26年PDX模型检测操作规范

26年PDX模型检测操作规范演讲人目录01.总则02.PDX模型检测的前置准备03.PDX模型的常规检测项目与操作流程04.检测质量控制与异常处理05.文档管理与可追溯性06.附则各位同仁，大家好。我是从事PDX（患者来源异种移植模型）模型应用与质量管控工作近十年的一线从业者，今天和大家分享的《26年PDX模型检测操作规范》，是我们团队结合近30年的一线实操经验，在2026年更新的版本——这一版本既延续了过往规范的核心框架，又针对近年药物研发对PDX模型的更高要求，补充了新兴技术应用、异常场景处理等内容，也是目前国内贴合临床转化需求的实操性较强的PDX检测指南之一。PDX模型作为目前最接近人类肿瘤真实生物学特征的体内研究模型，是肿瘤药物研发、个体化治疗筛选的核心工具，而检测环节则是保障模型质量、确保实验数据可靠性的关键防线。我第一次接触PDX模型是2018年，当时我们实验室因缺乏统一的检测标准，曾出现一批模型被支原体污染导致后续3个月实验全部报废的情况，也正是那次教训让我们意识到，严谨的检测操作规范绝非纸上谈兵，而是直接关系到研发进度与资源投入的核心保障。接下来我将从总则、前置准备、核心检测流程、质量管控、文档管理等维度，为大家详细解读本规范的内容。01总则1规范的制定背景与适用范围1.1制定背景本规范的更新源于2025年国家药监局发布的《生物模型质量管控指导原则》，结合我们团队在12家合作医疗机构、8家药企研发中心的一线实操反馈，针对过往规范中存在的检测盲区、流程模糊点进行了优化：比如新增了单细胞水平的异质性检测要求，补充了非人灵长类PDX模型的检测细则，同时细化了异常结果的溯源流程。规范的制定核心是解决“检测标准不统一、结果可追溯性差、异常处理无依据”三大行业痛点，为PDX模型的全流程管控提供可落地的操作依据。1规范的制定背景与适用范围1.2适用范围本规范适用于所有从事PDX模型构建、传代、检测、应用的实验室、医疗机构与药企研发团队，涵盖实体瘤PDX、血液瘤PDX、人源化小鼠PDX等所有类型的PDX模型检测工作。对于仅用于基础研究的小型PDX模型，也可参照本规范的核心要求进行简化调整。1规范的制定背景与适用范围1.3伦理要求前置所有用于PDX模型构建的患者样本，必须经患者签署书面知情同意书，并通过医院伦理委员会审批，严禁使用未合规获取的样本开展检测工作——这是我们开展所有PDX相关工作的底线，也是保障行业合规性的核心前提。2核心定义与术语说明为避免实操中出现歧义，本规范统一明确以下术语的定义：PDX模型：将患者来源的新鲜肿瘤组织或细胞直接接种到免疫缺陷小鼠体内构建的异种移植模型，保留原肿瘤的组织学特征、分子遗传学特征与异质性；传代周期：PDX模型从接种到再次传代的时间间隔，实体瘤PDX通常为10-15天，血液瘤PDX需根据肿瘤负荷调整；检测批次：同一时间内开展的相同检测项目的样本组，需包含阳性对照、阴性对照与空白对照；合格模型：同时满足病原微生物阴性、组织学匹配、遗传学稳定、功能活性符合要求的PDX模型。3质量管控的核心目标本规范的质量管控目标可概括为三点：一是确保PDX模型与原患者肿瘤的生物学特征高度匹配；二是避免模型出现交叉污染、遗传漂变等质量问题；三是实现所有检测流程的可追溯性，符合药品监管的合规要求。02PDX模型检测的前置准备PDX模型检测的前置准备在正式开展检测前，必须完成全流程的前置准备工作，这是避免检测失误的第一道关卡，也是我在过往实操中反复强调的核心环节。1人员资质与分工1.1人员资质要求所有参与PDX模型检测的人员，必须具备以下资质：掌握细胞生物学、分子生物学的基础理论知识，持有生物安全二级实验室操作资质证书；经过PDX模型检测专项培训，考核合格后方可独立上岗；每年需参加至少1次行业内的质量管控培训，更新技术知识与操作规范。1人员资质与分工1.2岗位分工与职责我们实验室的分工模式已沿用7年，实践证明可有效避免操作失误：01样本接收员：负责核对患者样本的知情同意书、采集时间、运输条件，拒收不符合要求的样本，同时做好样本入库登记；02检测操作员：负责具体的检测操作，严格按照规范流程执行，如实记录检测数据；03质量复核员：负责审核检测记录、对照实验结果，对异常结果进行初步溯源，我目前主要承担这一岗位的工作；04档案管理员：负责检测记录的存储与检索，保障档案的安全性与可追溯性。052实验环境与设备校准2.1实验环境要求PDX模型检测需在二级生物安全实验室的超净工作台内开展，环境需满足以下要求：01实验室温度控制在20-25℃，湿度控制在40%-60%；02超净台需每周用75%乙醇与甲醛交替消毒，每月进行气流速度检测，确保风速达到0.38-0.5m/s；03检测区域与传代区域需严格分开，避免交叉污染。042实验环境与设备校准2.2设备校准与维护所有用于检测的设备必须定期校准并保留校准证书：荧光显微镜、流式细胞仪每季度校准1次，重点校准荧光通道的灵敏度；PCR仪、qPCR仪每半年校准1次，确保扩增效率符合要求；高压灭菌锅每月进行生物指示剂灭菌测试，确保灭菌效果达标。我在2022年曾遇到过荧光显微镜的绿色通道灵敏度下降的问题，当时未及时校准导致一批免疫组化检测结果出现假阴性，后来通过校准解决了这一问题，也让我们建立了“设备校准台账”，明确了每台设备的校准周期与责任人。3样本接收与预处理3.1样本接收标准接收患者样本时，需严格核对以下信息：患者的姓名、性别、年龄、肿瘤类型、临床分期等基本信息，确保与知情同意书一致；样本的采集时间、运输方式、保存条件，要求实体瘤样本在4℃条件下2小时内送达实验室，血液瘤样本需在6小时内处理；样本的体积与质量，实体瘤样本需≥0.5cm³，血液瘤样本需≥1×10^6个细胞。若样本不符合上述要求，需直接拒收并告知临床科室，去年我们就曾拒收过一批延迟3小时送达的肺癌样本，当时临床医生不太理解，但后续跟踪发现这批样本的模型成瘤率仅为20%，远低于标准成瘤率（≥70%），也验证了拒收的必要性。3样本接收与预处理3.2样本预处理流程接收后的样本需在30分钟内完成预处理：将样本剪成1mm³左右的小块，用于后续的组织学检测与模型构建；取少量样本进行DNA提取，用于后续的遗传学稳定性检测。用含双抗的PBS溶液冲洗样本3次，去除表面的血液与坏死组织；03PDX模型的常规检测项目与操作流程PDX模型的常规检测项目与操作流程这是本规范的核心章节，涵盖了PDX模型检测的四大核心项目，每一项都有严格的操作步骤与判定标准。1病原微生物检测病原微生物污染是PDX模型最常见的质量问题，包括细菌、真菌、支原体、病毒等，本规范明确了四种常见污染的检测方法与流程。1病原微生物检测1.1细菌与真菌检测操作流程：取0.1g模型组织，接种于血平板与沙氏培养基，37℃培养24-48小时，观察菌落形态；同时进行革兰染色镜检，确认细菌类型。01判定标准：培养基无菌落生长、革兰染色未观察到细菌或真菌菌丝，判定为阴性；若出现菌落生长或镜检发现病原体，判定为阳性。02注意事项：培养过程中需每日观察，避免培养时间过长导致污染扩散；阳性样本需立即高压灭菌处理，避免污染其他样本。031病原微生物检测1.2支原体检测支原体是PDX模型最隐蔽的污染源，可影响肿瘤细胞的生长与功能，本规范采用两种方法联合检测：荧光染色法：取模型细胞上清液，滴加荧光染料后孵育10分钟，在荧光显微镜下观察是否出现绿色荧光点，阳性样本可见亮绿色的点状或丝状荧光；PCR法：针对支原体的16SrRNA基因设计特异性引物，进行PCR扩增，扩增产物长度为280bp，阳性样本可见清晰的条带。我们实验室目前采用两种方法联合检测，避免出现假阴性结果，2023年我们曾通过荧光染色法发现一批模型存在弱阳性污染，后续通过PCR法确认了支原体感染，随后对整个超净台进行了甲醛熏蒸消毒，后续3个月未再出现支原体污染的情况。1病原微生物检测1.3病毒检测针对免疫缺陷小鼠的病毒检测，本规范要求开展两项检测：小鼠血清学检测：采集小鼠外周血，采用ELISA法检测小鼠细小病毒、鼠痘病毒等常见病毒抗体；RT-PCR检测：针对小鼠肝炎病毒、逆转录病毒等进行核酸检测，确保模型未携带小鼠内源病毒。2遗传学稳定性检测遗传学稳定性是保障PDX模型与原患者肿瘤特征一致的核心，26版规范新增了单细胞水平的异质性检测要求，替代了过往仅采用bulk测序的检测方式。2遗传学稳定性检测2.1STR鉴定（短串联重复序列检测）STR鉴定是确认模型与原患者肿瘤基因型一致的核心方法：操作流程：提取模型组织与原患者肿瘤组织的DNA，采用商业化的STR鉴定试剂盒，扩增15个常染色体STR位点与1个性别决定位点；判定标准：模型与原患者肿瘤的STR位点基因型完全一致，且无其他额外的等位基因，判定为无交叉污染；若出现等位基因差异，需重新采样检测，确认是否存在样本混淆或交叉污染。2遗传学稳定性检测2.2拷贝数变异与基因突变检测bulk测序检测：采用NGS技术检测模型的拷贝数变异与常见驱动基因突变，要求与原患者肿瘤的突变一致性≥90%；单细胞测序检测：针对高度异质性的肿瘤模型，采用单细胞RNA测序或全基因组测序，检测肿瘤细胞的异质性，确保模型保留原肿瘤的主要克隆亚型。2遗传学稳定性检测2.3遗传漂变检测每传代5次后，需重新进行遗传学稳定性检测，确认模型在传代过程中未出现显著的遗传漂变，若发现突变频率变化超过20%，需终止该批次模型的使用。3组织学鉴定检测组织学鉴定是确认PDX模型保留原患者肿瘤组织学特征的关键环节，本规范要求开展HE染色与免疫组化检测。3组织学鉴定检测3.1HE染色检测操作流程：取模型组织的石蜡切片，脱蜡至水，苏木素染色5分钟，水洗后用1%盐酸乙醇分化，伊红染色3分钟，脱水透明后封片；判定标准：模型组织的细胞形态、组织结构与原患者肿瘤的HE染色结果一致，未出现明显的细胞形态改变或坏死。我在2021年曾遇到过一批肺癌PDX模型，HE染色发现肿瘤细胞从腺癌转变为肉瘤样改变，后续溯源发现是传代时污染了小鼠的成纤维细胞，导致模型的组织学特征发生改变，后来我们优化了传代操作流程，要求每传代3次后进行一次HE染色检测，避免了类似问题的再次发生。3组织学鉴定检测3.2免疫组化检测针对不同类型的肿瘤，需选择对应的特异性标志物进行免疫组化检测：01乳腺癌模型：检测ER、PR、HER2等标志物；03判定标准为：模型的标志物表达模式与原患者肿瘤的表达模式一致，阳性染色部位与强度符合原肿瘤的特征。05肺癌模型：检测CK7、TTF-1、NapsinA等标志物；02结直肠癌模型：检测CK20、CDX2等标志物。044功能活性检测功能活性检测是验证PDX模型能否用于药物研发的核心环节，本规范要求开展成瘤率检测与药物敏感性检测。4功能活性检测4.1成瘤率检测操作流程：将预处理后的肿瘤组织接种到免疫缺陷小鼠体内，每批次接种至少10只小鼠，观察30天内的成瘤情况；判定标准：成瘤率≥70%，且肿瘤生长曲线符合原肿瘤的生长规律，判定为合格。4功能活性检测4.2药物敏感性检测针对需要进行药物筛选的PDX模型，需开展药物敏感性检测：操作流程：将模型肿瘤组织接种到小鼠体内，待肿瘤体积达到100mm³时，随机分为对照组与给药组，每组至少6只小鼠，连续给药14天，测量肿瘤体积与小鼠体重；判定标准：给药组的肿瘤生长抑制率（TGI）≥50%，且小鼠体重下降≤10%，判定为模型对该药物具有敏感性；若TGI<30%，判定为模型对该药物耐药。4功能活性检测4.3异质性功能验证对于高度异质性的肿瘤模型，需采用单细胞测序结合药物敏感性检测，验证不同克隆亚型对药物的应答情况，确保模型能够反映原患者肿瘤的异质性治疗应答。04检测质量控制与异常处理检测质量控制与异常处理在实际操作中，难免会遇到异常结果，本规范针对常见的异常情况制定了明确的处理流程，这也是26版规范新增的重要章节。1检测批次的质量控制每一批次的检测必须设置阳性对照、阴性对照与空白对照，确保实验结果的可靠性：01阳性对照：采用已知污染或突变的样本，验证检测方法的灵敏度；02阴性对照：采用无病原体污染的正常小鼠组织，验证检测方法的特异性；03空白对照：采用PBS溶液，验证实验环境是否存在污染。04若对照实验结果不符合要求，需重新开展该批次的检测，不得采用异常对照的检测数据。052异常结果的判定与溯源常见的异常结果包括STR鉴定不一致、病原微生物阳性、组织学特征改变等，本规范要求按照以下流程进行溯源：重复检测：对异常样本重新采集样本，重复开展检测，确认结果的可靠性；样本溯源：核对样本的接收记录、传代记录，确认是否存在样本混淆或传代错误；环境排查：对实验环境、设备进行消毒与检测，确认是否存在环境污染；人员排查：核对操作人员的操作记录，确认是否存在操作失误。我在2022年曾遇到过一批肺癌模型的STR鉴定结果不一致，后续溯源发现是样本接收时将两个患者的样本标签贴反了，随后我们优化了样本标签的粘贴流程，采用双标签绑定的方式，避免了类似问题的再次发生。3不合格模型的处置流程0102030405对于检测不合格的PDX模型，需按照以下流程进行处置：隔离存放：将不合格模型转移至单独的隔离区域，避免污染其他样本；流程改进：针对不合格原因，优化相关的操作流程，避免类似问题再次发生。记录备案：详细记录不合格模型的编号、不合格原因、处置方式，纳入不良事件报告；无害化处理：采用高压灭菌或焚烧的方式对不合格模型进行无害化处理，避免病原体扩散；05文档管理与可追溯性文档管理与可追溯性文档管理是PDX模型检测合规性的核心保障，本规范要求实现所有检测流程的全链条可追溯。1检测记录的规范填写所有检测记录必须按照以下要求填写：01记录内容需包括：样本编号、接收时间、检测项目、操作人员、检测日期、对照实验结果、检测结果、复核人员签字；02记录需采用手写或电子签名的方式，不得涂改，若需修改，需划双线标注修改内容，并注明修改人与修改日期；03电子记录需采用加密存储，设置不同的访问权限，避免数据篡改。042档案存储与检索1检测档案需分为纸质版与电子版进行存储：2纸质版档案：存储于恒温恒湿的档案柜中，保存期限至少10年，符合药品监管的要求；3电子版档案：存储于加密的服务器中，采用云备份的方式保障数据安全性，可实现快速检