【《山西老陈醋中多酚类物质的提取检测实验分析》6200字】

山西老陈醋中多酚类物质的提取检测实验分析目录TOC\o"1-3"\h\u18717山西老陈醋中多酚类物质的提取检测实验分析 126171.1引言 172621.2实验材料 2238011.1.1实验试剂 240221.1.2实验仪器 3196461.3实验方法 3156381.3.1山西老陈醋中多酚类物质的分离 4164311.3.2多酚提取物中总多酚含量的测定 469631.3.3多酚提取物抗氧化活性的测定 5315311.3.4GC×GC-MS法检测多酚提取物 7282641.4结果与讨论 8268031.4.1山西老陈醋中多酚类物质的分离 854981.4.2多酚提取物抗氧化活性的测定 9135931.4.3GC×GC-MS法测定多酚提取物 11147381.4.4讨论 131.1引言食醋是一种传统的发酵食品，含有多种活性物质ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1,2]。固态酿造工艺是中国传统食醋的常用制作工艺ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Liu</Author><Year>2004</Year><RecNum>538</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[3]</style></DisplayText><record><rec-number>538</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607953569">538</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Liu,Dengru</author><author>Zhu,Yang</author><author>Beeftink,Rik</author><author>Ooijkaas,Lydia</author><author>Rinzema,Arjen</author><author>Chen,Jian</author><author>Tramper,Johannes</author></authors></contributors><titles><title>ChineseVinegaranditsSolid-StateFermentationProcess</title><secondary-title>FoodReviewsInternational</secondary-title></titles><periodical><full-title>FoodReviewsInternational</full-title></periodical><pages>407-424</pages><volume>20</volume><number>4</number><section>407</section><dates><year>2004</year></dates><isbn>8755-9129 1525-6103</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1081/fri-200033460</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[3]，这个过程产生的化合物包括有机酸ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4]、糖ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Yun</Author><Year>2019</Year><RecNum>541</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[5]</style></DisplayText><record><rec-number>541</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607954496">541</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Yun,Jianmin</author><author>Zhao,Fengqin</author><author>Zhang,Wenwei</author><author>Yan,Haijiao</author><author>Zhao,Fengyun</author><author>Ai,Duiyuan</author></authors></contributors><titles><title>MonitoringthemicrobialcommunitysuccessionanddiversityofLiangzhoufumigatedvinegarduringsolid-statefermentationwithnext-generationsequencing</title><secondary-title>AnnalsofMicrobiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>AnnalsofMicrobiology</full-title></periodical><pages>279-289</pages><volume>69</volume><number>3</number><section>279</section><dates><year>2019</year></dates><isbn>1590-4261 1869-2044</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1007/s13213-018-1418-z</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[5]、蛋白质ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[6]、氨基酸ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Sánchez-Juárez</Author><Year>2019</Year><RecNum>543</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[7]</style></DisplayText><record><rec-number>543</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607954668">543</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Sánchez-Juárez,C.</author><author>Reyes-Duarte,D.</author><author>Hernández-Guerrero,M.</author><author>Morales-Ibarría,M.</author><author>Campos-Terán,J.</author><author>Arroyo-Maya,I.J.</author></authors></contributors><titles><title>α-Zeinnanoparticlesasdeliverysystemsforhydrophobiccompounds:Effectofassemblyparameters</title><secondary-title>RevistaMexicanadeIngenieríaQuímica</secondary-title></titles><periodical><full-title>RevistaMexicanadeIngenieríaQuímica</full-title></periodical><pages>803-812</pages><volume>19</volume><number>2</number><section>803</section><dates><year>2019</year></dates><isbn>1665-2738 2395-8472</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.24275/rmiq/Alim869</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[7]、多酚ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Chen</Author><Year>2015</Year><RecNum>544</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[8]</style></DisplayText><record><rec-number>544</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607954739">544</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Chen,Hengye</author><author>Zhou,Youxiang</author><author>Shao,Yanchun</author><author>Chen,Fusheng</author></authors></contributors><titles><title>FreePhenolicAcidsinShanxiAgedVinegar:ChangesDuringAgingandSynergisticAntioxidantActivities</title><secondary-title>InternationalJournalofFoodProperties</secondary-title></titles><periodical><full-title>InternationalJournalofFoodProperties</full-title></periodical><pages>1183-1193</pages><volume>19</volume><number>6</number><section>1183</section><dates><year>2015</year></dates><isbn>1094-2912 1532-2386</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1080/10942912.2015.1075216</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[8]、类黑精ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Liu</Author><Year>2016</Year><RecNum>545</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[9]</style></DisplayText><record><rec-number>545</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607954797">545</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Liu,Jiyuan</author><author>Gan,Jing</author><author>Yu,Yongjian</author><author>Zhu,Shenghu</author><author>Yin,Lijun</author><author>Cheng,Yongqiang</author></authors></contributors><titles><title>Effectoflaboratory-scaledecoctionontheantioxidativeactivityofZhenjiangAromaticVinegar:Thecontributionofmelanoidins</title><secondary-title>JournalofFunctionalFoods</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofFunctionalFoods</full-title></periodical><pages>75-86</pages><volume>21</volume><section>75</section><dates><year>2016</year></dates><isbn>17564646</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.jff.2015.11.041</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[9]以及其它营养物质和风味成分，这些物质大都具有保健和治疗作用ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Liu</Author><Year>2004</Year><RecNum>538</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[3]</style></DisplayText><record><rec-number>538</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607953569">538</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Liu,Dengru</author><author>Zhu,Yang</author><author>Beeftink,Rik</author><author>Ooijkaas,Lydia</author><author>Rinzema,Arjen</author><author>Chen,Jian</author><author>Tramper,Johannes</author></authors></contributors><titles><title>ChineseVinegaranditsSolid-StateFermentationProcess</title><secondary-title>FoodReviewsInternational</secondary-title></titles><periodical><full-title>FoodReviewsInternational</full-title></periodical><pages>407-424</pages><volume>20</volume><number>4</number><section>407</section><dates><year>2004</year></dates><isbn>8755-9129 1525-6103</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1081/fri-200033460</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[3]。多酚作为一种重要的抗氧化化合物，广泛存在于食醋中ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[10,11]。以水果为原料的传统意大利香脂醋中发现含有儿茶素、没食子酸没食子酸酯、槲皮素、肉桂酸、没食子酸和白藜芦醇等多酚类化合物ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Verzelloni</Author><Year>2007</Year><RecNum>548</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[12]</style></DisplayText><record><rec-number>548</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607955092">548</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Verzelloni,E.</author><author>Tagliazucchi,D.</author><author>Conte,A.</author></authors></contributors><titles><title>Relationshipbetweentheantioxidantpropertiesandthephenolicandflavonoidcontentintraditionalbalsamicvinegar</title><secondary-title>FoodChemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>FoodChemistry</full-title><abbr-1>FoodChem.</abbr-1><abbr-2>FoodChem</abbr-2></periodical><pages>564-571</pages><volume>105</volume><number>2</number><section>564</section><dates><year>2007</year></dates><isbn>03088146</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.foodchem.2007.04.014</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[12]。日本黑醋是固态酿造工艺酿造而成，富含二氢芥子酸和二氢阿魏酸ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[13]。山西老陈醋作为中国醋的代表，采用典型的固态发酵工艺，包括制曲、酒精发酵、醋酸发酵、熏醅、陈酿等工艺过程ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[14]。有研究表明山西老陈醋富含多种多酚类化合物，现已发现的多酚包括没食子酸、单宁酸、阿魏酸、儿茶素、槲皮素、花青素、对香豆酸和白藜芦醇等ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Ren</Author><Year>2017</Year><RecNum>551</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[15]</style></DisplayText><record><rec-number>551</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607955594">551</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Ren,M.M.</author><author>Wang,X.Y.</author><author>Tian,C.R.</author><author>Li,X.J.</author><author>Zhang,B.S.</author><author>Song,X.Z.</author><author>Zhang,J.</author></authors></contributors><auth-address>ShaanxiNormalUniv,CollFoodEngn&NutrSci,Xian710062,Shaanxi,PeoplesRChina</auth-address><titles><title>CharacterizationofOrganicAcidsandPhenolicCompoundsofCerealVinegarsandFruitVinegarsinChina</title><secondary-title>JournalofFoodProcessingandPreservation</secondary-title><alt-title>JFoodProcessPres</alt-title></titles><periodical><full-title>JournalofFoodProcessingandPreservation</full-title><abbr-1>JFoodProcessPres</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>JournalofFoodProcessingandPreservation</full-title><abbr-1>JFoodProcessPres</abbr-1></alt-periodical><volume>41</volume><number>3</number><keywords><keyword>antioxidantproperties</keyword><keyword>chromatography</keyword><keyword>fermentation</keyword><keyword>nonvolatile</keyword><keyword>profiles</keyword><keyword>volatile</keyword><keyword>wines</keyword></keywords><dates><year>2017</year><pub-dates><date>Jun</date></pub-dates></dates><isbn>0145-8892</isbn><accession-num>WOS:000405783400047</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000405783400047</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>ARTNe12937 10.1111/jfpp.12937</electronic-resource-num><language>English</language></record></Cite></EndNote>[15]。多酚类化合物已被研究证明可以预防多种疾病，如心血管疾病、肝损伤、神经退行性疾病、癌症和高血脂症等ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Samad</Author><Year>2016</Year><RecNum>552</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[16]</style></DisplayText><record><rec-number>552</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607955707">552</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Samad,Anuar</author><author>Azlan,Azrina</author><author>Ismail,Amin</author></authors></contributors><titles><title>Therapeuticeffectsofvinegar:areview</title><secondary-title>CurrentOpinioninFoodScience</secondary-title></titles><periodical><full-title>CurrentOpinioninFoodScience</full-title></periodical><pages>56-61</pages><volume>8</volume><dates><year>2016</year></dates><isbn>22147993</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.cofs.2016.03.001</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[16]。全二维气相色谱质谱联用（Comprehensivetwo-dimensionalgaschromatographymassspectrometry,GC×GC-MS）是一种功能强大的检测工具，可以分离和分析高度复杂的有机混合物ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1,2,17-19]。与传统的气相色谱质谱联用（GC-MS）相比，具有分辨率高、检出限极低以及可以识别得到未知分子的“结构化”色谱图ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[10,20-23]。最新理论和实验证明，在相同的分析时间和检测限的条件下，GC×GC-MS的检测数据量可以达到GC-MS的10倍ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[24-29]。由于GC×GC-MS具有高分辨率和高灵敏度的特点，与GC-MS和高效液相色谱（HPLC）相比，可以分析极低浓度的待测物质，且结果的准确性很高，所以可以更全面地分析提取物的成分ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[30-33]。此外，基于多酚类物质分子量小、结构相似以及食醋中的多酚类物质种类多样的特点，GC×GC-MS更适合用于食醋中多酚类物质的检测分析ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[34,35]。目前国内外对食醋的研究多停留于多酚的抗氧化活性分析层面，对食醋中多酚的研究仅关注几种多酚，并且没有将食醋中全部多酚进行提取并检测ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[36]。多酚作为醋中重要的保健成分，对多酚类化合物进行提取、检测的研究就显得尤为重要ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[37-45]。基于目前对多酚的研究现状，本章提出科学问题：山西老陈醋中的多酚类化合物如何提取？提取物中有那些具体的多酚？本章拟采用树脂分离与溶剂分级萃取技术对以谷物为原料的山西老陈醋东湖8年样品中的多酚类化合物进行提取，测定提取物的总多酚和抗氧化活性值，进一步通过GC×GC-MS法对多酚进行定性定量检测。具体步骤如下：首先通过离心法和超滤法除去山西老陈醋种大分子的杂质，之后采用D101大孔树脂特异性吸附的方法对多酚类物质进行提取，得到多酚类物质的粗提物，利用乙酸乙酯、正己烷、正丁醇三种有机溶剂对粗提物进一步的提取得到不同组分的山西老陈醋多酚提取物，对多酚提取物的总多酚，抗氧化活性等指标进行检测。并利用GC×GC-MS全二维气质联用技术分析山西老陈醋不同提取组多酚化合物的构成。1.2实验材料1.1.1实验试剂实验中所使用主要试剂见表2-1。表2-1实验中使用的主要试剂Table2-1Thereagentsusedinthisexperiment名称厂家甲基叔丁基醚国药集团化学试剂有限公司没食子酸国药集团化学试剂有限公司福林酚国药集团化学试剂有限公司山西老陈醋东湖8年山西老陈醋集团有限公司D101大孔吸附树脂上海麦克莱恩生化科技有限公司甲醇Sigma-Aldrich公司乙酸乙酯Sigma-Aldrich公司正己烷Sigma-Aldrich公司正丁醇Sigma-Aldrich公司双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）+1%三甲基氯硅烷（TMCS）国药集团化工试剂有限公司（上海）2，4，5-三羟基苯甲酸国药集团化工试剂有限公司（上海）ABTS总抗氧化能力检测试剂盒北京盒子生工科技有限公司FRAP总抗氧化能力检测试剂盒北京盒子生工科技有限公司二苯基苦基苯肼（DPPH）国药集团化学试剂有限公司（上海）1.1.2实验仪器实验中所使用主要仪器见表2-2。表2-2实验中使用的主要仪器Table2-2Theapparatusesusedinthisexperiment仪器名称厂家酶标仪（SMZ140）厦门麦克奥迪公司高速离心机（TGL-16G）上海安亭科学仪器厂冷冻干燥机（LD-101）上海安亭科学仪器厂氮吹仪（DC0910）上海安亭科学仪器厂全二维气相色谱质谱联用仪（QP2010Ultra）日本岛津TDL-8002（恒温水浴锅）天津中环公司1.3实验方法1.3.1山西老陈醋中多酚类物质的分离取10mL山西老陈醋样品，于5000r/min转速条件下离心10min，取食醋上清液。将上清液通过0.22μm孔径的超滤头过滤后，溶液以自然流速通过D101大孔吸附树脂，待所有样品流经D101大孔吸附树脂后用100mL蒸馏水冲洗D101大孔吸附树脂以除去杂质，后用50mL甲醇-甲基叔丁基醚（3：7）混合液对D101大孔吸附树脂进行洗脱，得到的洗脱液用旋蒸仪旋蒸至干后，用50mL蒸馏水复溶，然后分别用50mL乙酸乙酯、正己烷、正丁醇依次对50mL复溶液进行萃取（对应的标注为DPA，DPB，DPC），萃取结束后的剩余溶液标注为DPD，四组溶液分别蒸干。此处理步骤之后，可分别制得用于GC×GC-MS检测分析和后续细胞与动物实验及化学检测法的样品。（1）GC×GC-MS检测分析样品的制备：蒸干后的DPA，DPB和DPC中分别直接加入2mL双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS)于70℃水浴锅中隔水反应4h，反应结束后用0.22μm孔径的超滤头过滤后，密闭放于4℃冰箱中备用。具体操作流程见图2-1。图2-1多酚类物质的提取流程Fig.2-1ExtractionFlowChartofPolyphenols（2）细胞与动物实验及化学检测法样品的制备：分别用10mL蒸馏水复溶已经蒸干的DPA，DPB，DPC得到用于后续细胞和动物实验及化学检测法的样品DPA，DPB和DPC，密闭放于4℃冰箱中备用。1.3.2多酚提取物中总多酚含量的测定标准曲线的绘制：将稀释到不同浓度的标准品没食子酸溶液各200uL加入到10mL比色管中，加入0.8mL的福林酚试剂，混合均匀，反应20min，之后加入1.5mL的Na2CO3溶液，最终加去离子水定容至10mL，室温下避光环境下反应1.5h，测定反应液在765nm波长下的吸光值，横坐标是没食子酸浓度，纵坐标是相对应的吸光值，绘制没食子酸标准曲线（图2-2）。图2-2没食子酸标准曲线Fig.2-2Standardcurveofgallicacid总多酚含量的测定：多酚提取物经过稀释后取0.2mL置于10mL比色管中，然后按照上述实验步骤继续操作。同时测定空白对照组，以200uL蒸馏水代替多酚样品，其它步骤的试剂添加都与实验组一致。最后通过没食子酸标准曲线计算出提取物样品的总多酚含量，结果以mgGAE/mL表示。1.3.3多酚提取物抗氧化活性的测定（1）DPPH法测定多酚提取物的抗氧化活性在96孔板中加入0.18mLDPPH的工作液，分别加入20μL不同浓度的Trolox溶液、待测样品和空白对照PBS缓冲液，充分混合均匀之后，室温避光反应30min，在517nm处测定样品的吸光值，以横坐标Trolox浓度，纵坐标DPPH自由基清除率（%），绘制DPPH标准曲线（图2-3），按照DPPH标准曲线计算出待测样品的总抗氧化能力，结果以Trolox等值当量（TEAC）表示。自由基清除率计算公式（2-1）如下所示：自由基清除率（%）=图2-3DPPH法测定的标准曲线Fig.2-3StandardcurvemeasuredbyDPPHmethod（2）ABTS法测定多酚提取物的抗氧化活性在96孔板的检测孔中加入200μLABTS工作液，后分别加入10μL不同浓度的Trolox溶液、合适稀释倍数的待测样品和空白对照PBS缓冲液，充分吹打混匀，室温避光孵育2-6min，测定734nm处吸光度值，以Trolox浓度为横坐标，ABTS自由基清除率（%）为纵坐标，绘制标准曲线（图2-4）。按照标准曲线换算出待测样品的抗氧化能力，结果以TEAC表示。图2-4ABTS法测定的标准曲线Fig.2-4StandardcurvemeasuredbyABTSmethod（3）FRAP法测定多酚提取物的抗氧化活性按照碧云天生物工程有限公司试剂盒说明书测定，并绘制FRAP标准曲线。（图2-5）。按照标准曲线计算待测样品的总抗氧化能力，结果以Trolox等值当量（TEAC）表示。图2-5FRAP法测定的标准曲线Fig.2-5StandardcurvemeasuredbyFRAPmethod1.3.4GC×GC-MS法检测多酚提取物在正式实验前，进行了预实验，与后续实验中使用相同的GC×GC-MS条件检测山西老陈醋中的多酚提取物。发现山西老陈醋中提取的多酚类物质不含2,4,5-三羟基苯甲酸，因此将其作为内标物对山西老陈醋中的多酚类物质进行相对定量检测，在提取过程之前加入内标物（即在食醋中添加内标物），内标物的添加浓度为0.2mg/mL。GC×GC-MS检测条件:GC×GC-MS系统由气相色谱仪、快速扫描四极质谱仪(ShimadzuGCMSQP2010Ultra)和Auto-2000自动进样器组成。使用了基于加压空气的低温两级环形调制器(ZX2，美国ZOEX公司)。进样器温度为300℃，氦气作载气。一维色谱柱型号为HP-5(30m×250μm×0.25μm)毛细管柱，二维色谱柱型号为BPX-50(1.75×250μm×0.25μm)毛细管柱，两者之间用调制器连接。初始温度为100°C，以3°C/min速率升温，最终温度为301°C，总的运行时间为67min。调制周期为6s，传输线温度保持在300°C。MS的最高扫描速度为20,000amu/s，扫描范围为60-550m/z，对应的数据采集速率为33.3s−1，离子源温度200℃ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[46]。1.4结果与讨论1.4.1山西老陈醋中多酚类物质的分离山西老陈醋（SAV）中全面的多酚定性分析一直是研究的空白，对SAV中多酚类物质进行全面的解析是研究SAV功能的基础。在D101大孔吸附树脂特异性提取的基础上，继续采用有机溶剂分级萃取的方法，对粗多酚进一步的提取。总多酚的测定结果表明，SAV和山西老陈醋多酚提取物（SAVEP）的总多酚含量分别为3.265±0.278mg/mL和1.241±0.023mg/mL（图2-6），多酚的提取率为38.01%。D101大孔吸附树脂吸附后的流出液的多酚浓度测定结果为0.071±0.012mg/mL。DPA、DPB、DPC与DPD的总多酚含量分别为0.584±0.048mg/mL，0.103±0.013mg/mL，0.229±0.022mg/mL和0.011±0.001mg/mL，提取率分别为47.06%、8.30%、18.45%和0.89%，四组的总提取率为74.70%。结果表明，总多酚含量大小顺序为DPA＞DPC＞DPB，DPA的总多酚含量最高，DPD的总多酚值较小可忽略不计，因此选取DPA、DPB和DPC作为下一步实验的实验对象对其具体的多酚成分进行检测分析。图2-6多酚类化合物的分离纯化流程Fig.2-6Separationandpurificationprocessofpolyphenols1.4.2多酚提取物抗氧化活性的测定采用DPPH、ABTS和FRAP三种方法评价四种样品的总抗氧化能力。如图2-7，2-8，2-9所示，采用DPPH、ABTS和FRAP法测定样品的抗氧化活性值范围分别在0.03±0.01-1.36±0.21mmolTEACL、0.05±0.02-3.43±0.13mmolTEACL和0.02±0.01-1.06±0.06mmolTEACL之间。DPPH法测定结果中，DPA的抗氧化活性值最高，为1.36±0.21mmolTEACL，抗氧化活性值最低的是DPD为0.03±0.01mmolTEACL，四种样品的抗氧化活性值之间具有显著性差异（p<0.05）。ABTS法测定结果显示，DPA的抗氧化活性值最高，为3.43±0.13mmolTEACL，DPA与DPC之间抗氧化活性值无显著性差异（p＞0.05），但与DPB和DPD之间存在显著性差异（p<0.05）。FRAP法测定结果中，DPA的抗氧化活性值最高，为1.06±0.06mmolTEACL，DPA与其它三种样品的抗氧化活性值之间具有显著性差异（p<0.05）。结果表明，三种方法测定的样品的抗氧化活性值从高到低排列顺序均为DPA>DPC>DPB>DPD，DPA样品的抗氧化活性值均为最高，且DPPH和FRAP法测定结果中与其它样品的总抗氧化活性值相比具有显著性差异（p<0.05），DPD的抗氧化活性极低可忽略不计。表明DPA具有较强的自由基清除能力和还原能力，在四种样品中呈现出较高的抗氧化活性。图2-7DPPH法评价多酚提取物的抗氧化活性Fig.2-7DPPHmethodtoevaluatetheantioxidantactivityofpolyphenolextracts注：不同的字母表示两组之间存在显著性差异（p<0.05）。图2-8ABTS法评价多酚提取物的抗氧化活性Fig.2-8ABTSmethodtoevaluatetheantioxidantactivityofpolyphenolextracts注：不同的字母表示两组之间存在显著性差异（p<0.05）。图2-9FRAP法评价多酚提取物的抗氧化活性Fig.2-9FRAPmethodtoevaluatetheantioxidantactivityofpolyphenolextracts注：不同的字母表示两组之间存在显著性差异（p<0.05）。1.4.3GC×GC-MS法测定多酚提取物GC×GC-MS是一种色谱分离能力高、动态范围宽、检出限低的新型分析方法，适用于多酚类物质的检测分析。样品中的多酚类化合物是难挥发性化合物，因此需要衍生化步骤来获得具有挥发性和热稳定性的衍生物[13]，本研究中采用的衍生化方法的原理是，多酚类化合物苯环上连接的羟基或羧基中的氢原子被衍生化试剂中的三甲基硅基团所替代，衍生化后的多酚类化合物沸点降低，更容易挥发，这样可以更易于对其进行检测。图2-10DPA的GC×GC-MS三维总离子强度色谱图Fig.2-10GC×GC-MS3DtotalionstrengthchromatogramofDPA图2-11DPB的GC×GC-MS三维总离子强度色谱图Fig.2-11GC×GC-MS3DtotalionstrengthchromatogramofDPB图2-12DPC的GC×GC-MS三维总离子强度色谱图Fig.2-12GC×GC-MS3DtotalionstrengthchromatogramofDPCDPA中多酚类物质衍生物的三维总强度色谱图如图2-10所示。本研究显示DPA中共检测到2317个物质。通过检索NIST20数据库，共发现41种多酚类物质（见附表1），17种多酚物质是首次在食醋中被发现，首次在食醋中发现的多酚包括香草酮、4-羟基苯戊酮、5-乙酰基水杨酸、邻乙氧基苯酚、对羟基苯丙酸、对羟苯丙酮、2,6-二羟基苯乙酮、3,5-二甲氧基苯基乙烷、间羟基苯乙酸、二甲氧基苯酚、6-叔丁基-2,4-二甲基苯酚、水杨酸乙二醇、4-异丙基苯酚、2-甲基-6-叔丁基苯酚、萘酚、2-羟基-6-甲氧基苯乙酮和2,4,6-三羟基苯甲酸。检测结果中，浓度排序前8的多酚为2,3-二甲基苯酚，3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸，香兰素，香草酸，阿魏酸，异阿魏酸，4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，浓度分别为0.0459±0.04029mg/mL、0.0810±0.0173mg/mL、0.0592±0.0090mg/mL、0.0574±0.0144mg/mL、0.0425±0.0058mg/mL、0.0367±0.0024mg/mL、0.0318±0.0082mg/mL、0.0204±0.0032mg/mL。这8种多酚的种类以及浓度大小与报道中山西老陈醋中的多酚检测结果基本一致ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Xia</Author><Year>2020</Year><RecNum>562</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[22]</style></DisplayText><record><rec-number>562</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607957180">562</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Xia,Ting</author><author>Zhang,Bo</author><author>Duan,Wenhui</author><author>Zhang,Jin</author><author>Wang,Min</author></authors></contributors><titles><title>Nutrientsandbioactivecomponentsfromvinegar:Afermentedandfunctionalfood</title><secondary-title>JournalofFunctionalFoods</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofFunctionalFoods</full-title></periodical><volume>64</volume><section>103681</section><dates><year>2020</year></dates><isbn>17564646</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.jff.2019.103681</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[22]。DPB，DPC中多酚类物质的三维总离子强度色谱图如图2-11，2-12所示。结果显示，DPB和DPC中分别含有803和1906种化合物。其中多酚类物质分别为6种（附表2）和8种（附表3）。1.4.4讨论本研究中由SAV到SAVEP的多酚的提取率为38.01%，导致这一过程提取率偏低的原因可能是，总多酚值的测定采用的是福林酚比色法，此法本质是氧化还原反应，并通过测定反应液的吸光值来计算总多酚。SAV中本身含有色素、类黑精和其它成分，色素会影响吸光度值，类黑精是一类高效抗氧化剂且具有一定的网状结构，可能会与一些多酚类化合物结合，所以推测SAV的总多酚测定值实际上是偏高。SAVEP中已经将色素、类黑精和其它成分去除，所以推测这是SAVEP的提取率低的原因之一，这一研究结果与报道的基本结果一致ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Liu</Author><Year>2017</Year><RecNum>553</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[47]</style></DisplayText><record><rec-number>553</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607956052">553</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Liu,Jiyuan</author><author>Gan,Jing</author><author>Nirasawa,Satoru</author><author>Zhou,Yun</author><author>Xu,Jialu</author><author>Zhu,Shenghu</author><author>Cheng,Yongqiang</author></authors></contributors><titles><title>Cellularuptakeandtrans-enterocytetransportofphenolicsboundtovinegarmelanoidins</title><secondary-title>JournalofFunctionalFoods</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofFunctionalFoods</full-title></periodical><pages>632-640</pages><volume>37</volume><section>632</section><dates><year>2017</year></dates><isbn>17564646</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.jff.2017.08.009</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[47]。实验过程中的实验误差也是影响提取率的原因。总多酚含量值大小顺序为DPA＞DPC＞DPB＞DPD，抗氧化活性的结果同样为DPA>DPC>DPB＞DPD，这表明总多酚与抗氧化值具有正相关性，总多酚含量高抗氧化值就高，这种总多酚与抗氧化值具有相关性的结论在已报道的文献中得到印证ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[48]。本研究采用GC×GC-MS法对食醋中的多酚类物质进行分析，这是首次应用GC×GC-MS法对食醋中的多酚进行分析。发现了DPA中有41种酚类物质，17种多酚为首次在食醋中发现的多酚。DPB，DPC中分别检测到多酚类物质为6和8种。DPD因其多酚含量和抗氧化活性极低，故并未对其进行GC×GC-MS分析检测。山西老陈醋的原料为高粱、麸皮、稻壳等，原料中的多酚种类繁多ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Liu</Author><Year>2004</Year><RecNum>554</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[3]</style></DisplayText><record><rec-number>554</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607956449">554</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Liu,Dengru</author><author>Zhu,Yang</author><author>Beeftink,Rik</author><author>Ooijkaas,Lydia</author><author>Rinzema,Arjen</author><author>Chen,Jian</author><author>Tramper,Johannes</author></authors></contributors><titles><title>ChineseVinegaranditsSolid-StateFermentationProcess</title><secondary-title>FoodReviewsInternational</secondary-title></titles><periodical><full-title>FoodReviewsInternational</full-title></periodical><pages>407-424</pages><volume>20</volume><number>4</number><section>407</section><dates><year>2004</year></dates><isbn>8755-9129 1525-6103</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1081/fri-200033460</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[3]，有报道显示，仅高粱原料中就含有丁香酸、儿茶素、咖啡酸、对香豆酸和芥子酸等多种多酚ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[49-51]，麸皮、稻壳等辅料中没食子酸、阿魏酸、绿原酸、香草醛、对羟基苯甲酸的含量也比较丰富ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[52-55]。有研究报道，山西老陈醋3年陈酿中检测到香兰素、香草酸、丁香酸、儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、芥子酸和阿魏酸8种多酚，这一研究中检测出的多酚在本研究的检测结果中也检测到，与本研究的结果相符合ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Xia</Author><Year>2020</Year><RecNum>562</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[22]</style></DisplayText><record><rec-number>562</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="09rwe5atwwwe2cetfelp22x6seazx920zfwz"timestamp="1607957180">562</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Xia,Ting</author><author>Zhang,Bo</author><author>Duan,Wenhui</author><author>Zhang,Jin</author><author>Wang,Min</author></authors></contributors><titles><title>Nutrientsandbioactivecomponentsfromvinegar:Afermentedandfunctionalfood</title><secondary-title>JournalofFunctionalFoods</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofFunctionalFoods</full-title></periodical><volume>64</volume><section>103681</section><dates><year>2020</year></dates><isbn>17564646</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.jff.2019.103681</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[22]。同样是以谷物为原料的镇江香醋中也同样检测到多酚类物质的存在，赵等ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[48]人在不同陈酿年份的镇江香醋中发现了香草酸、5-羟甲基糠醛、儿茶素、对羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸等6种多酚。有报道表明，以水果为酿造原料的传统意大利香脂醋中发现含有儿茶素、没食子酸没食子酸酯、槲皮素、肉桂酸、没食子酸和白藜芦醇等6种多酚类成分ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Verzelloni</Aut