CN112752854A 用于通过肿瘤分数和覆盖率调整肿瘤突变负荷的方法和系统 （夸登特健康公司）

PCT/US2019/042882201WO2020/023420EN2020.01用于通过肿瘤分数和覆盖率调整肿瘤突变本文提供了用于检测受试者的肿瘤突变负中的核酸获得的序列信息确定观察到的突变计数，并确定肿瘤分数和/或核酸的覆盖率以生成下确定预期突变分数和/或预期突变分数的预期而检测受试者的TMB。其他方面涉及选择用于治2(a)根据从来自所述受试者的样品中的一种或更多种核酸获得的序列信息确定观察到(c)在给定所述测序参数的情况下确定预期突变分数和/或所述预期突变分数的预期(d)在给定所述预期结果的情况下调整所述观察到的突变计数以生成调整的结果，从(f)在给定所述测序参数的情况下确定预期突变分数和/或所述预期突变分数的预期(g)在给定所述预期结果的情况下调整所述观察到的突变计数以生成调整的结果，从(a)根据从来自所述受试者的样品中的一种或更多种核酸获得的序列信息确定观察到(c)在给定所述测序参数的情况下确定预期突变分数和/或所述预期突变分数的预期及(e)将所述调整的结果与用一种或更多种治疗索引的一个或更多个比较器结果进行比(a)根据从来自所述受试者的样品中的一种或更多种核酸获得的序列信息确定观察到(c)在给定所述测序参数的情况下确定预期突变分数和/或所述预期突变分数的预期(e)将所述调整的结果与用一种或更多种治疗索引的一个或更多个比较器结果进行比(f)当所述调整的结果与所述比较器结果之间实质匹配时，向所述受试者施用至少一35.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所(a)根据从来自所述受试者的样品中的一种或更多种核酸获得的序列信息确定观察到(c)在给定所述测序参数的情况下确定预期突变分数和/或所述预期突变分数的预期(e)将所述调整的结果与用一种或更多种治疗索引的一个或更多个比较器结果进行比(f)当所述调整的结果和所述比较器结果之间实质匹配时，为所述受试者鉴定一种或6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述观察到的突变计数和/或所述肿7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述观察到的突变计数和/或所述肿8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述观察到的突变计数和/或所述肿9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括使用低于给定单核苷酸变体(SNV)或给定插入或缺失(indel)的检测极限的一个或更多个可能突变的汇集证据来确定所述观察10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括使用所述预期突变分数作为实际突12.根据权利要求11所述的方法，其中所述观察到的突变计数排除了一个或更多个已13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括将所述序列信息与一个或更多个参14.根据权利要求13所述的方法，其中所述参考序列至少包含hg19和/或hg38的子序15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤分数包括在所述核酸中鉴16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤分数低于所述样品中所有17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括鉴定所述核酸中包含给定核苷酸位18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括鉴定所述核酸中包含给定核苷酸位419.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述样品中存在的所述核酸中的20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括使用所述预期突变分数的95％置信23.根据权利要求22所述的方法，包括将预期24.根据权利要求22或23所述的方法，其中使用以下二项式比例置信区间来计算预期和其中f是调用的突变的预期分数，n_true是预期的实际观察到的突变分数=28.根据前述权利要求中任一项所述的方30.根据权利要求28或29所述的方法，其中在31.根据权利要求28一30中任一项所述的方法32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括将所述观察到的突变计数除以所述533.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调整的结果包括在一系列突变34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括将所述观察到的突变计数除以所述35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调整的结果包括最高可能实际36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调整的结果包括最低可能实际37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调整的结果包括调整的突变计38.根据权利要求37所述的方法，其中所述调整的突变计数大于或等于所述观察到的39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括从来自所述受试者的样品中的核酸41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述靶向区段包含约1和约100,000个之间52.根据权利要求42_51中任一项所述的方法，其中所述核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)53.根据权利要求42_52中任一项所657.根据权利要求3_5中任一项所述的方法，60.根据权利要求57_59中任一项所述的方法，其61.根据权利要求57_60中任一项所述的方法，其62.根据权利要求3_5中任一项所述的方法，63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述序列信息包括由核酸测序仪生65.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在测序之前选择性地富66.根据权利要求65所述的方法，所述方法还包括在测序之前扩增选择性地富集的区67.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述序列信息从所述核酸的靶向区69.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在测序之前将一个或更772.根据权利要求69所述的方法，其中所述衔接子包含2个和1,000,000个之间的分子73.根据权利要求69所述的方法，包括将包含分子条形码的衔接子随机附接到核酸的74.根据权利要求69所述的方法，其中所述衔接子通过平末端连接或粘性端连接附接76.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述序列读段分组为77.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法的至少一部分是计算机实78.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括生成提供一个或更多个79.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述样品分类为TMB_80.根据前述方法权利要求中任一项所述的方法81.一种表征来自患有癌症或怀疑患有癌症的受试者的无细胞核酸分子样品的方法，83.根据权利要求139所述的方法，所述方法还84.根据权利要求139所述的方法，所述方法还包有来自所述至少100、200、300、400或500个基因的区段的探针富集对应于所述至少100、85.一种用于分析来自患有癌症或怀疑患有癌症的受试86.一种至少部分地使用计算机生成新抗原_孤儿免疫受体信息的方法，所述方法包(a)通过所述计算机接收从获自被诊断患有癌症的受试者的血液样品中的核酸获得的888.根据权利要求87所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用所述一种或更多89.根据权利要求86所述的方法，包括鉴定所述序列信息的第一部分中的一种或更多91.根据权利要求89所述的方法，所述方法还包括在所述序列信息的第二部分中鉴定一种或更多种其他变体以确定所述TMB评分，其中所述其他变体包含来源于所述血液样品92.一种分析来自被诊断患有癌症的受试者的血液样品中的多于一种分析物的方法，(a)分离所述血液样品中无细胞核酸(cfNA)的第一集合和来自所述血液样品中的一种(c)对所述cfNA的第一集合的一个或更多个区域和所述富集的核酸的第二集合的一个更多种新抗原孤儿免疫受体，从而分析来自被诊断患有癌症的所述受试者的血液样品中93.一种至少部分地使用计算机分析来自受试者的血液样品中的核酸的方法，所述方(a)通过所述计算机接收从来自所述受试者的血液样品中的核酸获得的序列信息，其中所述序列信息的至少第一部分包括从所述血液样品中的无细胞核酸(cfNA)获得的测序(b)鉴定所述序列信息的所述第一部分中的一种或更多种变体和所述序列信息的所述9(ii)确定所述序列信息的所述第一部分中的肿瘤分数和/或至少cfNA的覆盖率以生成(iii)在给定所述测序参数的情况下确定预期突变分数和/或所述预期突变分数的预(i)从所述序列信息的第一部分和/或所述序列信息的第二部分定量存在于多于一个(ii)当给定重复核酸位点的位点评分超过所述给定重复核酸位点的位点特异性训练(iii)当所述重复核酸不稳定性评分超过所述血液样品中重复核酸位点群体的群体训(i)从所述序列信息的第一部分和/或所述序列信息的第二部分定量存在于多于一个(iii)当给定的重复DNA位点的位点评分超过所述给定的重复DNA位点的位点特异性训(iv)当所述重复DNA不稳定性评分超过所述血液样品中重复DNA位点群体的群体训练(i)从所述序列信息的第一部分和/或所述序列信息的第二部分定量存在于多于一个(iii)当给定的微卫星位点的位点评分超过给定的微卫星位点的位点特异性训练阈值(iv)当所述微卫星不稳定性评分超过所述血液样品中微卫星位点群体的群体训练阈中对应于所述序列可变靶区域组的cfDNA分子以比对应于所述表观遗传靶区域组的cfDNA102.根据权利要求93所述的方法，包括从所述血液样品的血浆级分或血清级分获得(i)接收从获自被诊断患有癌症的受试者的血液样品中的核酸获得的序列信息，其中所述序列信息的至少第一部分包括从所述血液样品中的无细胞核酸(cfNA)获得的测序读(iv)将所述TMB评分与所述一种或更多种克隆型相关联，以鉴定所述受试者中的一种[0002]本申请要求以下美国临时专利申请的权益并基于其提交日期：2018年7月23日提交的第62/702,280号；2018年10月5日提交的第62/741,770号；2018年12月20日提取的DNA来检测。但最近已经提出，癌症还可以根据体液诸如血液或尿液中的无细胞核酸[0008]TMB是肿瘤基因组中由肿瘤细胞携带的突变的量度。TMB是一种类型的生物标志[0010]本申请公开了可用于确定和分析患者样品中的肿瘤突变负荷(TMB)并有助于指导施本文公开的调整方法和相关方面之前，对照样品中的平均突变计数通常取决于最大MAF包括：(a)根据从来自受试者的样品中的一种或更多种核酸获得的序列信息确定观察到的给定测序参数的情况下确定预期突变分数和/或预期突变分数的预期分布，以生成预期结整的结果与用一种或更多种治疗索引的一个或更多个比较器结果(comparatorresult)进从来自受试者的样品中的一种或更多种核酸获得的序列信息确定观察到的突变计数；(b)行了鉴定：(a)根据从来自受试者的样品中的一种或更多种核酸获得的序列信息确定观察或更多种治疗索引的一个或更多个比较器结果进行比较；以及(f)当调整的结果和比较器[0017]在一些实施方案中，观察到的突变计数和/或肿瘤分数包括核酸中鉴定的许多同或肿瘤分数包括选自由以下组成的组的许多突变：单核苷酸变体(SNV)、插入或缺失[0018]在一些实施方案中，该方法包括使用低于给定单核苷酸变体(SNV)或给定插入或缺失(indel)的检测极限的一个或更多个可能突变的汇集证据来[0020]在一些实施方案中，该方法包括将序列信息与一个或更多个参位基因分数(MAF)。在一些实施方案中，肿瘤分数低于样品中所有核酸的约0.05％、约[0023]在一些实施方案中，该方法包括鉴定核酸中包含给定核苷酸位置的许多独特的[0025]在一些实施方案中，预期突变分数和/或预期突变分数的预期分布包括突变分数[0026]在一些实施方案中，该方法包括计算在预期突变等位基因分数(MAF)分布中鉴定[0031]观察到的突变分数=[0033]在一些实施方案中，相对MAF的预期分布从对照样品数据集的一个或更多个数据于所考虑的给定癌症类型的外显子组校准因子和外显子组突变率从具有该癌症类型的样疗包括至少一种检查点抑制剂抗体。在一些实施方案中，免疫治疗包括针对以下的抗体：(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性髓单核细胞白血病给定测序参数的情况下确定预期突变分数和/或预期突变分数的预期分布，以生成预期结用一种或更多种治疗索引的一个或更多个比较器结果，并且其中电子处理(v)将调整的结果与一个或更多个比较器结果进行比较，其中调整的结制备组件被配置为将一个或更多个包含分子条转移组件被配置成在至少核酸测序仪和样品制备组件之中的一种或更多种核酸获得的序列信息确定观察到的突变计数；(ii)确定肿瘤分数和/或一些实施方案中，例如，观察到的突变计数和/或肿瘤分数包括核酸中鉴定的许多同义突的检测极限的一个或更多个可能突变的汇集证据突变计数和/或肿瘤分数包括在核酸中鉴定的许多体细胞突变。在这些实施方案中的一些核苷酸位置的独特无细胞DNA(cfDNA)分子的中值数目来确定覆盖率。在一些实施方案中，[0060]在一些实施方案中，预期突变分数和/或预期突变分数的预期分布包括突变分数[0065]在某些实施方案中，MAF的预期分布从在至少一个对照样品数据集中观察到的相的结果包括在一系列突变等位基因分数在核酸中检测到的许多突变。在一些实施方案中，于所考虑的给定癌症类型的外显子组校准因子和外显子组突变率从具有该癌症类型的样括：(i)根据从来自受试者的样品中的一种或更多种核酸获得的序列信息确定观察到的突[0072]在一些实施方案中，观察到的突变计数和/或肿瘤分数不包括小于最大MAF的约[0073]在一些实施方案中，突变计数在包含表2中列出的基因的一组基因或基因组区域法和相关方面通常包括为样品生成TMB评分。在某些应用中，使用了亚克隆性过滤器的给定癌症类型的外显子组校准因子和外显子组突变率从具有该癌症分数。在某些实施方案中，使用基因组区域的预定集和样品中具有拷贝数变化的区域的使用各种方法确定。在一些实施方案中，覆盖率被掺入作为给定样品中每个碱基的独特[0078]在一些实施方案中，体细胞突变的计数(观察到的突变计数)不包括(i)不代表背景外显子组突变率或TMB的驱动突变等，(ii)可能来自克隆造血而不是所考虑的肿瘤的突存在其他克隆造血变异体)和/或通过分析先前研究的样品数据库中的克隆造血突变，和/可以使用例如基于文献和癌症数据库在患者样品中频繁观察到的突变的精选列表，和/或入大量突变或突变的簇(例如，结肠直肠癌中的KRAS或PARP抑制剂治疗的前列腺癌中的特异性的某些区域的甲基化状态可以与TMB评分组合使用，将样品分类为TMB_高样品或的抗体)和/或联合治疗(例如免疫治疗+PARPi+化疗等)，以及本文进一步举例说明的或本[0085]在另一方面，本公开内容提供了一种将受试者分类为免疫治疗的候选对象的方还包括(b)从序列信息的至少第一部分确定受试者的肿瘤突变负荷(TMB)评分，和(c)在序确定TMB评分，其中所述其他变体包含来源于血液样品中一种或更多种免疫细胞的核酸中合和来自血液样品中的一种或更多种免疫细胞的核酸的第二集合，和(b)扩增核酸的第二核酸的第二集合。该方法还包括(c)对cfNA的第一集合的一个或更多个区域和富集的核酸多种新抗原孤儿免疫受体，从而分析来自被诊断患有癌症的受试者的血液样品中的多于中的核酸的方法。该方法包括(a)通过计算机接收从来自受试者的血液样品中的核酸获得疫细胞的核酸获得的测序读段。该方法还包括(b)鉴定序列信息的第一部分中的一种或更[0090]在一些实施方案中，该方法包括(i)确定序列信息的第一部分中观察到的突变计(iii)在给定测序参数的情况下确定预期突变分数和/或预期突变分数的预期分布以生成一部分和/或序列信息的第二部分定量存在于多于一个重复核酸位点的每一个的许多不同的许多不稳定重复核酸位点的重复核酸不稳定性评分，和(iii)当重复核酸不稳定性评分部分定量存在于多于一个重复脱氧核糖核酸(DNA)位点的每一个的许多不同重复长度，以生成多于一个重复DNA位点的每一个的位点评分，其中序列信息包括重复DNA位点的群体，(ii)将给定重复DNA位点的位点评分与多于一个重复DNA位点中每一个的给定重复DNA位点自多于一个重复DNA位点的许多不稳定的重复DNA位点的重复DNA不稳定性评分，以及(iv)样品的重复DNA不稳定性状态分类为不稳定，从而确定血液样品的重复DNA不稳定性状态。性评分，和(iii)当重复核酸不稳定性评分超过血液样品中重复核酸位点群体的群体训练部分定量存在于多于一个重复脱氧核糖核酸(DNA)位点的每一个的许多不同重复长度，以生成多于一个重复DNA位点的每一个的位点评分，其中序列信息包括重复DNA位点的群体，(ii)将给定重复DNA位点的位点评分与多于一个重复DNA位点中每一个的给定重复DNA位点自多于一个重复DNA位点的许多不稳定的重复DNA位点的重复DNA不稳定性评分，以及(iv)样品的重复DNA不稳定性状态分类为不稳定，从而确定血液样品的重复DNA不稳定性状态。比较，(iii)当给定的微卫星位点的位点评分超过给定的微卫星位点的位点特异性训练阈液样品中微卫星位点群体的群体训练阈值时，将血液样品的微卫星不稳定性(MSI)状态分中对应于序列可变靶区域组的cfDNA分子以比对应于表观遗传靶区域组的cfDNA分子更高的捕获产率在捕获的cfDNA分子组中被捕获。在某些实施方案中，cfNA包括无细胞DNA(cfDNA)。在一些实施方案中，来源于血液样品中一种或更多种免疫细胞的核酸包括mRNA从血液样品的血沉棕黄层级分获得来源于一种或中序列信息的至少第二部分包括从来源于血液样品中的一种或更多种免疫细胞的核酸获[0097]图1是示意性描绘根据本发明一些实施方案的调整TMB的示例性方法步骤的流程和免疫谱库测序的组合工作流程的流程图。来自免疫谱库谱系分析与TMB分析的综合结果[0102]图6是使用(o)和不使用(Δ)本文公开的TMB校正或调整方法，较低肿瘤分数和较[0104]图8A和图8B是显示与非同义编码单核苷酸变体(SNV)相关的突变类型的图。具体轴)；同义SNV的数目(y轴))。图8B是显示与非同义SNV相关的插入缺失(Pearson’sr=[0105]图9A图9D是小提琴图(violinplot)，显示了大组(largepanel)测定的肿瘤脱瘤类型(y轴))是分别显示队列(cohort)[0109]图13A是显示体细胞突变的克隆性和染色体不稳定性在整个TMB景观(landscape)更多种方法和/或本文描述的类型的和/或对本领域普通技术人员而言在阅读本公开内容[0115]调整的肿瘤突变负荷：如本文所用，“调整的肿瘤突变负荷(adjustedtumor苷酸或小于约50个核苷酸)。衔接子可以包含允许扩增在两个末端侧翼均为衔接子的核酸分子的引物结合位点，和/或测序引物结合位点，包括用于测序应用诸如各种下一代测序他实例包括T尾(T_tailed)和C尾(C_t形码”序列添加到每个DNA片段，以便在最终数据分析之前可以对每个读段进行鉴定和分于一个或更多个细胞内的核酸，即使这些核酸随后作为给定分析过程的一部分被取出(例苷酸序列的突变或基因重排过程产生的独特核苷酸序列(例如，编码T细胞受体(TCR)多肽或为从中取得或以其他方式获得测试样品的受试者鉴定一个或更多个可能的预后结果和/试者具有相同癌症类型的受试者和/或从正在接受或已经接受与测试受试者相同治疗的受修饰的核苷酸。核苷酸的某些对以互补方式彼此特异性结合(称为互补碱基配对)。在DNA尿嘧啶(U)配对并且胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)配对。当第一核酸链与由与第一链中的核苷酸不限于以下的所有可用的各种技术、平台或科技(technologies)获得的序列信息：毛细管定系统、焦磷酸测序、基于离子或pH的检测系统以及基于电子特征(electronicsignature)的系统。“预期突变计数(expectedmutationcount)”或“调整的突变计数(adjustedmutation数。的途径的抑制剂，其维持自我耐受性并且调节外周组织中生理免疫响应的持续时间和幅度，以最小化旁组织损伤(参见例如，Pardoll,NatureReviewsCancer12,252–264在给定样品中给定基因组位置含有等位基因改变或突变的核酸分子的分数。MAF通常被表示为分数或百分比。例如，MAF通常小于给定位点存在的所有体细胞变体或等位基因的约方案中，用于比较目的的参考序列是提供测试样品的受试者的物种的野生型基因组序列，由一种或更多种肿瘤相关突变形成的改变的多肽或编码多核苷酸获得。在某些实施方案始和/或终止位置、序列的一个末端或两个末端的子序列和/或长度)以及还具有相同的分[0153]观察到的突变计数.如本文所用，“观察到的突变计数(observedmutation苷酸包含至少三个核苷。寡核苷酸的尺寸范围通常从几个单体单元例如3_4个到几百个单相测序、高通量测序、大规模并行特征测序(massivelyparallelsignatureBiosystems/ThermoFisherScientific等等商业上获得的果(例如，从一个或更多个对照或参考样品确定的TMB评分)之间至少存在实质或近似匹配[0176]肿瘤突变负荷.如本文所用，术语“肿瘤突变负荷(tumormutationburden,换使用。它们是指存在于肿瘤基因组的经测序的部分中的突变例如体细胞突变的总数目。TMB可以指每兆碱基被检查的肿瘤基因组或外显子组或基因组的靶向区域的编码、碱基替以体细胞突变的数目可以用作用于确定肿瘤中新抗原的数目的代表物。TMB可以被用于推以通过生物信息学区分以鉴定抗原性体细胞要等位基因和次要等位基因是指具有其中位点分别被参考序列的核苷酸和不同于参考序胞的原发部位以外。该疾病的潜在分子基础是导致转化的细胞表型的突变和/或表观遗传[0182]本公开内容提供了可用于确定和分析患者样品中的TMB并有助于指导癌症治疗决对所考虑的组上该特定的生物信息学管道会调用的样品的实际突变的分数的预测来调整二项式采样解决方案来计算在样品覆盖率设置下和/或该样品中MAF的预期分布上突变调[0187]在一些实施方案中，方法100包括在步骤116中生成的调整的结果下游的各种步骤。这些的一些示例包括在步骤118中将调整的结果与用一种或更多种治疗索引的一个或一些实施方案中，生物信息学分析在给定组上调用的实际突变的预期分数通过以下来计数据集中观察到的相对突变等位基因分数(MAF)的一个或更多个数据集获得。对照样品数[0194]观察到的突变分数(f)=∑MAF(P(调用突变|MAF)*P(在MAF的突变))，其中P是概observe＝6)，并且观察到60％的突变(即f＝60％)，那么预期的实际突变计数是10(即n_该模型的这一输出，以获得在样品处于高肿瘤分数和/或高覆盖率的情况下在组上将调用案的某些中，然后将预期/调整的突变计数除以分析的基因组区域的大小，以给出样品的在这些实施方案中的一些中，观察到的突变计数和/或肿瘤分数排除了一个或更多个已知区域的预定集的测序覆盖率模式和标准最大似然方法来估计肿瘤分数。在一些实施方案中，肿瘤分数可以从基因组区域的预定集和样品中具有拷贝数变化的区域的cfDNA片段大小分布的差异来估计。在一些实施方案中，肿瘤分数可以通过将种系和/或体细胞变体的[0202]在一些实施方案中，给定样品的肿瘤分数可以低于所有核酸的约0.05％、约附近的普通种系单核苷酸多态性(SNP)的突变等位基因计数的平均值和方差建模。如果候并且该方法包括使用每个碱基处独特cfDNA片段的数目来计算该碱基处的灵敏度。在某些整的结果通常包括最高可能实际突变计数的预测和/或最低可能实际突变计数的预测。在在相似的MAF或相似的MAF范围内存在其他克隆造血变体)，或者通过分析先前研究的样品血衍生的突变可以通过使用概率/可能性模型来鉴定，该模型利用这些参数中的至少一些样品具有更多的这种证据。一些实施方案包括扩大给定组上具有与TMB相关的突变的位点的数目和/或进一步改善肿瘤分数的估计。在某些实施方案中，通过包括片段组学预期/调整的突变计数除以外显子组校准因子。在一些实施方案中，外显子组校准因子是症数据库，例如TCGA(TheCancerGenomeAtlas)中的样品的外显子组突变率来确定外显在CRC中的KRAS或在PARP抑制剂治疗的前列腺癌中的BRCA1/2逆转)，并且在观察到的突变到的突变计数排除了特定基因中的一些突变，如果基于总样品突变计数和组中的基因大(例如，DNA和/或RNA)可以根据本申请中公开的方法进行评价。一些实例包括无细胞核酸[0215]在一些实施方案中，TMB校正模型不能应用于具有指示低于特定截止值的肿瘤脱落和/或具有低于特定截止值的覆盖率的肿瘤分数或任何参数的样品，这将导致非常低的酸的各种纯化步骤之外，制备用于测序的核酸的典型步骤包括用分子条形码对核酸加标酸样品/文库制备的其他细节也在例如以下中描述：vanDijk等人,Librarypreparationmethodsfornext_generationsequencing:Tonedownthebias,ExperimentalCellResearch,322(1):12_20(2014)，Micic(Ed.),SamplePreparationTechniquesforSoil,Plant,andAnimalSamples(SpringerProtocolsHandbooks),1stEd.,HumanaPress(2016)，和Chiu,Next_GenerationSequencingandSequenceDataAnalysis,[0217]通过本文公开的方法确定的调整的TMB任选地用于诊断受试者中疾病或状况，特段深度。示例性体积为约0.4ml_40ml、约5ml_20ml、约10ml_20ml。量。例如，约30ngDNA的样品可以含有约10,000(104)个单倍体人类基因组当量，并且在[0224]扩增前的样品中的无细胞核酸的示例性的量通常在从约1飞克(fg)至约1微克(μ[0225]无细胞核酸通常具有长度约100个核苷酸和长度约500个核苷酸[0228]在一些实施方案中，核酸分子(来自多核苷酸样品)可以用样品索引和/或分子条应混合物中进行(例如，阵列中的多于一个微孔)。分子条形码和/或样品索引可以同时引合产生可以被单独追踪的独特序列。非独特加标签的分子条形码的检测与内源序列信息的不同分子具有接收不同标识符组合的高概率(例如，至少94％、99.5％、99.99％或[0232]在一些实施方案中，使用例如美国专利申请第20010053519、20030152490和序列一个末端或两个末端的子序列和/或长度)来鉴[0234]侧翼为衔接子的样品核酸通常通过PCR和其他扩增方法来扩增，所述其他扩增方法使用结合至待扩增的DNA分子侧翼的衔接子中的引物结合位点的核酸引物。在一些实施[0235]通常应用一轮或更多轮扩增循环来使用常规核酸扩增方法将分子条形码和/或样个或更多个诱饵集组选择的核酸捕获探针(“诱饵”)使用差异性平铺和捕获方案同相对浓度的诱饵集在与诱饵相关的基因组区域中差异性平铺(例如，以不同的“分辨[0238]序列捕获通常包括使用与靶核酸序列杂交的寡核苷酸探针。序列捕获的有效性通常部分地取决于靶分子中与探针序列互补(或几乎互补)的序列的长[0241]测序反应可以对已知包含癌症或其他疾病的标志物的一种或更多种核酸片段类地样品中的其他核酸测序，以产生测序的核酸。测序的核酸可以指核酸的序列(即序列信条形码。平末端的DNA分子任选地与至少部分双链的衔接子(例如，Y形衔接子或钟形衔接端连接的衔接子接收到衔接子条形码(即分子条形码)的相同组合的概率低(例如，<1或定哪些(如果有的话)测序的核酸在指定的位置处包括核苷酸变异，以及任选地哪些(如果[0249]关于核酸测序的另外细节，包括本文描述的格式和应Levy等人,AnnualReviewofGenomicsandHumanGenetics,17:95_115(2016)，Liu等人,J.ofBiomedicineandBiotechnology,Volume2012,ArticleID251364:1_11(2012)，Voelkerding等人,ClinicalChem.,55:641_658(2009)，MacLean等人,NatureRev.Microbiol.,7:287_296(2009)，Astier等人,JAmChemSoc.,128(5):1705_10[0251]根据本申请中公开的方法确定的给定受试者的调整的肿瘤突变负荷(TMB)，通常域测量，这些子集或靶向区域任选地被外推以确定整个基因组或整个外显子组的TMB。通常，参考群体包括与测试受试者具有相同癌症类型的患者和/或正在接受或已经接受与测[0254]在某些实施方案中，选择的基因或基因组区域任选地包括表2中列出的一个或更(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性髓单核细胞白血病[0261]在一些实施方案中，本文公开的方法涉及鉴定并向具有给定的调整的TMB的患者化基因3(LAG3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、半乳凝素9[0264]靶向这些免疫检查点分子的拮抗剂可用于增强针对某些癌症的抗原特异性T细胞PD_L1抗体、或抗PD_L1抗体和抗PD_1抗体的组合。在某些实施方案中，抗PD_1抗体是pembrolizumab(keytruda8)或纳武利尤单抗(opdivo8)中的一种或更多种。在某些实施单抗(atezolizumab)(Tecentriq8)、avelumab(BavencioB)或durvalumab(ImfinziB)中[0267]靶向这些共刺激检查点分子的激动剂可用于增强针对某些癌症的抗原特异性T细212(诸如因特网或其他互联网络)与远程服务器202通信的一个或更多个其他通信设备214214和216通常包括通过网络212与例如服务器202计算机通信的电子显示器(例如，支持互联网的计算机等)，其中该电子显示器包括用于在实现本文描述的方法时显示结果的用户于例如引导搜索应用或可由一个或更多个其他通信设备诸如214(示意性地示出为台式或直接或通过搜索引擎服务器202搜索。系统200任选地还包括一个或更多个远离服务器202[0271]如本领域普通技术人员所理解的，服务器202的存储器206任选地包括易失性和/用根据各种其他方法或架构配置的其他类型的服务器或计算机。图2中示意性示出的服务务器集群。服务器的数量及其架构和配置可以基于系统200的使用、需求和容量要求而增[0272]如本领域普通技术人员进一步理解的，示例性程序产品或机器可读介质208任选208也不需要全部驻留在易失性存储器中，而是可以根据本领域普通技术人员已知和理解储实现本公开内容的各种实施方案的功能或过程的程序产品608的任何其他介质或设备，[0274]程序产品208任选地从计算机可读介质复制到硬盘或类似的中间存储介质。当要列信息确定观察到的突变计数，(ii)确定肿瘤分数和/或核酸的覆盖率以生成测序参数，[0277]系统200通常还包括被配置成执行本文描述的方法的各个方面的另外系统组件。[0278]在一些实施方案中，例如，包括样品制备组件218的另外系统组件可操作地连接中的其他组分分离核酸，将包含分子条形码的一个或更多个衔接子连接到本文所述的核[0280]系统200通常还包括至少一个核酸测序仪222，其可操作地连接(直接或间接(例测序仪222被配置成将序列读段分组为序列读段家族，每个家族包括从给定样品中的核酸提供：Peterson,ComputerNetworks:ASystemsApproach,MorganKaufmann,5thEd.(2011)，Kurose,ComputerNetworking:ATop_DownApproach,Pearson,7thEd.(2016)，Elmasri,FundamentalsofDatabaseSystems,AddisonWesley,6thEd.(2010)，Coronel,DatabaseSystems:Design,Implementation,&Management,CengageLearning,11thEd.(2014)，Tucker,ProgrammingLanguages,McGraw_HillScience/Engineering/Math,2ndEd.(2006)，和Rhoton,CloudComputingArchitected:SolutionDesign细胞的T细胞受体(TCR)、B细胞的免疫一些实施方案，进行无细胞核酸测序(具有TMB分析)与来自相同样品的免疫谱库测序联合样品经历分离或提取步骤以产生包含无细胞核酸的血浆级分和包含淋巴细胞的血沉棕黄方法300包括对TCR克隆分型测定任选添加或替代地，免疫受体发现测定/血液癌症检测和两种描述的测定途径的结果也用于生成用于鉴定可能的免[0289]将具有已知的高肿瘤分数和高覆盖率的患者样品的等分试样用非肿瘤cfDNA(即观察到的突变计数、最大MAF和覆盖率被提供作为输入参数。