重组DNA技术的基本工具1课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章

基因工程【复习】基因的结构和功能1.基因与DNA的关系？2.基因的基本单位是什么？基因是有遗传效应的DNA片段DNA平面结构DNA立体结构CH2

HOHHHHH碱基

磷酸

5’4’3’2’1’脱氧核苷酸⑴解旋：在能量的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开。CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶DNA复制的过程⑵合成子链：DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT形成氢键DNA复制的过程CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPATP

合成方向：

子链的5'端→3'端⑵合成子链：DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。DNA复制的过程（3）形成子代DNA分子：每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT5'3'TAGCCGTATAGCCGATAT3'5'TTACGCGTATATATA5'3'DNA复制的过程问题探讨【资料1】我国是棉花的生产和消费大国，以新疆棉最为著名。在棉花种植过程中，常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。

苏云金杆菌杂交育种？同种生物之间进行诱变育种？不定向思考：能否培育出自身就能抵抗虫害的棉花呢?【资料2】苏云金杆菌有一种抗虫基因（Bt毒蛋白基因），它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。

大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染基因工程

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。（p67）主要在生物体外基因（具有遗传效应的DNA片段）DNA分子水平创造出人类需要的新的生物类型和生物产品基因重组定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限

别名：操作环境：操作对象：操作水平：结果：原理：意义：重组DNA技术有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。基因工程重组DNA技术的基本工具思考：

DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。苏云金杆菌普通棉花(无抗虫特性)抗虫基因转入植物细胞提取怎么做？“分子运输车”抗虫棉：如何获得抗虫棉?需要什么工具?含Bt抗虫蛋白将体外重组DNA分子导入受体细胞准确切割DNA分子“分子缝合针”将DNA片段连接起来通过转基因来转性状【问题1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？（拼接的基础）①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸；②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。③都遵循碱基互补配对原则。DNA立体结构DNA平面结构基因工程CH2

HOHHHHH碱基

磷酸

5’4’3’2’1’脱氧核糖【问题2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？

（表达的基础）①基因是控制生物性状的独立遗传单位。相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质，同一蛋白质在不同细胞中的功能相同。基因工程③生物界共用一套遗传密码。DNARNA蛋白质转录翻译复制②基因的表达过程相同：中心法则。重组DNA技术的基本工具1分子手术刀——限制性内切核酸酶思考：去哪里寻找能够切割DNA的“分子手术刀”？1、病毒入侵真核生物会被免疫系统攻击，细菌面对噬菌体时如何自保？(限制酶在原核细胞内的作用)噬菌体侵染细菌的电子显微镜图片2、如何理解限制性内切核酸酶命名的由来？限制外源遗传物质的扩散“内切”表明酶在DNA链内部切割（而非从末端开始）

作用于核酸，限制酶特指切割DNA的酶。原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、起防御作用。重组DNA技术的基本工具3、为什么限制性内切核酸酶不剪切细菌本身的DNA？通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。通过长期的进化，细菌DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列1分子手术刀——限制性内切核酸酶（1）来源：主要是原核生物，可人工合成（2）化学本质：蛋白质（3）种类：

数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶）（4）命名：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:____________________________。HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的（p72）。例如，一种限制酶是从大肠杆菌(Escherichiacoli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。练习：粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）中分离的第一种限制酶即_______；SmaⅠ1分子手术刀——限制性内切核酸酶（5）作用特点：能够识别

的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的

断开。5'3'5'3'TAGGTATCCA磷酸二酯键双链DNA分子磷酸二酯键酶的专一性1分子手术刀——限制性内切核酸酶（6）限制酶的识别序列：中轴线四种限制酶识别的特定序列有何特点？①大多数限制酶的识别序列由

组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。6个核苷酸②都可以找到一条中心轴线；③中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的，称为回文序列。1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（）A．GAATTCB．GGGGCCCCCTTAAG

CCCCGGGGC．CTGCAGD．CTAAATCGACGTC

GATTTAGD①实例1——EcoRⅠ限制酶切割*EcoRⅠ识别序列为GAATTC*EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键黏性末端黏性末端②实例2——SmaⅠ限制酶切割

*SmaⅠ识别序列为CCCGGG*SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键平末端DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。切口处是平整的，这样的切口叫平末端。（7）

切割结果：1分子手术刀——限制性内切核酸酶1.写出下列限制酶切割形成的末端序列BamHⅠ

EcoRⅠ__________________________

HindⅢ

BglⅡ_________________________-G-CCTAG-G-CTTAA-A-TTCGA-A-TCTAGorGATCC-G-orAATTC-G-orAGCTT-A-or

GATCT-A-1、同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？2、不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？相同。可能相同酶具有专一性，识别的序列相同（比如BamHⅠ、BglⅡ）同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的黏性末端相同2.请判断：以下黏性末端是由

种限制酶作用产生的。3可断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗2分子水。3、请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少个游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？T

T

A

AGCT

T

A

ACGA

A

T

TGC限制酶的识别位点沿中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的，称为回文序列。G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同种限制酶切割(EcoRⅠ)问题三：如何将人胰岛素基因与大肠杆菌DNA相连接?重组DNA技术的基本工具

缺口怎么办？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G来源作用差别2分子缝合针——DNA连接酶将

连接起来，恢复被限制酶切开的

。

1、作用：注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）两个DNA片段磷酸二酯键2、种类：E.coliDNA连接酶连接平末端时效率远低于T4DNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。E.coli

DNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体3.E·coliDNA连接酶的作用两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能连接起来。2分子缝合针——DNA连接酶DNA连接酶→磷酸二酯键DNA连接酶→磷酸二酯键DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA!DNA连接酶作用没有特异性。可以连接多种末端T4DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。4.T4DNA连接酶的缝合作用2分子缝合针——DNA连接酶DNA连接酶→磷酸二酯键DNA连接酶→磷酸二酯键旁栏思考（P72）：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？▲

DNA复制中DNA聚合酶发挥作用AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶只能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键。DNA聚合酶作用示意图：DNA连接酶DNA聚合酶相同作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链DNA复制、基因工程DNA复制、基因工程在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键DNA连接酶vsDNA聚合酶项目DNA连接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位作用对象作用结果磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键DNA片段DNA单个的脱氧核苷酸DNADNA将两个DNA片段连接成完整的DNA分子切割双链DNA分子将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端将双链DNA分子局部解旋为单链DNA连接酶、限制酶、DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较1.根据所学知识，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_______

B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③②a：磷酸二酯键；b：氢键④一、概念检测1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（

）A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端2.在重组DNA技术中,将外源基因送入受体细胞的载体可以是

（

）A.大肠杆菌的质粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用来识别特定基因的DNA探针C

A

磷酸二酯键DNA聚合酶的作用T4DNA连接酶可以连接互补的黏性末端，又可连接平末端2分子运输车重组DNA技术的基本工具2、怎样才能将Bt蛋白基因送入棉花细胞呢？1、能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞？

游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。Bt蛋白基因5’3’3’5’拟核DNA质粒质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。细菌结构示意图2分子运输车重组DNA技术的基本工具将

送入

，在受体细胞内对目的基因进行

。

外源基因在基因工程中使用的载体包括

等。质粒、噬菌体和动植物病毒种类用途不同点质粒、噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入各种受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别动物病毒噬菌体1.作用：

2.种类：

受体细胞大量复制真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。2分子运输车3.运载体需具备的条件：条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。条件④：对受体细胞无害。问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？问题1：载体要与目的基因连接，需要具备什么条件？供外源基因插入其中如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、荧光蛋白基因等有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。便于重组DNA筛选与鉴定DNA复制的起始位点，并带着插入的目的基因一起复制4、最常用的载体——质粒：终止子:转录的终点，在转录过程中起调控作用。启动子:

转录的起点，在转录过程中起调控作用。质粒DNA分子质量一般为拟核DNA的0.5%~3%2分子运输车

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。2分子运输车5、标记基因的筛选原理2分子运输车5、标记基因的筛选原理导入受体细胞培养加入氨苄青霉素①导入重组质粒的受体细胞存活并繁殖②导入普通载体的体细胞存活并繁殖含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒）重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低目的基因一定成功重组到质粒上了吗？无法存活存活；白色存活；蓝色2分子运输车5、标记基因的筛选原理如何提高筛选的准确性？LacZ

基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解X-gal产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。请分析下列3种大肠杆菌在含X-gal和青霉素的固体培养基上的存活情况及菌落颜色。E.coliDNA连接酶③

有一个至多个限制酶切割位点质粒、噬菌体、动植物病毒作用部位：种类DNA连接酶切开DNA分子的磷酸二酯键主要存在于原核生物中具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA连接酶①

对受体细胞无害②

能自我复制或整合到宿主DNA上。④

常有特殊的标记基因运载工具条件种类：磷酸二酯键限制酶作用部位：来源：特点：作用结果：产生黏性末端或平末端重组DNA技术的基本工具

图甲限制酶的选择技巧①不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ；②应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择EcoRⅠ或PstⅠ1、根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类2、根据质粒的特点确定限制酶的种类图乙①质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙不能选择SmaⅠ②所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端方案一：只用PstⅠ切割目的基因和质粒方案二：同时用EcoRⅠ和PstⅠ切割目的基因和质粒哪种方案更好？抗虫棉Bt抗虫蛋白苏云金杆菌取出转移思考：通过本节的学习，现在你能描述如何使用这三种工具来获得抗虫棉吗？AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…实例：

重组DNA分子的模拟操作AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…GCCGTATG…1.选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。（1）在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。（2）在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。①或②①DNA的粗提取与鉴定第3章基因工程刑侦破案DNA提取的应用基因组测序插入人胰岛素基因的大肠杆菌基因工程亲子鉴定实验设计思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。思考：

1、从哪里提取DNA？2、如何从细胞中提取DNA，有哪些困难？细胞细胞内成分复杂，且真核生物的DNA和蛋白质结合形成染色体，难以分离提纯。DNA的粗提取与鉴定1实验原理1．提取DNA的原理2．鉴定DNA的原理（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。某种蛋白质的溶解度在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。

DNA的粗提取与鉴定2材料用具1．选材猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合；鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。（1）选什么样的材料实验更易成功？（2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等DNA的粗提取与鉴定2材料用具2．试剂研磨液体积分数为95%的酒精2mol/L的NaCl溶液二苯胺试剂蒸馏水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用DNA的粗提取与鉴定DNA的粗提取与鉴定3方法步骤取材研磨过

滤DNA析出DNA鉴定问题：如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。研磨液成分作用SDSEDTATris-HCl缓冲液称取30g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。使蛋白质变性抑制DNA酶稳定DNA取材研磨DNA析出DNA鉴定破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量研磨效果好（有利于充分研磨）(4)研磨不宜太用力(1)研磨的目的：(2)研磨时间不宜太长：(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶过

滤DNA的粗提取与鉴定3方法步骤称取30g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。DNA的粗提取与鉴定3方法步骤取材研磨过

滤DNA析出DNA鉴定方法一：在漏斗中垫上

过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取

；方法二：将研磨液倒入塑料离心管中离心，取

。纱布上清液上清液问题1：过滤的纱布能用滤纸代替吗？不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。问题2：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？可能含有核蛋白、多糖等杂质DNA的粗提取与鉴定3方法步骤DNA析出DNA鉴定取材研磨过

滤问题1：此步骤的目的是？使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。问题2：酒精预冷的作用？①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。问题3：为什么搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子在上清液中加入体积相等的

溶液,静置2~3min，溶液中出现的

就是粗提取的DNA。预冷的酒精白色丝状物实验组对照组沸水浴加热DNA的粗提取与鉴定3方法步骤DNA析出DNA鉴定取材研磨过

滤加入2mol/L氯化钠溶液不加入丝状物加入4ml二苯胺试剂加入2mol/L氯化钠溶液加入丝状物加入4ml二苯胺试剂将丝状物或沉淀物溶于

溶液中，加入

试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。二苯胺2mol/L的NaCl二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。1.提取出丝状物或沉淀物一定是白