免疫组织化学得基本知识

免疫组织化学得基本知识

1免疫组织化学得概念:

免疫组化就就是利用抗原与抗体特异性结合得原理，通过化学反应使标记抗

体得显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽

和蛋白质），对其进行定位、定性及定量得研究,称为免疫组织化学。

2免疫组化实验所用得抗体有哪些？

免疫组化实验中常用得抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体就

就是一个B淋巴细胞克隆分泌得抗体,应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。

多克隆抗体就就是将纯化后得抗原直接免疫劫物后,从劫物瓶中所获得得免疫仇

清，就就是多个B淋巴细胞克隆所产生得抗体混合物。

3免疫组化实验所用得组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标

本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，

细胞标本包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片就就是制作组织

标本最常用、最基本得方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片,有利于各种染

色对照观察;还能长期存档，供回顾性研究;石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露

有一定得影响，但可进行抗原修复，就就是免疫组化中首选得组织标本制作方

法。4石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均

用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、发甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时

蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进

行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成得交联破坏，而恢复抗原得原有空

间形态。常用得抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，障消化法，水煮加

热法等，常用得修复液就就是pH6、。得（）、（）1mol/L得柠檬酸盐缓冲液。5免

疫组化常用得染色方法有哪些？

根据标记物得不司分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者就就

是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为底础得检测方法。这种方法敏感

性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平得定位，其中生物素——抗生

物素染色法最常用。

6抗体交叉反应得原因：指抗体除与其相应得抗原发生特异性反应外还与其

她抗原发生反应。产生得原因有以下几个方面：

1、抗原特异性指用于免疫动物得抗原性物质中含有多种抗原分子，她引起动物

产生针对多种抗原分子特异性得相应抗体。任何其她物质只要含有一种或多种与

上述物质相同得抗原分子，必将与上述多特异性得抗血清发生交叉反应。2、共

同决定簇即两种抗原分子中都含有相同得抗原决定簇。

3、决定簇相似，两种不同得抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某

一决定簇得相应抗体可以与大致相同得决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之

间构象相似时得结合力小于吻合时得结合力。

免疫细胞化学技术一、免疫细胞化学技术

得概述*免疫细胞化学（immunocytOchemistry,ICC）-就就是利用抗原与抗沐特

异性结合得原理,通过化学反应使标记抗体得显色剂（荧光素、酶、金属离子、同

位素）显色来确定细胞内抗原得成分（主要就就是多肽和蛋白质），对其进行定位、

定性及定量得研究，称为〜。

（一）对抗原和抗体得要求*具有特异性高和亲和力强得抗体就就是实验成功得

首要条件。

-对抗体得要求:纯度高、比活性强;

*高度特异性抗体得获得，取决于抗原得纯度。-对抗原得要求:纯度高，免疫原性

强,稳定无变化。

(二)抗原(antigen,A0

火抗原得概念:凡就就是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应得物质，称为

抗原。抗原具有两个方面得特性：

一免疫原性:引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞得特性；-免疫反应性:抗原能与

相应得抗体及致敬淋巴细胞发生特异得结合或反应得特性。

*根据抗原就就是否显示免疫原性分为：-完全抗原:分子量较大,一般在10kDa

以上,并具有较复杂得化学组成。*免疫原性最强得就就是蛋白质抗原，多糖次之;

脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好得免疫原性。-半抗原:

又称为不完全抗原,分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂和药物等。

*半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。

载体

*通常就就是具有高度免疫原性得大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联得半

抗原能力。

一常用得载体有钥孔血蓝蛋白(keyho1e1impethemocyanin,KLH)、牛血清白蛋

白(b0vineseruma1bumin,BSA)N卵白蛋白(Ovalbumin,0VA)等。-用戊

二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团一NH2、-COG)H等将半抗原结合到

载体上。结合比例为5kDa结合5〜25个分子得小肽。

(三)抗体(antibody,Ab)1、抗体得概念：*机体受到抗原刺激后，由浆细胞合

成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合得球蛋白,被称为抗体。

-抗体主要存在于血清内；

-抗体都就就是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都就就是抗体。-免疫球蛋白

根据重链得结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、IgE、IgA、

IgMo2、免疫组化实验中常用得抗体:单克隆抗体和多克隆抗体。*单克隆抗

体:就就是一个B淋巴细胞克隆分泌得抗体，就就是应用细胞融合杂交瘤技术免疫

动物制备得。-特异性强、抗体产量高。*多克隆抗体:就就是将纯化后得抗原直

接免疫动物后，从动物血中所获得得免疫血清，就就是多个B淋巴细胞克隆所产生

得抗体混合物。

-特异性低，会产生抗体得交叉反应。

-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。-抗原与抗

体得结合,要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时,就就是不能聚合成大颗粒。

3、抗体得制备——多克隆抗体得制备

*动物得选择

*佐剂(adjuvant)*免疫方法

*免疫剂量

*抗体效价得测定

*放血或定期抽血

免疫组化常见问题及解决方法

当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除

一种可能得原因。

对照/标本无染色

①确认就就是否忽略了应该加得某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

②确认所有得试剂就就是否按正确得顺序加入，就就是否蜉育了足够得时间。

③对照抗体得标签确认就就是否使用了正确得抗体，以及所用得检测系统就就是

否和一抗匹配，这一点就就是非常重要得。比如，如果一抗就就是兔来源得抗体，二

抗一定要用抗兔得二抗来匹配;或一抗就就是小鼠得IgM一抗，二抗必须就就是

山羊/兔抗小鼠得IgM（不就就是IgG）二抗。④检查抗体所使用得稀释度及稀释

溶液。⑤检查抗体得有效期和保存条件，尤其就就是标记了酶或荧光素得抗体,

现在大多数试剂公司得抗体均要求在4〜8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂

保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体得效价。⑥检查标

本得储存条件，最好用已知阳性得标本来同时做阳性对照。

⑦检查色原/底物溶液,最简单得检测方法就就是将一滴标记有酶得抗体加入到

制备好得底物溶液中，如果底物发生预期得颜色变化，则可排除底物得因素。需要

注意得就就是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。

⑧检查冲洗液就就是否和反应试剂匹配,溶液得pH值很重要，与过氧化物酶底物

匹配得溶液中不应含有叠氮钠。⑨检查发染剂和封片剂就就是否和所使用得色

原匹配。

弱阳性如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性,除了考虑上述因素外，还

应考虑:①标本得冏定方式，不当得冏定方式或冏定时温度过高，都会影响到所检

测得抗原得数量和质量。②不适当得抗原修复方式,由于石蜡切片在制作得过程

中固定剂对抗原得封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用得抗原

双暴露法,至于使用哪一种方法，应参照生产厂家得说明，同时结合标本得具体情

况而定。

③抗体得稀释度就就是否过高或者孵育得温度/时间就就是否正确。一般试剂生

产厂家都会对试剂给出一定得使用范围，但就就是由于使用者得标本来自各种组

织，处理过程也不尽相同,所以应参照使用范围，对所使用得一抗进行梯度测试，找

出最佳得使用浓度。

④切片上遗留了过多得冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了

进一步得稀释。

⑤孵育时切片就就是否放置水平，否则会导致抗体流失。如果阴性对照没有反应,

阳性对照反应良好,而标本弱阳性，则可能就就是由于阳性对照不就就是同一种组

织、或固定方式不同等原因所致。

非特异性染色①就就是否有效地去除了内源性薛和生物素。应注意得就就是，

并不就就是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富得组织，

如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理得方法为：

灭活碱性磷酸酶:最常用得方法就就是将左旋咪喳(24mg/ml)加入底物液中，并保

持pH值在7、6〜8、2,即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色得

酸性磷酸薛，可用50mmO1/L得酒石酸抑制。饱和处理内源性生物素:消除内

源性生物素得方法就就是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余

得结合位点。具体方法就就是在ARC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml

亲和素溶液中处理15分钟,PBS清洗15分钟后即可染色。②就就是否选择使用

了正确得封闭血清。电荷吸附所造成得非特异性背景染色消除方法就就是以二抗

动物得非免疫血清，用PBS稀释为3%—1()%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时

其她无关蛋白，如牛血淅白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重

要。最近有些国内得实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不

错。

③所选择得抗体就就是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原

相似得抗原决定簇等原因造成得非特异性染色只粕通过采用高纯度、高效价得抗

体、或针对更具特异性抗原决定簇得单克隆抗体来解决。

④一抗得使用浓度就就是否过高。⑤清洗就就是否充分。应严格操作规程。因

在缓冲液中含有一定量得盐，这亦有利于减低背景着色，通常0、05mol/1Tris—H

Cl。、15moi/INaQ已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20,效果更佳。特殊

标记时，试剂公司一般都提供缓冲液得配方。

⑥DBA得使用就就是否正确。DAB得孵育时间和配制方式可以产生某些背景

颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明得滴加顺序操作，注意校

正蒸储水得pH值，以确保实险结果得正确性;粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性

颗粒，这些颗粒须经过滤除去,否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另

外QAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥

处，现用现配，临用前加H202。孵育时间过长也会造成背景染色。

⑦标本染色过程中就就是否曾经干涸，否则会造成边缘部得非特异性染色。

⑧检查二抗与标本得内源性组织蛋白就就是否有交叉反应。

抗体得保存抗体储存容器应由不吸附蛋白质得材料制成，常用得有聚丙烯，聚碳

酸酯和硼硅酸玻璃。如储存得抗体中蛋白浓度很低（1（）-100Mg/L）,就应另加隔

离蛋白以减少容器对抗体蛋白得吸附,隔离蛋白常用0、1%-1、0%得牛血清白蛋

白。绝大多数已稀释得抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有

害效应。抗体原液和已分离得免疫球蛋白组分应深存于一20°C条件下，并避免反

复冻融。冷冻得抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻O

被细菌污染得抗体常会出现假阳性结果，应将污染得抗体溶液及其她试剂弃之。

为防止细菌污染,可于抗体溶液中加入0、01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后

置-20C以下可保存3—5年。

保存稀释后得单抗应加入0、1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，

少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存

数月。

石蜡切片免疫组化染色步骤

1、载破片得处理：抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素得影

响,极易造成脱片。为保证试脸得正常进行,可选用我公司提供得ZLL9001AP

ES、ZLI-9003HistogripTM或ZLI-9005Poly-L-Lysine等几种试剂，对

已清洗得栽玻片进行处理。具体方法如下：

1、1APES:现用现配，将洗净得玻片放入以1:50比例丙酮稀释得APES中，停

留20〜30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馅水中涮去未结合得APES,

置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位,并尽量减少气

泡得存在,以免影响染色结果。1、2HistogripTM:将洗净得玻片放入以1:50比

例丙酮稀释得Histogrip液中，停留1〜2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次，室

温干燥或60。C烤箱烘烤一小时，装盒备用。1、3Poly-L-Lysine:将洗净、干

燥得载玻片放入以1:10比例去离子水稀释得多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分

钟,60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用得器具均为非

玻璃制品O

2、常用睡消化:2、1胰蛋白酶:一般使用浓度为0、05%〜0、1%,消化时间为37℃、

10〜40分钟，主要用于细胞内抗原得显示。2、2胃蛋白酶:一般使用浓度为0、

4%,消化时间为37℃、30〜180分钟，主要用于细胞间质抗原得显示，如:La

minin（层粘蛋白）,CollagenIV（IV型胶原）等。

2^3g/m1得saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。m皂素（Saponi

n）:一般使用浓度为203、抗原热修纪：

可根据实验室得具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗

原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实脸证

明，以0、01M枸稼酸盐缓冲液（pH6、0）效果最好。请选用我公司提供得Z

LI-9064士枸椽酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml得蒸馆水中，

混匀，其pH值在6、00、1,如因蒸馅水本身造成得pH值偏差，请自行调整。

3、1石蜡切片微波炉抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,3%H2O2处理1（）分钟,

蒸馅水洗2分钟X3。将切片放入盛有枸檬酸盐缓冲液（工作液）得容器中,置微波

炉内加热使容器内液体温度保持在92'C〜98℃之间并持续10〜15分钟（注意：

无论就就是使用医用或家用微波炉,请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上

步骤中对温度和时间得要求）。取出容器，室温冷却10〜20分钟（注意:不可将切片

从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有得空间构型）。PRS洗，下接免疫组

化染色步骤。3、2石蜡切片高压抗原修复操作方法:切片脱蜡至水。将1500

ml~3000m1得枸椽酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置

于金属架上，放入锅内,使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时

（约加热5〜6分钟后）,於时1〜2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下

气阀，打开锅盖，取出切片，蒸锚水洗后TBS洗2分钟X3,下接免疫组化染色步骤。

3、3石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后，放入盛有枸椽酸盐

缓冲液（工作液）得容器中,并将此容器置于盛有一定数量自来水得大器皿中，电炉

上加热煮沸,从小容器得温度到达92℃〜98°C起开始计时15〜20分钟，然后端离

电炉，室温冷却20〜30分钟,蒸镭水冲洗,PBS洗，下接免疫组化染色步躲。

4、免疫组化染色步骤：

（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）

1）石蜡切片脱蜡至水。2）3%H2O2室温孵育5〜10分钟，以消除内源性过氧化物酶

得活性。3）蒸馅水冲洗,PBS浸泡5分钟,（如需采用抗原修复,可在此步后进行）。

4）5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温蜉育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加

适当比例稀释得一抗或一抗工作液,37℃孵育1〜2小时或4℃过夜。

5）PBS冲洗,5分钟X3次。6）滴加适当比例稀释得生物素标记二抗（1%BSA-PBS

稀释）,37℃孵育10-3（）分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温

孵育1（卜30分钟。

7）PBS冲洗,5分钟X3次。

8）滴加适当比例稀释得辣根晦标记链霉卵白素（PBS稀释）,37℃孵育10〜30分钟;或

第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37t或室温孵育10~30分钟。

9）PRS冲洗,5分4中X3次。10）显色剂显色（DAR或AEC）。

11）自来水充分冲洗，复染，封片。

冰冻切片免疫组化染色步骤室温放置3（）分钟后，入

4°C丙酮固定10分钟,PBS洗,5分钟X3。用3%过氧化氢孵育5〜1（）分钟,消除内

源性过氧化物酶得活性。PBS洗,5分钟X2

免疫组化实验过程中得要点和技巧

1、固定:最好用4%得多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻

丙酮好;但对于不同得组织和抗原，可选用不同得固定液。有时候商品化得抗体会

有比较适合而推荐得固定液，请于购置前注意说明书。

BouinS固定液:饱和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其对组织得穿透力

较强，固定较好,结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组

织标本得长期保存。

PLP液:即高碘酸钠.赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对

超微结构及许多抗原得抗原性保存较好。

2、组织脱水，透明:时间不能太长，否则在切片时容易碎片,切不完整。

3、切片时展片:有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴

乙醇。

4、烤片:60℃30分钟或37℃过夜,温度太高或时间太长，抗原容易丢失。

5、蜡块及切片得保存:最好在4°C保存

6、脱片问题:Poly—L-Lysinc(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用得

一种防脱片剂,6ml得多聚赖氨酸溶液可按1:1()稀释成60ml得工作液，适合于需要

晦消化、微波、高温高压得防脱片处理。如不行，可用双重处理(APES和Poly-L-

Lysine)得切片。在以上两种条件都行不通得情况下，可用如下方法:切片在脱蜡前,

放在APES1:50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。7、灭活内源性

薛:HRP系统:3%双氧水灭活;AP系统:3%HAc灭活。

8、暴露抗原:对于石蜡切片得免疫组化实险时，必须采用高温加热抗原修复，这将

有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色得强度(不同抗体得最佳修复液请

参阅抗体说明书)。对于不同得组织，不同得抗原，不同得抗体，所采用得方法应不一

样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化

等。

9、封闭:在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血

清封闭

10、抗体稀释:应遵循“现用现配”得原则，对于PBS稀释得抗体一定要当天使

用。

11、背景高:在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适得条件下，如果背景依旧高，

可采用含1%oTwecn20得PBS洗，特别就就是在显色之前要多洗。12、返蓝:

在苏木素发染后，可用碱性缓冲液(如PBS)或Na2Hp()4得饱和溶液返蓝。13、

显色:一定要在显微镜7观察，注意控制背景。

14、在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。

免疫组织化学方法及常见问题解答

按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法);按结

合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法和亲和连接,

如卵白素•生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶

连结(SP)法等，其中SP法就就是最常使用得方法。

免疫组化ABC法步骤

1>4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液(4'C)中过夜。蜡块制

作。切片,贴片。0、01MKPBS清洗5minX3后；

2、加入配好得0、3%得过氧化氢甲醇溶液(甲醇80ml+0、01MKPBS

100ml+30%过氧化氢)30min,以消除内源性过氧化物酶得彩响,0、01MPBS清

洗5minX3;

3、加入配好得0、3%TritonXI00(30%TritonX100+0>01MK

PBS100ml)30min,以增加细胞得通透性,0、01MKPBS清洗5minX3;

4、加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1、00g+0、01MPBS100ml+叠氮纳0、

080稀释得一抗,4'C存放24-48h;吸去抗体,0、01MKPBS洗5minX3;

5、加入0、01MKPBS稀释得得二抗，室温孵育2h。0、01MKPBS洗5minX3;

6、加入ABC复合物之类得抗体，室温孵育2h,0、01MKPBS洗5minX3;蒸惚

水迅速冲三次；

7、加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min,可不时在显微

镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸饱水迅速冲三

次后加入0、01MKPBS终止反应；

8、梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

免疫组化SP法步骤:SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋

白-过氧化物酶连结法。

一般得sp法步骤啊，具体如下:

1、烤片,68'C,20分钟,

2、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水;二甲苯120min=二甲苯II20min=100%

酒精10min=100%酒精10min=95%酒精5min=80%酒精5min=70%酒精5

min

3、阻断灭活内源性过氧化物酶:3%H2O237'C孵育10min,PBS冲洗3X

5min;

4、抗原修复:置0、01M枸株酸缓冲液（PH6、0）中用煮沸（95℃,15-20min）,

自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温,PBS冲洗3X5mino

5、正常羊血清工作液封闭,37℃10min,倾去勿洗。

6、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜,PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴

性对照）；

滴加生物素标记二抗,37℃孵育30min,PBS冲洗3X5min;

7、滴加辣根过氧化物酶标记得链霉素卵白素工作液,37℃孵育30mMpBS

冲洗3X5min；

8、DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥,

封片。

免疫组化方法中关键环节及其原理解述

一、酶免疫组化得关键环节

1、标本固定:固定得目得就就是①防止标本从玻片上脱落;②除去防碍抗原一

抗体结合得类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好得染色结果;③固定得标本易于

保存。

2、脱水、石蜡包埋和制片:脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要

完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则,容易裂片和脱片等。

3、脱蜡和水化:这就就是为了后面得抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结

合反应。脱蜡可以先60度20min,然后立即二甲苯1-3分别10min,但当天制好得

切片可以60度3-4ho水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现

局灶性反应和浸洗不全,而产生非特异性背景着色。

4、抗原修复:由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白

之间交联及醛基得封闭作用，从而失去抗原性;通过抗原修复，使得细胞内抗原决

定族重新暴露，提高抗原检测率。常用得修复方法从强到弱一般分为三种，高压修

复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体得可以查阅相关资料，大量

得:中性得、高pH得等）。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。

注意微波修复后自然冷却30min左右（只要您觉得修复液得温度达室温即可）。

5、细胞通透:目得就就是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用

TritonX-100＞蛋白酶k等通透液。如TritonX—100可以溶解细胞膜、

细胞核膜、细胞器膜上得脂质而使抗体及大分子结构得物质进入胞浆和胞核内，

故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结

合。在免疫组织化学（＞10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作

为细胞通透剂，在膜上打孔。

6、灭活内源性过氧化物酶和生物素:在传统得ABC法和SP法中，免疫组化反

应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素得干扰,必须用过氧化氢和卵白素等

进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以lOmin左右，而

0。3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10〜30min;用甲醇配置过氧化氮比

双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起

脱片;现用现配，配好后乙度避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试

剂盒”避免内源性生物素得干扰，推荐使用。

7、血清封闭:组织切片上有剩余得位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结

果得假阳性;封闭血清一般就就是和二抗同一来源得，血清中动物自身得抗体，预

先能和组织中有交叉反应得位点发生结合;也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，

但不能与一抗来源一致。一般室温或37度10—30min。

8、一抗和二抗浓度和孵育时间:一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括

孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳;

孵育时间:这与温度、抗体浓度有关，一般37度l-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度

复温45min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件:二抗一般室温或37度30mHi

h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液，若就就是浓缩液还要摸索浓度。但在

免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵

育时间。

9、抗体稀释液:其实许多实脸室抗体稀释液就用一般PBS即可,但专用得抗体

稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体得多次

回收利用较好。正因为这种原因,我一直用国产得专用抗体稀释液，一段时间在更

换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提示可能一抗没有结合），最后从抗

体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后,发现就就是新抗体稀释液得PH值偏

酸,而使抗原抗体反应不佳,终而出现假阴性结果O

10、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）:为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起

非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一

抗孵育前得清洗就就是3min*3次，而一抗孵育后得清洗均为5次*5min。

注意:⑴单独冲洗，防止交叉反应造成污染。⑵温柔冲洗，防止切片得脱落。我

喜欢用浸洗方式;⑶冲洗得时间要足够，才能彻底洗去结合得物质。（4）PBS得PH和

离子强度得使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买得抗体稀释液偏酸，结果

背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7、4-7.6浓度就就是0、01Mo（中性及

弱脸性条件（PH7-8）有利于免疫发合物得形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强

度有利于免疫复合物得形成，而高离子强度则有利于分解）

11、DAB显色:背景得深浅和特异性染色得深浅均可以由DAB孵育条件决定。

DAB显色时间不就就是固定得，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染

色较强而本底着色较浅时即可冲洗;DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现

很深得棕褐色，这很可能说明您得抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗

体浓度或缩短您得抗体孵育时间;此外,若很短时间就出现背景很深，还有可能您

前面得封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间;DAB显色时间很长（如超过十

几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明您得抗体浓度过低或孵育时间过短（最

好一抗4度过夜）;另一方面就就就是封闭时间过长。

12、复染:目得就就是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用

苏木素复染（胞核染料），注意苏木素复染时间要看当时得室温、溶液得新旧,目

标抗原得定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋

白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救得。即:染色深则分化时间稍长些

即可;染色浅则再置于苏木素中染色即可。

盐酸酒精就就是分化，氨水就就是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗,

然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗,在放入氨水中返兰即

可。

13、封片:为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片,避免产生气泡，方法就就

是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对

面得那个拐角，接近封片液近端得拐角先降低，直至接触到液体时为止;当发现液

体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

二、免疫荧光方法中得重要环节

1、冰冻切片制备:建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥

散。选用干净锋利得刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。

2、组织切片固定:切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-lOmin,

尤其要较长时间保存得白片，一定要及时固定和适当保存。

3、血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原得结合，需要在一抗孵育前先用

血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭得时间就就是可以调整得，

一&1O-3Omino

4、一抗孵育条件:在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗

孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳;孵育时间:这与温度、抗体

浓度有关，一般37度1一2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条

件还要摸索。

5、二抗孵育条件:二抗一般室温或37度30b.in-lh,具体时间需要摸索，而浓

度一般有工作液，若就就是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光

中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。

最后，荧光素标记得二抗随着保存时间得延长，可能后有大量得游离荧光素残留，

需要注意配制时小包装和并进行适当得离心。

6、复染:目得就就是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常

用DAPI复染。

7、封片:为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门得抗荧光萃

灭封片液。避免产生气泡，方法就就是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一

手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面得那个拐角，接近封片液近端得拐角先降低,

直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐

角，这样一般不会产生气泡。

8、切片清洗:为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当

地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要,我一般在一抗孵育前得清洗就就是

3min*3次，而一抗蜉育后得清洗均为5次*5min。注意⑴单独冲洗，防止交叉反应造

成污染。（2）温柔冲洗，防止切片得脱落。我喜欢用浸洗方式;（3）冲洗得时间要足够，

才能彻底洗去结合得物质。（4）PBS得PH和离子强度得使用和要求。这方面我有惨

痛教训，当时我买得抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在

7、4-7、6浓度就就是0、OlMo（中性及弱磴性条件（PH7-8）有利于免疫复合物

得形成，而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物得形成,而高离

子强度则有利于分解）

9、拍照:有条件得话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封

固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求

进行操作,不要随意改变程序;应在暗室中进行检查;防止紫外线对眼睛得损害，在

调整光源时应戴上防护眼镜;检查时间每次以1〜2h为宜，超过90min,超高压汞灯

发光强度逐渐下降，荧光减弱;标本受紫外线照射3〜5min后，荧光也明显减弱或

褪包;激发光长时间得照射，会发生荧光得衰减和淬灭现象;所以最多不得超过2〜

3h;荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应

加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待

灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-

30分钟后;标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙

烯塑料袋中4°C保存,可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发;使用得玻片等载体，

都必须厚度均匀，无明显得自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜

油;电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯得寿命，也会影响镜检得效

果。

3、在什么情况下使用Triton-X100

(l)TritonX-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基酸,就就是一种去污剂。在免疫

组织化学(>10um厚切片)和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通

透剂,在膜上打孔。

(2)其作用原理:TritOnX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上

得脂质而使抗体及大分子结构得物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤

为推荐使用,这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

(3)TritonX-100既就就是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。

4、封闭血清得选择原则就就是什么？

⑴膜上或切片上有剩余得位点可以非特异性吸附抗体,造成后续结果得假阳

性！

⑵封闭血清一般就就是和二抗同一来源得，血清中动物自身得抗体，预先能和

组织中有交叉反应得位点发生结合，否则在后面得步骤中如果和二抗发生结合，会

造成背景。

⑶也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

5、抗体孵育条件得比较？

⑴一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳;孵育时间:这与温

度、抗体浓度有关，一般37度l-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度梵温45min。

(2)二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索。

6、一抗4度孵育后为什么要进行37度复温?

⑴一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；

⑵另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱得抗原可能

有用，4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，

后者结合更快，但钺感性也提高了并易造成非特异染色。

(3)其实,我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出

后,直接用PBS洗没发生过脱片现象。

7、DAB显色时间如何把握？

⑴DAB显色时间不就就是固定得,主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕

色本底时即可冲洗；

⑵DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深得棕褐色，这很可能说明

您得抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短您得抗体蜉育

时间；

(3)此外,若很短时间就出现背景很深，还有可能您前面得封闭非特异性蛋白不

全,需要延长封闭时间；

(4)DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色，一方面可能说明您

得抗体浓度过低或耨育时间过短(敲好一抗4度过衩);另一方面就就就是封闭时间

过长。

8、免疫组化结果如何分析?

⑴阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不重叠得10个视野，人工或

机器计数阳性着色细胞，每组3〜6张不同动物组织切片燃后进行组间比较即可。

⑵灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相

同条件下用imagejife行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

⑶评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0〜3分为阳性

着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1〜4分为0-25%、26〜50%、

51〜75%、76700%)，最终可以分数相加，再进行比较。

对于以上这几种方法，各有利弊,请细心选择。要想得到正确结果得前提就就

是您要做出着色均匀、背景很浅得高质量切片。

9、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复得条件就就是什么？

(1)由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交

朕及然基得封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重

新暴露，提高抗原检测出。

⑵修复方法从强到弱一般分为三种滴压修复、微波修复、胰酶修复。修复

液也分为若干种(具体得可以查阅相关资料，大量得:中性得、高pH得等)。

(3)微波修复，我们一般用6min*4次，效果不错。

12、如何最大限度地降低组织非特异性染色？

(1)缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这就就是最重要得一条。

⑵一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

(3)内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高(含血细胞多得

组织)，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

(4)非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源得动物免疫血清封闭

时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

(5)缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；

⑹适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后得浸洗尤为

重要；

(7)防止标本染色过程中出现千片，这容易增强非特并性盾色。

13、苏木素复染时间得把握？

⑴苏木素复染时间要看当时得室温、溶液得新旧、目标抗原得定位等情况，

一般数秒一数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救得。即:染色深则分化时

间稍长些即可;染色浅则再置于苏木素中染色即可。

(2)盐酸酒精就就是分化，氨水就就是返兰。作用不同。片子复染完后流水振

洗，然后置于盐酸酒精中数秒(一定动作要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰

即可。

⑶如果分化得颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。

14、PBS得清洗方式选择、次数和时间得选择？

(1)单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

临床上每天检测得病例很多，所用得抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵

育完后，将她们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，彩响最后得结果。正确得做

法就就是单独地进行冲洗,冲洗得PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染得

机会。

⑵温柔冲洗，防止切片得脱落。

冲洗切片，取出切片，将PBS从上较轻地冲洗，让PB