CN112714795B 酶促rna加帽方法 （新英格兰生物实验室公司）

2021.02.10PCT/US2020/0475332020.08.21WO2021/041267EN2021.03.04US2013042334A1,2013.02.14US2017253911A1,2017.09.07US2018237817A1,2018.08.23uniprot.A0A142BZT8•A0A142BZT8_9VIRU.本文提供了在体外有效地对RNA加帽的方变体在高温下进行加帽反应。在其它实施方式如浮病病毒(Faustovirus)、拟菌病毒或姆姆病2使(ii)由根据SEQIDNO:7的氨基酸序列组成的RNA加帽酶或由根据SEQIDNO:20的氨在37℃60℃的温度下接触以形成加帽的目标N7甲基转移酶(N7MTase)活性的单链RNA2.权利要求1所述的方法，其中所述未加帽的目标RNA在3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中接触进一5.权利要求1所述的方法，进一步包括利用固相寡核苷酸合成化学合成所述未加帽的6.权利要求1所述的方法，进一步包括通过使编码所述未加帽的目标RNA的DNA模板与聚合酶接触合成所述未加帽的目标RNA来产生所述N7甲基转移酶(N7MTase)活性并且由根据SEQIDNO:7的氨基酸序列组成，或由根据SEQIDNO:20的氨基酸序列组成的RNA加帽酶融312.根据权利要求11所述的方法，进一步包括用RNaseH切割所述加帽的目标RNA以形使N7甲基转移酶(N7MTase)活性并且由根据SEQIDNO:7的氨基酸序列组成，或由根据SEQIDNO:20的氨基酸序列组成的RNA加帽酶融在23℃60℃的温度下接触30分钟以形成加帽的目标呤N7甲基转移酶(N7MTase)活性并且由根据SEQIDNO:具有RNA三磷酸酯酶(TPase)、鸟苷酸转移酶(GTase)和鸟嘌呤一N7甲基转移酶(N7MTase)活性的RNA加帽酶融合物，其中所述RNA加帽酶融合物在存储缓冲剂中并且由根21.权利要求20所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含噬菌体聚合酶和核糖核苷4[0002]本申请要求2019年8月23日提交的美国临时申请号62/890,821(在此通过引用以[0003]向未加帽的合成RNA中加入帽对于许多真核细胞中蛋白质的有效表达是重要的。此外，未加帽的RNA(至少具有5’_三磷酸的RNA)据报道激活先天免疫反应(Pichlmair等,Science2006314:997_1001；Diamond等,Cytokine&GrowthFactorReviews,201425:中，将诸如反转录帽类似物(ARCA)的帽类似物和加帽的二核苷酸加入到体外转录反应中。一条RNA序列到另一条RNA序列变化，这一差异通常归因于RNA结构(参见，例如Fuchs,诸如浮病病毒(Faustovirus)、拟菌病毒(Mimivirus)或姆姆病毒(Moumouvirus)的巨大病5同一性)的氨基酸序列。来自浮病病毒(Faustovirus)的RNA加帽酶(其为单链RNA加帽酶的[0009]在一些实施方式中，未加帽的目标RNA在长度上可以是至少200nt(例如，至少℃_60℃)下接触并将温度升高或降低(例如，至37℃_60℃)，其中第二温度不同于第一温持续1到120分钟。在一些实施方式中，加帽方法可在[0011]可利用固相寡核苷酸合成化学或通过在体外转录反应中使用聚合酶(例如，T7[0012]在任意实施方式中，接触可进一步包括接触SAM和/或帽2’O甲基转移酶(2’(z)SEQIDNO:4至少90％同一性的氨基酸[0015]还提供了试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒可包含：具有TPase、GTase和N76SEQIDNO:3、和/或(z)SEQIDNO:4至少90％同一性的氨基酸序列，或(b)与(xNO:5和/或(y)SEQIDNO:6至少90％同一性的氨基酸序列。单链RNA加帽酶可包括与NO:12)的RNA加帽酶至少90％同一性的氨基酸序列。[0016]在一些实施方式中，RNA加帽酶可具有与SEQIDNO:20至少90％同一性的氨基酸同一性的氨基酸序列，和(b)与SEQIDNO:20的位置1419至1587至少90％同一性的氨基酸实验中使用的150ntRNA的核糖核苷酸序列为：GGGAGUCUUCGCCGAGAGGGCCAUCGCCAGUUGCCGCAACCUGUGGGAAUUUCUCUUCCAGUUUAUCCGGAUGCUCAACGGUGACUUUAAUUCCGGUAUCUUUCUCGAAUUU被命名为Fausto_CR_01、Fausto_CR_03和Fausto_CR_05。指示了H3C2加帽酶(即TPase、GTase和N7MTase)的功能结构[0022]图6显示了在映射到YP_007354410(多噬棘阿米巴(Acanthanomebapolyphaga)姆7姆病毒加帽酶；moumouCE(SEQIDNO:12)的多噬棘阿米巴拟菌病毒(AAV50651，SEQIDNO:11)和多噬棘阿米巴姆姆病毒加帽酶氨基酸序列之间表现出90％或更高序列同一性的保守区域。这些保守区域被命名为moumou_CR_03(SEQIDNO:6)和moumou_CR_04(SEQIDNO:7)。在该比对中，在所比对序列上方用虚线指示了moumou_CE(即TPase、GTase和N7[0023]图7显示了在45℃下进行的RNA加帽反应促进发夹RNA的有效加帽。在37℃(白色帽缓冲剂(50mMTris_HCl,5mMKCl,1mMMgCl2,1mMDTT,pH8)中的0.5mMGTP和0.1mM于计算在每种条件下的加帽分数。将计算值对酶浓度作图并拟合为修正的希尔方程(HillRNA外)更有效地加帽。在10μL1xRNA加帽缓冲剂(50mMTris_HCl,5mMKCl,1mMMgCl2,1mMDTT,pH8)中的0.5mMGTP和0.1mMSAM的存在下，将100nMH3C2或VCE与500nMcluc生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)切割所限定的5’片段，并使用AMpureXP珠(BeckmanCoulter,印第安纳波利斯,印第安纳州)和链霉亲和素Dynabeads(赛默飞世尔LLC(纽镇,宾夕法尼亚州)使用高分辨率LC/MS工作流程执行。利用加帽和未加帽种属奇,马萨诸塞州)的存在下，使5μM化学合成的帽_025ntRNA(m7Gppp25聚进行一锅酶促反应比在37℃下生成更多的帽_1(Cap_1)结构R8[0028]图12显示了使用商业可获得的酶和推荐的反应温度对1.7kbfluc转录物的一步指示的组分于37℃进行反应1小时(详见实施例7)。使用量子比特(Qubit)RNABR试剂盒测[0029]图13显示了使用高浓度H3C2加帽酶和升高温度合成加帽的fluc转录物的一步方RNA加帽缓冲剂(50mMTris一HCl,5mMKCl,1mMMgCl2,1mMDTT,pH8)中的0.5mMGTP和和H3C2分别生成68.4％或100％m7Gppp加帽的含有假尿苷的cluc/A120转录物。显而易见转移酶和500nMH3C2的500μL反应中，在45℃下将总共250pmol(145μg)的约1800ntcluc/被测量为与未加帽的cluc/A120转录物相比的用加帽的cluc/A120转录物所转染的HEK293[0035]图19显示了多个温度步骤可以提高单容器加帽的RNA合成的转录输出和加帽效9克列诺(Klenow)填充(fill_in)和尿素PAGE法估计加帽分数。对显示最高加帽分数的样品录输出在与VCE或H3C2配合时于45℃达到峰值，反映了的反应条件的修改可进一步提高m7G加帽的转录物的转录(WorthPublishers,纽约,1975)；Strachan和ReadApproach(牛津大学出版社,纽约,1991)；Gait,编者,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach(IRL出版社,牛津,1984)；Singleton等,DictionaryofMicrobiologyandMolecularbiology,第二版,JohnWiley和Sons,纽约(1994),以及Hale&Markham,theHarperCollinsDictionaryofBiology,HarperPerennial,N.Y.Ramanathan,NucleicAcidsRes.201644:7511–7526中评述的)，这取决于加帽反应中存过肽键彼此直接连接或通过肽连接体连接的两种蛋白质或两种蛋白质(dsDNA)模板被DNA引导的RNA聚合酶(通常是噬菌体聚合酶)复制以产生包含从模板复制的(SEQIDNO:7)、FaustovirusE12(SEQIDNO:8)、FaustovirusST1(SEQIDNO:9)、或醚键以及其它键)而在其二级、三级、或四级结构方面不同于 合物可在以下一个或多个方面不同于天然存在的组合物：(a)具有在自然界中未结合的成分，(b)具有在自然界中未发现的浓度的组分，(c)省略了以其他方式在天然存在的组合物用以与好似每个单独的出版物、专利、或专利申请通过引用而具体且单独所示并入的程度相同的程度并入本文中。本相同序列的目标RNA分子的混合物。通过体外转录产生的转录物和通过固相合成产生的发现的非标准核苷酸)。来自细胞的RNA的制剂包含具有不同序列的天然存在的RNA分子的酸序列(即，与天然存在的蛋白质的氨基酸序列具一性的氨基酸序列。SEQIDNO:1的VCE在45℃下比在37℃下显著更具活性(参见下面的图2以及表1和表2)——如图1中所示)具有二级结构的未加帽的RNA寡核苷酸。这种RNA在37℃下用VCE加帽效率很地将帽结构添加到未加帽的RNA目标。该方法的这些实施方式对于具有或预测具有二级结[0059]该方法的其它实施方式部分基于以下发现：来自faustovirusD5b的RNA加帽酶于在45℃下有效地向体外转录的RNA添加帽。例如，与在37℃下相比，在45℃下使用少于faustovirusD5b(H3C2)的量的三十分之一(1/30)就可产生相同量的加帽产物(参见表6)。二级结构的未加帽的RNA寡核苷酸。这种RNA在37℃下用faustovirusD5b(H3C2)加帽效率很低(参见图9)。也对来自阿米巴的其它巨大病毒的加帽酶，包括faustovirusST1、加帽的RNA目标。方法的这些实施方式对于具有或预测具有二级结构的RNA(如在体外转录[0062]在一些实施方式中，反应混合物中未加帽的RNA可通过固相寡核苷酸合成化学制加帽的RNA可在无细胞体外转录(IVT)反应中制备，其中在所转录区域上游含有RNA聚合酶启动子(例如T7、T3或SP6启动子)的双链DNA模板被的RNA样品包含单一种属的RNA(合成的寡核苷酸或转录物)。此外，反应混合物可以不含入可通过在体内向对象给予RNA产物来完成。RNA产物所导入的细胞可以离体存在(作为组级合成，multigramsynthesis)的经济高效且流线型的方式来合成大量均匀加帽的mRNA拌或混合的情况下可以物理和/或化学地相互作用。接触可包括将一个项目放置成直接接触或接近另一个项目和/或维持允许或有利于这两个项目相互接触的条件和任选地存在或不存在SAM的情况下接触。核苷三磷酸(NTP)可包括未修饰的ATP、修饰的包括使目标RNA与脱帽酶接触以去除现有的帽和/或确保其未预先存在的目标RNA加帽和/或合成并对目标RNIDNO:5或6至少90％同一性的氨基[0077]所有试剂均可从新英格兰生物实验室(伊普斯威奇,马萨诸塞州)和/或指定供应[0079]在10μL1×RNA加帽缓冲剂(50mMTris_HCl,5mMKCl,1mMMgCl2,1mMDTT,pH8.0)中0.5mMGTP和0.1mMSAM的存在下，在23℃至65℃范围内的温度下将10nM纯化的而H3C2在50℃和55℃下保持了比VCE更所示，在30分钟内分别于37℃、45℃、50℃或55℃下将50％的0.5μmppp_RNA1转变为的酶可在30分钟内分别于37℃、45℃、50℃或55℃下将50％的ppp_RNA1转变为m7Gppp_[0086]在体外条件下，来自faustovirusD5b(登录号AMN83561)的纯化的RNA定的直向同源物。发现来自其它faustovirus株和相关巨大病毒多噬棘阿米巴拟菌病毒和多噬棘阿米巴姆姆病毒的假定的RNA加帽酶的基因产物在高达55_60℃的RNA加帽中具有活PCR&DNA清理试剂盒(cleanupkit)(新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)纯化示的Genbank登录号的基因产物(图4A_4E)的PURExpress反应产物用于RNA加帽测定。简而言之，在冰上组装由1×RNA加帽缓冲剂(50mMTris_HCl,5mMKCl,1mMMgCl2,1mMDTT,pH姆病毒加帽酶(Genbank登录号YP_007354410；泳道6)在高达55℃的温度下加帽了150聚物Fausto_CR_01在H3C2的TPase结构域内跨越60个氨基酸。Fausto_CR_03在鸟苷N7甲基转移酶结构域的N_端跨越111个氨基酸。Fausto_CR_05在H3C2的鸟苷N7甲基转移酶结构域的C_FDKLKPDGEITTTMRVSNADGMAREITFGGGVKTGEMFVKKQNICVFDVVDIFSYKVAVS(SEQIDNO:2)。Fausto_CR_03的氨基酸序列(其对应于H3C2序列的氨基酸537_647)是GFYGNNYKIASDIYLNYIDVFNFDDLWKYNPGYFEKNKSDIYIAPNKYRRYLIKSLFNKYIKNAKWVIDAAAGRGADLHLYKAECVENLLAID基酸778_873)是KYSIKRLYDSDKLTKTGQKIAVLLPMSGEMKEEPLCNIKNIISMARKMGLDLVESANFSV[0094]图6显示了各种FaustovirusRNA加帽酶序列的比对，显示了保守结构域以及[0095]序列比对分析还显示了两个67个氨基酸或111个氨基酸长的区域在高达55℃具有活性的多噬棘阿米巴拟菌病毒和多噬棘阿米巴姆姆病毒RNA加帽酶之间表现出90％或更高的序列同一性(图7)。保守区moumou_CR_03(其对应于姆姆病毒序列的氨基酸576_642)在03的氨基酸序列是INDNTVVEFIFDNFKIDMDDPYKWIPIRTRYDKTESVQKYHKKYGNNLHIANRIWKTITNPITEDII(SEQIDNO:5)。moumou_CR_04的氨基酸序列是YYQKNTSNAAGMRAFNNFIKSNMITTYCKDGDKVLDIGCGRGGDLIKFIHAGIEEYVGIDIDNNGLYVINDSAFNRYKNLKKTIKNIPPMTFI[0101]图8显示了拟菌病毒和moumou病毒序列的比对，显示了保守结构域以及TPase、[0103]图1所示的短RNA如本文所描述被设计用于评估加帽效率。对照RNA(RNA1)被设计具有7.2kcal/mol或在45℃下具有5.4kcal/mol的理论解折叠的最小自由能(MFE)录产生RNA。对于加帽反应，在10μL1×RNA加帽缓冲剂(50mMTris一HCl,5mMKCl,1mMMgCl2,1mMDTT,pH8.0)中0.5mMGTP和0.1mMSAM的存在下，将50nMH3C2或VCE37℃下，VCE只能对80％的RNA1加帽。在45℃下，VCE对100％的RNA1和RNA2和大约60％的[0105]通过用T7RNA聚合酶体外转录产生了含有萤火虫萤光素酶基因(flucfluc)的的目标寡聚物(TO)添加到各加帽反应中，然后在80℃下对加帽反应加热30s以使加帽酶失堡,马萨诸塞州)扫描仪利用Cy2通道扫描。将加帽的带和未加帽的带的强度标准化为同一下的帽50值分别是33.6nM和0.96nM。对于VCE，37℃或45℃下的帽50值分别是103nM和[0110]为了显示在其它长RNA分子上可以实现温度增强的加帽效率，利用海萤属(cypridina)萤光素酶(cluc；1823nt)和囊性纤维化跨膜受体(CFTR；4712nt)的体外转录或45℃下温育30分钟。在2.5μM的目标寡聚物(由5’脱氧核苷酸和3’核糖核苷言之，将100μL的RNaseH切割反应添加到200μL的AMpureXP珠中并在室温下温育5分钟。然后将珠置于磁场中，并取回澄清的上清液并将其添加至得自200μL珠悬浮液的预清理的200μLDynabeads8MyOne链霉亲和素C1的预清理的珠中。在用200μL洗涤缓冲剂(5mM脱缓冲剂(1mM生物素,5mMTris,pH7.5,0.1MNRNA加帽的程度通过加帽和未加帽的RNA种属的质量强[0111]如图11中所示，H3C2和VCE两者在45℃下均比在37℃下对clucRNA和CFTRRNA表下预热含有5μM化学合成的帽一0RNA1(25nt)和20μL1×RNA加帽5mMKCl,1mMMgCl2,1mMDTT,pH8.0)中的200μMSAM的反应1分钟，之后添加100U的痘苗行30分钟，然后通过在70℃下加热10分钟使反应停止。使用寡聚物清理和浓缩试剂盒诸塞州)在含有核苷消化混合物反应缓冲剂(50mM乙酸钠,pH5.4,1mMZnCl2)的20μL反应中于37℃下温育1小时来使纯化的RNA消化成核苷和帽结构。然后用Agilent1290加帽缓冲剂(50mMTris一HCl,5mMKCl,1mMMgCl2,1mMDTT,pH8.0)的40μL反应中50nM室；目录号M2080)和5U/μl的痘苗mRNA帽2’O甲基转移酶(新英格兰生物实验室；目录号M0366)。当使用T7RNA聚合酶时，反应包含1×T7RNA聚合酶缓冲剂(40mMTris一HCl,pHRNA聚合酶缓冲剂(40mMTris_HCl,pH7.9,60mMNaCl,1mMDTT,2mM亚精胺)。用19mMMgCl2和这是T7RNA聚合酶和痘苗加帽酶的推荐反应加到含有1×DNaseI反应缓冲剂(10mMTris_HCl,pH7.6,2.5mMMgCl2,0.5mMCaCl2)和添加FAM标记的核苷酸。简而言之，收回5μL的RNaseH反应并添加到含有2×NEBuffer2、0.5mMdATP、0.05mMFAM_12_dCTP(PerkinElmer)和0.25U/μLDNA聚合酶I大(Klenow(克列诺反应并将其添加到8μL的2×RNA荷载染料(新英格兰生物实验室)中。然后通过尿素_后通过使用XP珠(赛默飞)的尺寸选择，并且随后使用链霉亲和素磁珠进行选择来纯化克列诺(Klenow)反应产物(RNaseH_切割产物仍然退火到脱硫生物素化的切割反应中，然后将该切割反应添加到100然后将珠置于磁铁旁于室温下2分钟。将澄清的上清液添加到得自50μLDynabeads8MyOne链霉亲和素C1(赛默飞)的预清理的珠中。在用50μL低盐洗涤缓冲剂(5mMTris,pH(AppliedBiosystems)3130xl基因分析仪(16毛细管阵列)或应用生物系统3730xl基因分析仪(96毛细管阵列)上通过毛细管电泳分析洗脱的RNA。使用PeakScanner软件(赛默飞世来看，作为目前体外mRNA合成(即RNA合成后进行mRNA加帽)的标准的酶试剂和反应条件不[0124]由于实施例7A的试剂和条件在体外一步反应中对于产生因此测试了新的酶和反应条件对体外一步加帽的RNA合成进行合成的能力。图13显示了在37℃或45℃下使用高浓度H3C2加帽酶[0125]在37℃下，0.5μM的H3C2加用0.5μMVCE或H3C2加帽酶结合5U/μLT7RNA聚合酶或甲基化G帽结构。[0134]制备融合构建体以产生由通过假定的柔性连接体序列(SEQIDNO:20)连接的CTP各5mM以及0.1mMSAM补充的1×T7RNA聚合酶缓冲剂中，如实施例7中指示的对1.7kb将反应进行1小时。如实施例7中指示的，测量并分析RNA得率和加帽与未加帽的转录的分转录输出从当仅存在T7RNA聚合酶时(条3)的0.45μg/μL降低到当添加H3C2时的0.39μg/μ[0139]在假尿苷三磷酸(Trilink生物技术)或未修饰的尿苷三磷酸(新英格兰生物实验室公司)的存在下，利用使用T7RNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)的体外转录合成编×RNA加帽缓冲剂(50mMTris一HCl,5mMKCl,1mMMgCl2,1mMDTT,pH8)中0.5mMGTP和录物并使加帽酶失活并缓慢冷却到室温。将热稳定RNaseH(新英格兰生物实验室公司)以有假尿苷的cluc/A120转录物加帽[0141]总共250pmol(145μg)的约1800ntcluc/A120体外转录物在含有1×RNA加帽缓冲(赛默飞)估计RNA浓度。加帽的cluc/A120转录物的翻译效率被测量为来自用加帽的cluc/A120转录物相对于未加帽的cluc/A120转录物转染的HEK293细胞的相对萤光素酶活性。用脂质转染胺信使最大转染试剂(LipofectamineMessengerMaxtransfectionreagent)萤属萤光素酶测定试剂盒(新英格兰生物萤光素酶活性。萤光是用伯托科技(Bertholdtechnologies)的CentroLB960微板发光计[0002]<110>新英格兰生物实验室公司[0003]<120>酶促RNA加帽方法[0004]<130>NEB_423[0005]<150>62/890,821[0006]<151>2019_08_23[0008]<170>PatentIn版本3.5[0012]<213>痘苗病毒[0014]<221>各式各样的_特征(misc_feature)[0015]<223>FLVCE加帽酶；>YP_232988.1mRNA加帽酶的大亚单位MetAspAlaAsnValValSerSerSerThrAlaThrTyrAsp15AlaLeuAlaLysAsnAlaSerGluLeuGluGlnArgSerThrAlaTyrGluAsnAsnGluLeuGluLeuValPheLysProProLeu4045ThrLeuThrAsnValValAsnSerThrGlnGluSerPheArgPheThrValThrAsnLysGluGlyValLysArgThrLysProLeuSerLysValHisGlyLeuAspValLysAsnValGlnLeuValAspAlaAspAsnValTrpGluLysLysSerLeuValThrGluAsnArgLeuHisLysGluCysLeuLeuArgLeuSerThrGluGluArgHisPheLeuAspTyrLysLysTyrGlySerSerArgLeuGluLeuValAsnLeuGlnAlaLysThrLysAsnPheThrAspPheLysLeuLysTyrPheLeuGlySerGlyAlaGlnSerLysSerSerLeuLeuHisAlaAsnHisProLysSerArgProAsnThrSerLeuGluGluPheThrProArgAspAsnGluThrValProTyrAspGluLeu200205Lys210GluLeuThrThrLeu215SerArgHisPhe220MetAlaSerProGlu225AsnValLeuSer230ProProAsnAla235ProLysThrPhe240MetLeuProLysGln245AspValGlyLeu250AspLeuGluAsnLeu255TyrAlaValThrLys260ThrAspGlyPro265ThrArgVal270ThrSerAsnGlyLeu275TyrCysTyrPheThr280HisLeuGlyTyr285ArgTyrProVal290LysArgAsp295SerGluValValValPheGlyGluAlaValLysAspLysAsnTrpThrValTyrLeuLysLeuGluProValAsnAlaAsnAspArgLeuGluGluSerLysTyrValGluSerLysLeuValAspCysAspArgValPheLysSerLysLysTyrGluGlyProPheThrThrThrSerGluValValAspMetLeuSerThrTyrLeuProLysGlnProGluGlyValLeuPheTyrSerLysGlyProLysSerAsnAspPheLysLysLysGluAsnThrAsp400GlnThrAlaAsnVal405ValPheArgTyrMet410SerSerGluPro415PheGlyGluSer420SerPheValGlu425TyrLysLysPheSer430AsnAspLysGlyPhe435ProLysGluTyrGly440SerGlyLysVal445LeuTyrAsnGlyVal450AsnTyrLeuAsnAsn455TyrCysLeuGlu460TyrAsnThrHis465AsnGluValGly470LysSerValValVal475ProLysPhe480AlaGluPheLeuVal485AsnGlyGluLeu490LysProArgAsp495LysThrMetLysTyrAsnSerGluAspTyrTyrGlyAsnGlnHisAsnValGluHisLeuArgAspGlnSerLysGlyAspPheAsnGluAspLysLeuSerAspValGlyHisGlnTyrAlaAsnAsnAspLysPheArgLeuAsnProGluValSerTyrPheThrAsnLysArgThrArgGlyProLeuGlyLeuSerAsnTyrValLysThrLeuLeuSerMetTyrCysSerLysThrPheLeuAspAspSerAsnLysArgLysValLeuAlaAspPheGlyAsnGlyAlaAspLeuGluLysTyr600605PheTyrGlyGluAlaLeuLeuValAlaThrAspProAspAlaAsp610615620AlaAlaArgGlyAsnGluArgTyrAsnLysLeuAsnSerGly625630635640LysThrLysTyrTyrLysPheAspTyrGlnGluThrArgSer645650655AspThrPheValSerSerValArgGluValPheTyrPheGlyLysPhe660665670AsnAspTrpGlnPheAlaHisTyrSerPheHisProArg675680685HisTyrAlaThrValMetAsnAsnLeuSerGluLeuThrAlaSerGly690695GlyLysValLeuThrThrMetAspGlyAspLysLeuSerLysLeuThrAspLysLysThrPheHisLysAsnLeuProSerSerGluAsnTyrMetSerValGluLysAlaAspAspArgValValTyrAsnProSerThrMetSerThrProMetThrGluTyrLysLysAsnAspValArgValPheAsnGluTyrGlyPheValLeuValAspAsnValAspPheAlaThrGluArgSerLysLysPheAsn800GlyAlaSerThrMetGluAspArgProSerThrArgAsnPhePheGlu805810815LeuAsnArgGlyAlaLysCysGluGlyLeuAspValGluAspLeu820825830LeuSerTyrTyrValValTyrValPheSerLysArg835840<210>2<211>60<212>PRT[0128]<221>各式各样的_特征（MISC_F[0129]<223>Fausto_CR_01PheAspLysLeuLysProAspGlyGluThrThrThrMetArgValSerAsnAlaAspGlyMetAlaArgGluThrPheGlyGlyGlyValLysThrGlyGluMetPheValLysLysGlnAsnCysValPheAsp45ValValAspIlePheSerTyrLysValAlaValSer<210>3<212>PRT<220><223>Fausto_CR_03<400>3GlyPheTyrGlyAsnAsnTyrLysIleAlaSerAspTyrLeuAsnTyrIleAspValPheAsnPheAspAspLeuTrpLysTyrAsnProGlyTyrPheGluLysAsnLysSerAspIleTyrAlaProAsnLysTyr45ArgArgTyrLeuIleLysSerLeuPheAsnLysTyrLysAsnAlaLysTrpValIleAspAlaAlaAlaGlyArgGlyAlaAspLeuHisLeuTyrLysAlaGluCysValGluAsnLeuLeuAlaAspAspProThrAlaIleSerGluLeuIleArgArgArgAsnGluThrGly<210>4<211>60<212>PRT<213>浮病病毒(Faustovirus)<220><221>各式各样的特征(MISCFEATURE)[0167]<223>Fausto_CR_05LysTyrSerIleLysArgLeuTyrAspSerAspLysLeuThrLysThrGlyGlnLysIleAlaValLeuLeuProMetSerGlyGluMetLysGluGluProLeuCysAsnIleLysAsnIleMetAlaArgLysMet45GlyLeuAspLeuValGluSerAlaAsnPheSerVal<210>5<211>67<212>PRT<213>拟菌病毒(Mimivirus)<220><221>各式各样的_特征(MISC_FEATURE)<223>5:mimi_CR_03<400>5IleAsnAspAsnThrValValGluPheAspAsnPheLysAspMetAspAspProTyrLysTrpIleArgThrArgTyrAspLysThrGluSerValGlnLysTyrHisLysLysTyrGlyAsnAsnLeu45HisIleAlaAsnArgIleTrpLysThrAsnProGlu<210>6<212>PRT<213>拟菌病毒<220><221>各式各样的_特征<223>mimi_CR_04<400>6TyrTyrGlnLysAsnThrSerAsnAlaAlaGlyMetArgAlaPheAsnAsnPheIleLysSerAsnMetIleThrThrTyrCysLysAspGlyAspLysValLeuAspIleGlyCysGlyArgGlyGlyAspLeuPhe45IleHisAlaGlyIleGluGluTyrValGlyIleAspAspAsnAsnGlyLeuTyrValIleAsnAspAlaSerPheAsnArgTyrAlaSerLysAsnLeuLysLysThrIleLysAsnIleProProMetThrPheIleProProAsnAlaAspAlaArgGlyLeuPheAsnLeuGluAlaGlnGluLysIleGluAlaLeuPro<210>7<211>873<212>PRT<213>浮病病毒(Faustovirus)<220><221>各式各样的_特征<223>浮病病毒D5bRNA加帽酶Genbank登录号AMN83561<400>7MetAlaLysArgLeuGlnArgGlnCysAspValAsnGlnGlnCysValCysGluIleTyrAsnSerLysGlyGlyGlyGluLeuGluLeuGlyArgPheAspLysLeuProGlnAsnLeuPheAlaGlyValPheAspLysAlaGlyLeuLysPro404540AspGlyGluIleGlnThrThrArgMetValSerAsnArgArgMetAspGlyValAlaArgGluIleThrPheGlyGlyGlyValLysThrAsnGlyGlyGluPheValLysLysGlnAsnIleCysPheValAspValValAspPheValPheSerTyrLysValAlaValSerThrGluGluThrValValGluGluGluLysProThrMetGluThrThrAlaGlyValPheArgLysIleArgLeuPheArgSerValGluAspValValLysAspTrpArgAspLeuThrAlaValAspLysThrAlaGluLeuGlyLysIleAlaGlnThrHisAlaSerIleValThrHisGlnArgThrPheProAspAsnLeuLeuLysThrLeuGlyAlaGluValThrLeuAlaLysLeuAlaAlaAspSerTyrGluLeuGluLeuGluTyrThrGlyGluLeuLysSerProAlaThrAsnGluLysValAsnAlaValAlaLysTyrAlaAlaValValGluLeu200205200LeuSerSerValArgAsnAlaAsnSerThrAlaAlaAlaAsnSerSerPheGly210215220Glu225SerValSerAspLeu230CysArgValAlaLys235HisThrHis240GluTyrAlaAsnVal245ValCysArgThrPro250SerPheLysMetLeu255LeuProGlnValVal260SerLeuThrLysSer265SerTyrTyrGlyGly270LeuTyrProProGlu275AsnLeuTrpLeuAla280GlyLysThrAspGly285ValArgAlaLeuVal290ValCysGluAspGly295ValAlaLysValThrAlaGluSerValAspThrHisGlyValCysSerAlaThrThrLeuAspCysGluLeuAsnValAspAlaLysLeuTyrValPheAspValSerAsnAsnThrGlnValTyrThrGlnProPheSerThrArgThrThrAspSerAspLysAspGlyTyrLysGluMetLysProPheValLysValValLysAlaAspGluAlaThrPheLysSerAlaTyrLysAlaProHisAsnGluGlyLeuMetGluAspGlyAla400AlaTyrAlaAlaThr405LysThrTyrLysTrp410LysProLeuSerHis415AsnThrAspPhe420LeuLysAlaCys425ProLysGlnLeu430AsnValAspProTyr435LysProArgAlaGly440TyrLysLeuTrpLeu445LeuPheThrThr450SerLeuAspGlnGln455ArgGluLeuGly460GluPheProAla465TrpLysLeuPhe470ThrAspAsnMet475PheGlySerArgVal480ProGlnPheGln485ProAlaAsnPro490LeuAlaTyrValCys495TyrLeuProGluAspValAsnValAsnAspGlyAspValGluMetArgAlaValAspGlyTyrAspThrProLysTrpGluLeuValArgSerArgAsnAspArgLysAsnGluProGlyPheTyrGlyAsnAsnTyrLysAlaSerAspTyrLeuAsnTyrAspValPheHisPheGluLeuAspLeuTyrLysTyrAsnProGlyTyrPheGluLysAsnLysSerAspTyrTyrValAlaProAsnLysTyrArgArgTyrLeuLysSerLeuPheGlyPheArgTyrLeuArgAspAla600LysTrpValAsp605AlaAlaAlaArg610Arg610GlyAlaAspLeuHis615LeuTyrLysAlaGlu620CysValGluHisLeuLeuLeu625AlaAsp630AspProThrAla635SerGluLeuValArg640ArgArgArgAsnGlu645ThrGlyTyrAsnLys650SerHisArgGlyGly655ArgMetAsnMetHisSer660HisArgGlyGlnSer665HisCysAlaLysSer670ThrSerLeuHisLeuAla675LeuValAlaAspLeu680ArgGluAsnProAsp685ValLeuProLysPro690GlnSerArg695ProHisGluArgCysTyrAspAlaValValAsnPheAlaHisTyrLeuCysAspThrAspGluHisArgAspArgPheLeuThrValSerArgLeuLeuAlaProAsnGlyValPhePhePheThrThrMetAspGlyGluSerValLysLeuLeuAlaHisAspHisLysValArgProGlyGluAlaTrpThrHisThrGlyAspAsnValAsnSerProAspSerThrValProLysTyrSerArgArgLeuTyrTyrSerAspLysLeuThrLysThrGlyGlnGlnGluValLeu800ProLeuProMetSerGly805GluMetLysAlaGlu810ProLeuCysAsn815LysAsnAsnSer820MetAlaArgLysMet825GlyLeuAspLeuVal830GluSerAsnAlaAsnPhe835SerValLeuTyrGlu840AlaTyrAlaArgAsp845TyrProAsp850AlaArgMetThrPro855AspAspLysLeuTyr860AsnAspLeuHisThrTyr865AlaValPheLys870ArgLysLys<210>8[0338]<213>浮病病毒(Faustovirus)[0340]<221>各式各样的_特征[0341]<223>浮病病毒E12RNA加帽酶;Genbank登录号MetArgArgValPheAsnSerAlaLysLysGlnGlnArgCysAspSer15ValGluGlnValCysGluPheTyrAsnAlaAspAsnLysThrAsnGluLeuGluLeuArgPheAspLysLeuAsnArgGluLeuPheValValLeu4045PheAspLysLeuLysProAspGlyGluThrThrThrMetArgValSerAsnAlaAspGlyMetAlaArgGluThrPheGlyGlyGlyValLysThrGlyGluMetPheValLysLysGlnAsnCysValPheAspValValAspValPheSerTyrLysValAlaValSerSerGluAspGluLysAspLysProLysMetAspThrAsnAlaSerValArgPheLysArgLeuSerCysAspThrLeuProAspTrpArgAspLeuThrAlaValLysValAlaAspLeuGlyLysAlaGlnHisThrSerThrValValLeuGlnThrPheProGluAsnLeuLeuArgMetLysGlyAlaGluValAlaAlaLeuAlaThrAsnSerTyrGluLeuGluLeuGluTyrGlyLysSerAlaAlaSerLysGluLysValLeuAlaAlaAla200205GluTyrAlaMetGluLeuLeuThrAsnSerArgAsnAlaSerPro210215220AlaAlaAlaThrLeuGlyGluSerValSerAspCysArgAla225230235240LysLeuHisProAlaGluTyrAlaAsnValCysArgThrPro245250255SerPheLysAsnLeuLeuProGlnValSerLeuThrLysSerSer260265270TyrTyrGly275GlyTyrProPro280ValAspMetTyr285AlaGlyLysThrAsp290GlyValArgAlaLeu295ValLeuCysGluAsnGlyValAlaLysThrAlaThrThrValAspThrThrThrValGlyAsnThrProThrLeuAspCysGluLeuSerThrSerGlyHisAsnGlyAlaThrAspAsnLysHisLeuTyrPheAspValMetAsnArgGlyValHisSerHisArgGluGlyPheAsnLysArgAspAspLeuSerAspLeuThrProAlaGlyTyrThrLeuGluLeuLysProPheThrLysLeuValAspAlaAlaSerValAsnGluThrThrPheLysSerVal400PheLysProProHis405AsnGluGlyLeuVal410LeuValGluSerGly415ProProTyrAlaLeu420ThrLysThrTyrLys425TrpLysProThr430HisAsnThrAsp435PheLeuLysAla440CysProLysGlnLeu445AsnValAspPro450PheLysProArgAsn455GlyHisAspLeuTrp460LeuLeuPheThrThr465SerLeuAspGln470GlnArgGluLeuGly475AspLeuPro480AlaTrpLysLeuLeu485PheThrAspValAsn490LeuPheGlyAsnLys495ProGlnPheMetProAlaAsnProLeuAlaTyrCysTyrLeuProSerSerThrGlyValAsnAspGlyAspValGluMetArgAlaValAspGlyPheAspGlyProThrTrpGluLeuValArgThrArgProAspArgLysAspGluArgGlyPheTyrGlyAsnAsnTyrLysAlaSerAspTyrLeuAsnTyrAspValPheAsnPheAspAspLeuTrpLysTyrAsnProGlyTyrPheGluLysAsnLysSerAspTyrAlaProAsnLysTyr600ArgArgTyrLeu605LysSerLeuPheAsnLysTyrLysAsnAlaLysTrpValAspAlaAlaAla610615620GlyArgGlyAlaAspLeuHisLeuTyrLysGlnGluCysValGluAsn625630635640LeuLeuAlaAspAspProThrAlaSerGluLeuArg645650655ArgArgAsnGluThrGlyTrpGlnGlnArgGlyArgGlyGlyAsn660665670ThrArgHisAsnAlaArgHisAsnThrHisCysAlaSerSerThrSer675680685LeuHisAlaLeuValAlaAspLeuArgThrGluProAsnMetLeu690695ProLysGlnSerArgProProGluArgGlyTyrAspAlaValIleAsnPheAlaHisTyrLeuCysGluThrAspAspTyrArgAsnPheLeuThrValSerArgLeuLeuAlaProAspGlyValPheThrThrMetAspGlyGluAlaValAsnLeuLeuAlaGluHisLysValAlaProGlyAlaSerTrpValValHisThrAspGlyAsnAlaAsnAlaThrAspAlaAsnValValLysTyrSerLysArg800LeuTyrAspSerAspLysLeuThrLysThrGlyGlnLysAlaVal805810815LeuLeuProMetSerGlyGluMetArgGluGluProLeuCysAsn820825830LysAsnValS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