纤维素酶产生菌的分离和筛选专业大实验

纤维素酶产生菌的分离和筛选专业大实验纤维素酶产生菌的分离和筛选方案目标：从自然界采用选择性分离的方法，获得纤维素酶的高产菌株。意义：把含纤维的自然资源及纤维废料加以充分利用，转化成糖类作为食品工业和发酵工业的原料或制成优质饲料，具有深远的现实意义。1.材料与方法1.1材料与仪器1.1.1原辅料土壤品来自南阳理工学院以下各处离地表3-8cm深处泥土装入塑料瓶中，带回实验室处理。（1）新校区竹林腐叶下的土壤（2）校门口东边的松树林腐叶子下的土壤（3）青年公寓外小树林（4）2号教学楼后面花园的土壤1.1.2试剂羧甲基纤维素CMC、NaCl、MgS04·7H20、KH2P04、酵母浸粉、蛋白胨、蒸馏水、琼脂、Na2HP04、酵母膏、刚果红试剂。1.1.3仪器小铁铲和无菌纸或袋（可省）、小烧杯、100ml量筒、滤纸、漏斗、棕色试剂瓶、1000ml三角烧瓶1个、500ml三角烧瓶1个、试管24个、高压蒸汽灭菌锅、培养皿24个、36支1mm无菌吸管、无菌玻璃涂棒12支、显微镜、无菌水。1.2培养基及试剂的配制1.2.1培养基配制初筛培养基A：羧甲基纤维素CMC20g、NaCl5．0g、MgS04·7H200．2g、KH2P041．0g、酵母浸粉5.0g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH自然，121℃湿热灭菌20min。复筛培养基B：CMC10g、Na2HP041.25g、KH2P040.75g、MgSO4·7H2O0.1g、蛋白胨1.25g、酵母膏O.25g、蒸馏水500mL、琼脂10g，pH自然，121℃灭菌20min。2.2.2试剂配制1％刚果红试剂：称取刚果红试剂1g于干净的小烧杯中，用量筒量取蒸馏水100ml使之溶解，过滤，贮于棕色试剂瓶中。2.3方法2.3.1初筛的方法步骤(1)配初筛培养基A，灭菌，倒平板。(2)用稀释涂平板的方法分离纤维素分解菌。稀释涂布平板法步骤：A．倒平板将配好的琼脂培养基溶化，待冷至55—600C时，用右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶盖，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，瓶口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。B．制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、lO-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。C．涂布将上述培养基的三个平板底面或培养皿盖周边分别用记号笔写上lO-4、10-5、和10-63种稀释度字样，每种培养基每稀释度标记3皿，然后用三支1ml无菌吸管分别由lO-4、10-5、和10-6三管土壤稀释液中各吸取0．2ml对号放入已写好稀释度的平板中央位置，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5-10分钟。D．将培养基平板倒置于28℃温室中培养3日。E．将培养后长出的单个菌落分别挑取用平板画线法接种到培养基A的平面上，置28℃--29℃温室中培养，待菌苔长出后，观察水解圈情况，往培养皿中加入适量1%的刚果红溶液，染色5min，检查菌苔是否单纯可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养物。2.3.2复筛的方法步骤以水解圈直径与菌落直径的比值(D／d)作为判别指标，挑选比值大于2的菌株在复筛培养基B上以平板划线法进行分离纯化，待菌苔长出后，并再次刚果红溶液鉴别。将纯化得到的纤维素降解菌进行观察对比并记录生长情况、培养天数及菌落形态等。2.3.3检测方法A．测透明圈直径，并计算CMC酶相对活性A=d／t，式中：A为相对活性，cm／d；d为透明圈直径，cm；t为培养时间，d。B.对滤纸的分解效果测定将各菌株接种到以滤纸为唯一碳源的液体培养基中，30℃，在转速为110r／min的摇床培养5d，观察滤纸的崩解效果，以“+”的多少来表示滤纸崩溃程度，“+”越多，说明该菌株的降解效果越强。3.结果与讨论4.结论1.实验原理刚果红：在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，就无法形成刚果红-纤维素复合物，培养基中就会出现透明现象。根据透明圈的大小从而可以筛选活性高的纤维素分解菌。1、采样：即采集含菌的样品为获得纤维素酶产生菌（有木霉属菌株、中性芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌等）土样的采集要在富含纤维素的环境中进行这是因为在纤维素含量丰富的环境中通常会聚集较多的分解纤维素的微生物应采集学校树木下用于堆肥的树叶腐烂泥样及表层泥土为样品因此样品含纤维素酶产生菌取样时由于细菌绝大多数分布在距地表约3—8cm的土壤层要先除去表层土再用瓶子对土壤进行采样土壤保存时间不宜超过12小时。2、增殖培养（又称丰富培养）增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。3、纯种分离在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。4.玻璃器皿的洗涤和包装1.玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。2.灭菌前玻璃器皿的包装1培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸或牛皮纸将几套培养皿包成一包。2移液管的包扎：在移液管的上端用细铁丝塞入一小段棉花，塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约11.5cm。棉花要塞得松紧适宜，