2026年肿瘤浸润淋巴细胞培养技术员岗位考试试题及答案

2026年肿瘤浸润淋巴细胞培养技术员岗位考试试题及答案一、单项选择题（每题2分，共30分）1.肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的主要来源是A.患者外周血B.肿瘤组织间质C.淋巴结转移灶D.胸腔积液答案：B2.TIL原代培养时，常用的酶消化液组合是A.0.25%胰蛋白酶+EDTAB.1mg/mLIV型胶原酶+0.1mg/mLDNA酶C.0.1%透明质酸酶+RNA酶D.2mg/mLII型胶原酶+0.5mg/mLdispase答案：B3.TIL扩增阶段，推荐的IL-2初始浓度范围是A.100-500IU/mLB.1000-3000IU/mLC.5000-10000IU/mLD.15000-20000IU/mL答案：C4.评估TIL活性的金标准检测方法是A.CCK-8增殖实验B.流式细胞术检测CD3+CD8+比例C.乳酸脱氢酶（LDH）释放实验D.实时定量PCR检测IFN-γmRNA表达答案：C5.原代TIL培养时，组织块法与酶消化法的主要区别在于A.是否需要离心收集细胞B.是否保留肿瘤微环境中的细胞间接触C.是否添加血清D.是否需要CO2培养箱答案：B6.以下哪项不是TIL培养中支原体污染的典型特征？A.培养基pH值异常波动B.细胞形态变圆、脱壁C.荧光染色可见细胞核周围点状荧光D.流式检测CD45+细胞比例显著升高答案：D7.TIL冻存时，推荐的降温速率是A.-1℃/minB.-5℃/minC.-10℃/minD.-20℃/min答案：A8.扩增期TIL培养基中添加抗CD3单抗的主要作用是A.促进细胞黏附B.激活T细胞受体信号通路C.抑制肿瘤细胞生长D.维持渗透压答案：B9.分离TIL时，PBS洗涤肿瘤组织的主要目的是A.去除红细胞B.灭活病毒C.减少血清残留D.清除坏死组织及血细胞答案：D10.以下哪种细胞表型提示TIL具有更强的抗肿瘤活性？A.CD3+CD4+CD62L+B.CD3+CD8+CD28+C.CD3+CD4+PD-1+D.CD3+CD8+TIM-3+答案：B11.TIL培养过程中，显微镜下观察到细胞呈“葡萄串样”聚集，最可能的原因是A.支原体污染B.细胞过度增殖C.IL-2浓度不足D.培养基中牛血清白蛋白（BSA）浓度过高答案：B12.检测TIL培养上清中TNF-α水平的主要目的是A.评估细胞毒性B.判断培养基营养状态C.监测炎症反应D.预测细胞扩增潜能答案：A13.原代TIL培养72小时后，若细胞贴壁率低于30%，首先应排查的因素是A.消化酶作用时间B.CO2浓度（5%vs10%）C.培养箱温度（37℃vs36℃）D.冻存复苏操作答案：A14.以下哪种物质不可用于TIL培养基的渗透压调节？A.氯化钠B.葡萄糖C.甘油D.氯化钾答案：C15.TIL回输前质量控制中，内毒素检测的标准是A.≤0.5EU/mLB.≤5EU/mLC.≤10EU/mLD.≤20EU/mL答案：A二、多项选择题（每题3分，共30分，少选、错选均不得分）1.TIL培养中，影响细胞活率的关键因素包括A.肿瘤组织采集后保存时间（<24小时）B.消化酶的类型及浓度C.离心转速（200gvs500g）D.冻存保护剂中DMSO浓度（5%vs10%）答案：ABCD2.原代TIL培养期需监测的指标有A.细胞形态（是否出现空泡、颗粒）B.培养基pH值（7.2-7.4）C.活细胞密度（≥1×105/mL）D.支原体检测（每周1次）答案：ABCD3.以下属于TIL特异性标记物的是A.TCRγδB.CD107a（LAMP-1）C.PD-1（程序性死亡受体-1）D.CD56（神经细胞黏附分子）答案：ABC4.扩增期TIL培养基更换的原则包括A.当培养基颜色变黄（pH<7.0）时立即换液B.换液时保留1/3原培养基以维持细胞因子浓度C.换液后细胞密度控制在0.5-2×106/mLD.使用37℃预热的新鲜培养基答案：BCD5.支原体污染的检测方法包括A.直接显微镜观察B.荧光染色（Hoechst33258）C.实时荧光定量PCRD.细胞培养法（指示细胞共培养）答案：BCD6.TIL冻存复苏后活力降低的可能原因有A.冻存时细胞密度过低（<5×106/mL）B.复苏时水浴温度过高（>40℃）C.冻存液中血清比例不足（<20%）D.复苏后直接使用完全培养基而非无血清培养基答案：ABC7.分离TIL时，机械法与酶消化法联合使用的优势包括A.缩短消化时间B.减少酶对细胞表面分子的破坏C.提高活细胞得率D.降低内毒素污染风险答案：AC8.以下哪些操作会导致TIL培养污染？A.超净台紫外线照射后未通风30分钟即开始操作B.培养基开封后48小时未使用C.离心管盖未完全旋紧D.操作者手套接触培养瓶外壁后直接接触瓶口答案：ABCD9.评估TIL功能活性的实验包括A.细胞周期分析（PI染色）B.胞内细胞因子染色（IFN-γ、TNF-α）C.肿瘤细胞共培养杀伤实验（CFSE/PI双染）D.端粒酶活性检测答案：BC10.TIL培养记录需包含的关键信息有A.肿瘤组织来源（手术切除/穿刺）B.消化酶批号及作用时间C.每次换液的体积及培养基批号D.细胞计数及活率（台盼蓝染色结果）答案：ABCD三、判断题（每题1分，共10分，正确填“√”，错误填“×”）1.TIL是肿瘤组织中浸润的所有免疫细胞，包括T细胞、B细胞、NK细胞。（×）（解析：TIL主要指T淋巴细胞，以CD8+T细胞为主。）2.胶原酶IV比胶原酶I更适合消化致密的肿瘤组织。（√）3.TIL原代培养时，添加10%胎牛血清（FBS）的主要作用是提供生长因子。（√）4.扩增期TIL若出现大量死亡细胞，应立即添加IL-2至20000IU/mL。（×）（解析：需先排查污染或营养不足，盲目增加IL-2可能加重代谢负担。）5.支原体污染可通过高压灭菌彻底清除。（×）（解析：支原体无细胞壁，高压灭菌无法完全灭活，需使用专用清除试剂。）6.TIL冻存时，DMSO的作用是降低细胞内冰晶形成。（√）7.流式检测TIL表型时，CD3+细胞比例应≥80%才符合回输标准。（√）8.原代培养瓶选择透气盖（ventcap）的目的是提高氧气交换效率。（√）9.培养基中添加HEPES缓冲液的主要目的是替代CO2维持pH。（×）（解析：HEPES辅助CO2缓冲系统，不能完全替代。）10.TIL回输前需检测细胞中肿瘤细胞残留，标准为≤0.1%。（√）四、简答题（每题6分，共30分）1.简述TIL分离的主要操作步骤。答案：（1）肿瘤组织预处理：无菌条件下去除坏死组织、脂肪及血管，PBS洗涤3次；（2）组织切割：用眼科剪将组织剪至1-2mm3小块；（3）酶消化：加入含IV型胶原酶（1mg/mL）、DNA酶（0.1mg/mL）的消化液，37℃振荡消化60-90分钟；（4）终止消化：加入含10%FBS的培养基终止酶活性；（5）过滤离心：用100μm细胞筛过滤，150g离心5分钟收集细胞；（6）洗涤：PBS重悬细胞，重复离心洗涤2次；（7）分离纯化：通过密度梯度离心（如Ficoll）去除死细胞及肿瘤细胞，收集界面层TIL。2.原代TIL培养期的质量控制指标有哪些？答案：（1）细胞活率：台盼蓝染色检测，应≥70%；（2）细胞形态：光学显微镜下观察，正常TIL呈圆形或短梭形，胞质均匀，无空泡或颗粒；（3）贴壁率：培养48小时后贴壁细胞比例应≥50%（组织块法）或≥30%（酶消化法）；（4）污染检测：支原体（PCR/荧光染色）、细菌（革兰染色）、真菌（显微镜观察）均应为阴性；（5）表型初筛：流式检测CD3+细胞比例应≥60%。3.扩增期TIL细胞形态观察的要点及异常情况的可能原因。答案：观察要点：（1）细胞大小：正常TIL直径8-12μm，过度活化时可增大至15-20μm；（2）聚集状态：对数生长期可见少量细胞团（2-5个/团），过度聚集（>10个/团）提示增殖过旺或营养不足；（3）胞质特征：正常胞质透亮，出现颗粒（可能为溶酶体）或空泡（提示损伤）为异常；（4）悬浮状态：TIL以悬浮为主，若大量贴壁可能是成纤维细胞污染。异常原因：（1）细胞变小、皱缩：可能为营养缺乏（如葡萄糖耗尽）或IL-2浓度不足；（2）大量空泡：可能是支原体污染或冻存损伤；（3）贴壁细胞增多：成纤维细胞或肿瘤细胞残留。4.简述TIL培养中支原体污染的处理流程。答案：（1）确认污染：通过PCR或荧光染色验证支原体阳性；（2）隔离培养物：立即将污染细胞转移至独立区域，避免交叉污染；（3）清除污染：a.使用支原体清除试剂（如M-Plasmacidal），按说明书浓度添加至培养基，处理5-7天；b.处理期间每2天换液，避免试剂累积毒性；（4）验证清除效果：处理后连续2周检测（每周1次）支原体阴性；（5）追溯污染源：检查培养基、血清、消化酶等耗材批次，更换可疑试剂；（6）环境消毒：超净台用75%酒精擦拭，紫外照射2小时，培养箱用10%次氯酸钠清洁。5.TIL冻存复苏时，如何操作以提高细胞活力？答案：冻存操作：（1）细胞状态：选择对数生长期（活率≥90%）的TIL，密度调整为5-10×106/mL；（2）冻存液配制：含10%DMSO、50%FBS、40%基础培养基（如RPMI-1640），现用现配；（3）降温程序：使用程序降温盒（-1℃/min），先置-80℃冰箱24小时，再转移至液氮长期保存；复苏操作：（1）快速解冻：从液氮取出冻存管，37℃水浴振荡至残留1-2mm冰晶；（2）稀释保护剂：将细胞悬液缓慢加入10倍体积预温的培养基中（1mL/min），避免渗透压骤变；（3）离心洗涤：150g离心5分钟，弃上清，用完全培养基重悬；（4）培养条件：复苏后24小时内避免换液，添加高浓度IL-2（5000IU/mL）促进恢复。五、案例分析题（每题10分，共20分）案例1：某技术员在进行TIL原代培养时，发现培养48小时后细胞活率仅55%（目标≥70%），显微镜下可见大量细胞碎片，培养基颜色无明显变化（pH7.3）。请分析可能原因及解决措施。答案：可能原因：（1）消化过度：胶原酶作用时间过长（>90分钟）或浓度过高（>1mg/mL），导致TIL膜表面分子破坏；（2）组织保存不当：肿瘤组织采集后未及时处理（>24小时），或保存温度过高（>4℃）导致细胞自溶；（3）离心损伤：离心转速过高（>300g）或时间过长（>10分钟），引起细胞机械性损伤；（4）培养基问题：FBS批次变化（如含有细胞毒性物质）或培养基过期（营养成分降解）。解决措施：（1）优化消化条件：缩短消化时间至60分钟，或降低胶原酶浓度至0.8mg/mL；（2）规范组织处理：采集后立即置于4℃含抗生素的PBS中，2小时内开始分离；（3）调整离心参数：改为150g离心5分钟，减少细胞损伤；（4）验证培养基：使用前做预实验（用已知活性的细胞测试培养基支持能力），更换可疑批次FBS。案例2：某批次TIL扩增至第10天时，细胞增殖倍数仅为初始的8倍（目标≥15倍），流式检测CD3+CD8+比例为45%（目标≥60%），IL-2浓度已维持在8000IU/mL。请分析可能原因及改进方案。答案：可能原因：（1）初始TIL质量差：原代培养时CD8+细胞比例低（<50%），导致扩增潜能不足；（2）共刺激信号缺失：培养基中未添加抗CD28单抗（需与抗CD3单抗联合激活T细胞）；（3）抑制性微环境残留：原代培养时未彻底清除肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）或调节性T细胞（Treg，CD4+CD25+Foxp3+）；（4）营养限制：葡萄糖（<2g/L）或谷氨酰胺（<2mM）耗尽，未及时补加；（5）