T-CVMA 167-2024 猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测方法

CCSB41T/CVMA167—2024猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测方法Magneticparticlechemiluminescencemethodfordetectionofantibody2024-5-23发布2024-5-23实施中国兽医协会发布IT/CVMA167—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由禾旭（郑州）生物技术有限公司提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：禾旭（郑州）生物技术有限公司、河南农业大学、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站、内蒙古自治区动物疫病预防与控制中心。本文件主要起草人：李秀梅、任雪建、刘近、乔宏兴、吕园园、魏战勇、陈磊、胡慧、杨转、刘明瑞、殷笑丹、杨志、王建龙、特木尔巴根、郭宇、杨晓帆、李亚静、陶飞飞、阴思晴、赵小月、高登军、王旭红、辛鹏、刘然、韩佳琪、宋小霞。T/CVMA167—20241猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测方法本文件规定了猪瘟病毒磁微粒化学发光抗体检测方法的试剂与耗材、器材与设备、操作步骤、试验成立条件和结果判定标准等内容。本文件适用于猪血清中猪瘟病毒免疫抗体或野毒感染抗体的检测，适用于该病的血清学监测、流行病学调查、免疫效果评估等工作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1反应杯reactioncup化学发光免疫分析仪配套使用的反应容器。3.2示踪物tracer吖啶酯标记的小反刍兽疫病毒单克隆抗体。3.3激发液excitationfluid激发液由激发液A和激发液B组成，与化学发光免疫试剂配合使用，是一种辅助试剂，为发光过程提供碱性环境。4符号和缩略语下列缩略语适用于本文件。MES溶液：4-吗啉乙磺酸溶液（4-Morpholineethanesulfonicacidsolution）2T/CVMA167—2024PBS：磷酸盐缓冲溶液（Phosphatebuffersaline）MEST溶液：4-吗啉乙磺酸吐温溶液（4-MorpholineEthylsulfonicAcidTweenSolution）PBST：磷酸盐吐温溶液（PhosphatebuffersalineinTween）NHS溶液：N-羟基丁二酰亚胺溶液（N-hydroxysuccinimidesolution）5技术原理采用竞争法的磁微粒直接化学发光检测技术检测猪瘟病毒抗体。将待测样品、猪瘟病毒E2抗原包被的磁性微球溶液以及吖啶酯标记的猪瘟病毒单克隆抗体示踪物混合；孵育一段时间洗涤后，加入激发液A和激发液B；在碱性条件下，吖啶酯分子的发射光强度达到最大，通过测量的发光值结果和既定的判定方法判定待测样品的阴阳性。6试剂与耗材6.1磁性微球溶液，制备方法见附录A。6.2示踪物，制备方法见附录B。6.3阴性对照和阳性对照，制备方法见附录C。6.4浓缩洗涤液，制备方法见附录D1。6.5激发液A，制备方法见附录D2。6.6激发液B，制备方法见附录D3。6.7其他相关试剂，制备方法见附录D。6.8化学发光免疫分析仪，操作步骤见附录E。7器材与设备7.1最大离心力8,000r/min以上的离心机。7.2化学发光免疫分析仪。7.32℃~8℃冰箱，-20℃冰箱。7.4规格为5mL和10mL的一次性采血器。7.51.5mL灭菌离心管。7.6反应杯。8实验前准备8.1样品采集及处理8.1.1进行静脉无菌采血，不少于2mL。采集静脉血时，每头猪使用一个采血器。T/CVMA167—202438.1.2将血液室温（15℃~25℃)静置于斜面2～4h，待血液自然凝固后，置高速冷冻离心机4,000r/min8.1.3用单道微量移液器吸出上层血清。血清应清亮，无溶血、无污染。8.2血清样品的存放与运送8.2.1血清样品若在一周内检测，可置2℃~8℃条件下保存。若超过一周检测，应置于-20℃以下冷冻保存，避免反复冻融。8.2.2运输时注意冷藏，采集的血清样品可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，应尽量在24h内完成样品运输。9操作步骤9.1将样品、阴性对照、阳性对照分别各加50μL至相应反应杯中，再分别加入20μL磁性微球溶液，混匀后，37℃反应15min。9.2各反应杯中加入300μL洗涤液，清洗3次。9.3在反应杯中加入吖啶酯标记的猪瘟病毒单克隆抗体示踪物100μL，混匀后，37℃温育10min。9.4重复步骤9.2后分别加入100μL激发液A和100μL激发液B。9.5化学发光免疫分析仪自动测定各反应杯发光值。10结果判定10.1试验成立条件阴性对照发光值与阳性对照发光值之比≥10，实验成立。10.2试验结果判定样品与阴性对照发光值之比＞0.4，样品判定为抗体阴性。样品与阴性对照发光值之比≤0.4，样品判定为抗体阳性。T/CVMA167—20244磁性微球溶液A.1E2重组蛋白的制备及纯化A.1.1生产用毒种的繁殖取生长良好的Sf9细胞，将毒种按照约1:100的比例感染贴壁细胞，约72h后待70%～80%的细胞出现CPE（增大或裂解）现象时，将细胞吹打下来，收集病毒液，即为生产用毒种。A.1.2E2重组蛋白病毒液的制备将Sf9细胞悬浮培养，初始接种密度应大于5×105个/mL，待细胞长至对数生长期时（细胞密度约～2×106个/mL按1%的比例接种生产用毒种，继续培养约3d后，观察细胞增大并将要裂解之前，离心收集培养上清。A.1.30.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）的配制将培养上清进行透析后，用阳离子交换柱纯化（SPSepharoseFastFLow）进行梯度洗脱，收集含有目标蛋白的组分，0.1moL/LpH9.0的Tris-HCL缓冲液调节pH值至7.5，用His-tag柱亲和纯化（NiSepharose6FastFLow收集目标蛋白组分，并用PB（20mmoL/LPB，150mmoL/L氯化钠，pH值7.0）透析，置-70℃以下保存备用。A.2磁珠微球溶液的制备A.2.1取0.2mg猪瘟病毒E2重组蛋白，装入透析袋中，置0.15moL/LpH值7.4的PBS室温（15℃~25℃)透析4h。A.2.2磁珠洗涤。取10mg羧基磁珠到离心管中，固定到磁力架上进行磁分离（或10,000r/min离心5min移除上清。向磁珠中加入1mL的MES溶液，振荡分散均匀后，磁分离（或10,000r/min离心5min）移除上清。重复用MES溶液磁分离洗涤2次，用0.5mLMES溶液重悬。A.2.3磁珠活化。向羧基磁珠重悬液中加入250μL的NHS溶液，振荡分散均匀，再加入125μL的EDC溶液，摇匀后固定在混匀器上室温（15℃~25℃)反应30min。反应结束后，磁分离，移除上清，用MES溶液磁分离洗涤2次。A.2.4抗原偶联。将上述磁珠用800μL的MEST溶液分散，加入透析后的抗原溶液，补加MEST溶液至总体积1mL，摇匀后固定在混匀器上室温（15℃~25℃)反应4h。反应结束后，磁分离，移除上清，用封闭液磁分离洗涤2次。收集每次洗涤的上清液。A.2.5封闭。加入1mL的封闭液，振荡分散均匀后，固定在混匀器上反应4h。A.2.6稀释离心，移除上清，用PBST磁分离洗涤3次，加入500mL的PBST重悬偶联后的磁珠，2℃~8℃保存备用。T/CVMA167—20245示踪物B.1标记单抗的制备B.1.1透析取500μL猪瘟病毒单克隆抗体（浓度2mg/mL装入透析袋中，置于透析液PBS中，室温（15℃~25℃)透析4h。B.1.2标记取出透析后的抗体溶液，加入洁净玻璃瓶中，再将吖啶酯溶液（浓度5.0mmoL/L）20μL加入抗体溶液中，避光，室温反应2h。B.1.3封闭反应后入10%（m/V）赖氨酸封闭，室温反应1h。B.1.4洗涤将标记抗体溶液，装入透析袋内，置于透析液中（0.05moL/LPBS，pH值7.4室温（15℃~25℃)透析过夜，中间换液2～3次。B.1.5保存取出透析后的标记抗体溶液，加等体积甘油，放置-20℃以下保存备用。B.2示踪物的制备将得到猪瘟病毒标记单克隆抗体用PBS缓冲液（0.01moL/L，pH值7.4）按照1:1,000稀释，加入0.02%Proclin-300混匀后经0.22μm滤器过滤，无菌分装，于2℃~8℃保存。T/CVMA167—20246阴性对照和阳性对照的制备C.1阴性对照的制备C.1.1采血对1头健康猪进行颈部静脉大量采血，经猪瘟病毒中和试验或间接ELISA方法或阻断ELISA方法或化学发光抗体检测检测为猪瘟病毒抗体阴性。C.1.2制备血清室温（15℃~25℃)待血液凝固后，37℃静置2h后，然后2℃~8℃静置1h，将析出的血清转移到离心瓶中，以2,000r/min离心5min，收集上清。C.1.3分装、冻干及保存将制备的血清混合均匀后，0.22μm滤膜过滤除菌，将血清与冻干保护剂按8.5:1比例混匀，无菌定量分装，1mL/瓶，冷冻真空干燥，置-70℃以下保存，标记为“猪瘟病毒抗体阴性血清”，同时注明制备日期等信息。C.2阳性对照的制备C.2.1免疫与采血用猪瘟病毒活疫苗于每头瘟病毒抗体阴性猪的耳背后肌肉注射，每头免疫1头份。重复免疫三次，每次免疫间隔1个月，最后免疫一次后，无菌采血，用商品化的猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测，当抗体效价不低于1:512时，无菌采集免疫猪血液。C.2.2制备血清室温（15℃~25℃)待血液凝固后，37℃静置2h后，然后2℃~8℃静置1h，将析出的血清转移到离心瓶中，以2,000r/min离心5min，收集上清液。C.2.3分装、冻干及保存将制备的血清混匀后，经0.22μm滤膜过滤除菌，将血清与冻干保护剂按8.5:1比例混匀，无菌定量分装，1mL/瓶，冷冻真空干燥，置-70℃下保存，标记为“猪瘟病毒抗体阳性血清”，同时注明制备日期等信息。T/CVMA167—20247其他相关试剂D.1浓缩洗涤液称取十二水合磷酸氢二钠72.5g、磷酸二氢钾5g、氯化钠200g、氯化钾5g，加入700mL双蒸水加热搅拌溶解，再加入12.5mL的吐温-20，而后加双蒸水定容至1,000mL。使用前将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释。1份25倍浓缩洗涤液加24份蒸馏水。D.2激发液A量取200mL纯化水，加入37%浓盐酸溶液8.33mL，加入30%过氧化氢溶液5.46mL，搅拌均匀加纯化水定容至1,000mL。定量分装，2℃~8℃保存。D.3激发液B量取200mL纯化水，加入氢氧化钠20g、十六烷基三甲基溴化铵5.7g，搅拌溶解，加入曲拉通X-1002.5mL，搅拌均匀加纯化水定容至1,000mL。定量分装，2℃~8℃保存。D.4PB溶液称取磷酸二氢钠（含2个结晶水）0.945g、磷酸氢二钠1.96g，加入800mL纯化水搅拌溶解，再加纯化水定容至1,000mL，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。D.5PBS溶液称取磷酸氢二钠（含12个结晶水）2.9g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g，加入800mL纯化水搅拌溶解，再加纯化水定容至1,000mL，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。D.6MES溶液称取9.76gMES、29.22gNaCl、5mL10%的Brij35，溶于1,000mL纯化水，调节pH为6.0，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。D.7NHS溶液称取10mg的NHS，溶于1mLMES溶液中，临用配制10min内使用。D.8EDC溶液称取10mg的EDC溶于1mLMES溶液中，临用配制10min内使用。D.9MEST溶液取800mLMES溶液（0.5moL/L，pH值6.0），加入0.05%Tween20，用MES溶液定容至1L。D.10封闭液量取800mLPBS（0.01moL/L，pH值7.4），加入10gBSA、0.5mL吐温-20、2mLProclin-300，搅拌均匀，PBS定容至1,000mL，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。T/CVMA167—20248D.11PBST溶液量取800mLPBS（0.01moL/L，pH值7.4），加入0.5mL吐温-20、2mLProclin-300，搅拌均匀，