴定至浓度为1x108PFU/mL的噬体接[0194]通过将100μL包含1x109PFU/mL的各噬体溶液滴到特定靶标细菌的菌苔上并在37[0199]通过将100μL的1x109PFU/mL噬体与500μL的1x109CFU/mL细菌混合，并在37[0210]进行体内原理验证测试，以确定消化道相关的阴沟肠杆菌菌株B29的噬体处理是不同表面受体攻击其靶标的多种噬体被用于降低靶标细菌对感染产[0212