杂合抗菌肽NK-LPD的设计与重组表达载体构建

绪论1.1背景目前，中国作为养殖淡水鱼的大国，其养殖面积以及总产量都处于世界前列。据2020年《中国渔业统计年鉴》的统计显示，中国淡水鱼养殖产量在2019年高达2548.03万吨，同比增长0.15%；同时2019年淡水养殖产值达到6186.60亿，同比增长5.14%[1]。淡水鱼是优质蛋白质的重要食物来源，氨基酸组成与人体相似，容易被人体消化吸收，不饱和脂肪酸的比例相对较高。因此，营养价值丰富且价格低廉的淡水鱼日益受到消费者的青睐。随着水产需求的增加，养殖方法和手段不断创新和发展，我国水产养殖的规模不断扩大，水产行业发展迅猛。但随之而来的便是水产疾病的冲击，由嗜水气单胞菌引起的细菌败血症、草鱼出血病、细菌性肠炎疾病等制约了水产的健康养殖，不利于水产养殖的稳定发展[2]。嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）是一种广泛分布于水体，空气，土壤等环境中的革兰氏阴性（G-）致病菌[3,4]，也是水产养殖过程中的常见病原菌之一[5]。养殖环境不良，动物体表破损等情况，极易导致养殖动物感染嗜水气单胞菌，患出血性败血症。以嗜水气单胞菌为主要病原菌的细菌性败血症正是造成水产养殖业损失最为严重的一类急性传染病。施用抗生素虽然是控制嗜水气单胞菌的有效途径，但抗生素的不当使用可能会引发细菌耐药性，其残留会导致一系列的健康和生态问题。目前我国已经广泛禁止抗生素在水产养殖中的应用。毫无疑问，开发新型、生物安全性高的抗菌药物的需求十分迫切。1.2抗菌肽抗菌肽（Antimicrobialpeptides，AMP）是生物体先天免疫系统的重要组成部分，在自然界生物中广泛存在，分子组成通常小于100个氨基酸，具有广谱抗菌活性和低细胞毒性等特点，对细菌、真菌、病毒等具有广泛的抑制作用[6]。其具有独特的抗菌作用机制，避免了生物体耐药性的产生，在治疗细菌感染方面具有广阔的前景。1.2.1结构特点抗菌肽结构种类丰富，从二级结构上看具有α螺旋、β折叠、无规则卷曲等类型，但不论什么类型的抗菌肽都具有一些共同特性，抗菌肽通常是由20-60个氨基酸残基组成。由于其碱性氨基酸比较多，例如赖氨酸、组氨酸和精氨酸等，通常带有2-7个正电荷，等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。抗菌肽具有一种特殊的特性，即它可以与由两性分子构成的细胞膜结合，这种细胞膜通常带有负电荷。正是这种特性使得抗菌肽能够与细菌细胞膜相互作用，并形成一种抗菌机制的结构基础[8]。1.2.2分类抗菌肽可按照来源、作用对象、所含氨基酸、空间结构等方面进行分类。=1\*GB3①按来源分类a.昆虫抗菌肽昆虫抗菌肽是昆虫在受到微生物感染或意外伤害时，在淋巴、血液及消化道中产生的一类抗菌肽。迄今发现的昆虫抗菌肽种类已经超过200种。昆虫抗菌肽以阳离子肽居多，氨基酸残基数一般少于100个。b.哺乳动物抗菌肽哺乳动物抗菌肽主要存在于中性粒细胞及皮肤和黏膜的上皮细胞,哺乳动物抗菌肽被分成两类，一类为防御素类抗菌肽，另一类为Cathelicidins抗菌肽。其中研究最多的防御素类抗菌肽，是抗菌肽家族最大的一类。c.两栖动物类抗菌肽两栖动物抗菌肽是一种由机体自身产生的小分子多肽，它可以被诱导产生，并且具有抗击外来病原菌的作用。这种抗菌肽是机体免疫系统中的重要组成部分，可以作为防御病原微生物入侵的第一道屏障[9]。d.鱼类、软体动物类、甲壳动物类抗菌肽目前已经分离出超过49种鱼类抗菌肽。在海洋软体动物中，防御素是一种重要的能够抵抗微生物的肽，贻贝防御素被分类成Defensin、Mytilin和Myticin三种，根据初级结构、性质和共有半胱氨酸序列进行分类。虾受到细菌感染后，会诱导多种基因表达，其中包含多种抗菌肽基因。从1997年起，甲壳类动物如对虾血细胞中分离出多种抗菌肽，现在已经获得了氨基酸全序列。e.植物抗菌肽植物防御素是一种存在于植物中的抗菌肽，其结构与昆虫和哺乳动物的防御素相似。这些植物抗菌肽对大多数植物病原菌具有很好的杀菌活性，而部分植物抗菌肽则对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞都具有毒性。这些植物防御素在植物的自我保护机制中起着重要作用，帮助植物抵御各种病原菌的攻击。f.细菌抗菌肽细菌抗菌肽是一种由细菌分泌的天然抗菌剂，包括阳离子肽和中性肽。这些抗菌肽可以对抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。在不同种类的细菌中，已经发现了多种不同类型的抗菌肽，如杆菌肽、短杆菌肽、多粘菌素和乳链菌肽等。这些抗菌肽的发现对于开发新型抗菌药物和治疗细菌感染具有重要意义。=2\*GB3②按作用对象分类抗菌肽按作用对象可分为抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等抗菌肽。=3\*GB3③按所含氨基酸分类抗菌肽所含氨基酸的种类可分为富含脯氨酸残基的抗菌肽如蛙皮素、富含Cys残基的抗菌肽如防御素和富含Gly残基的抗菌肽蜂毒素等[9]。=4\*GB3④按空间结构分类按抗菌肽的空间结构可将其分为α螺旋、β折叠或其他无规则的氨基酸残基[10]。1.2.3抗菌机制抗菌肽是一种能够杀死病原微生物的天然分子，它们的作用机制包括膜破坏性和非膜破坏性。抗菌肽通常是带正电荷的分子，可以与带负电荷的微生物表面结构相互作用，导致微生物细胞膜通透性增加，从而引起细胞死亡。此外，一些研究表明，抗菌肽还可以通过抑制微生物的核酸和蛋白质合成来发挥作用，从而导致微生物死亡。虽然不同抗菌肽的作用机制有所不同，但它们之间也存在着相互关联。=1\*GB3①抗菌肽膜靶向作用抗菌肽是一种能够与细胞膜表面相互作用的分子，通过与细胞膜上的负电荷区域相互作用，抗菌肽的疏水端插入细胞膜的脂质膜中，改变脂质膜的结构，从而影响细胞的正常功能。这种作用会导致细胞膜的通透性改变，形成跨膜电位，打破酸碱平衡，影响渗透压平衡，抑制呼吸作用等。总之，抗菌肽与细胞膜的相互作用对其抗菌活性起着至关重要的作用。目前，常用的至少有4个模型来描述抗菌肽的作用机制[11]。a为聚集体模型(aggregatechannelmodel)，即抗菌肽与细胞膜上的磷脂分子结合成复合物，当复合物被破坏时，抗菌肽就会进入到细胞内，同时细胞膜也会因为受到弯曲张力的影响而受损，最终导致细胞死亡。b为环孔模型(toroidalmodel)，抗菌肽分子聚集在细胞膜上，会直接垂直嵌入其中。这些分子会在细胞膜的疏水区域形成裂口，导致磷脂单分子层向内弯曲，最终形成一个直径为1-2nm的环孔。c为桶板模型(barrel-stavemodel)，抗菌肽可以在细胞膜表面聚集形成多聚体，并形成跨膜离子通道，使得外界的水分子和离子等物质可以通过这个通道进入细胞内部，同时细胞质也可以外流。这种情况下，如果过度聚集或过度通道形成，细胞膜可能会崩裂，导致细胞死亡。d为地毯模型(carpet-likemodel)，抗菌肽通过在细胞膜表面形成一层正电荷密集的“地毯”，从而破坏细胞膜并导致细胞死亡，这种破坏并不需要抗菌肽的特殊结构或形成孔道，而是通过覆盖在膜表面的数量达到一定程度的抗菌肽，使其像地毯一样覆盖在膜表面，以破坏细胞膜。在这个过程中，抗菌肽的正电荷需要分布于多肽全长，而不是只存在于特定的区域，并且抗菌肽始终与脂质头端作用，而没有多肽垂直重排的过程。=2\*GB3②抗菌肽非膜靶向作用抗菌肽不仅可以作用于细胞膜，还可以作用于细胞内的其他靶标。抗菌肽Nisin、Bacitracin等可以通过抑制细胞壁合成前体—脂质=2\*ROMANII、=3\*ROMANIII等来抑制细胞壁的合成[12]。BRAFFMAN等发现MicrocinJ2和Capistruin抗菌肽通过结合革兰氏阴性菌胞内的RNA聚合酶来抑制RNA聚合酶活性，并影响细菌的转录[13]。1.2.4生物学活性抗菌肽是一类广泛存在于生物界的多肽，具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤等多种生物活性，主要通过膜渗透、胞内结合、免疫调节等方式发挥作用。=1\*GB3①抗菌活性陈陈等通过研究发现高地芽胞杆菌CQC1正丁醇提取的抗菌肽提取物对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制活性，且较稳定[14]。赵连静等通过实验发现疏水性较大的F8L、F8I、HPRP-A1、F8W和F8V抗菌肽均对白假丝酵母及柔克假丝酵母有较好的抗菌活性，且疏水性越好，抗菌活性越强[15]。=2\*GB3②抗病毒活性王小方等通过研究抗菌肽MAF-1A、BPI和LL-37发现，它们都可以破坏病毒的结构或者包膜来达到抗病毒的作用[16]。=3\*GB3③抗肿瘤活性在数量众多的抗菌肽中，一些阳离子的抗菌肽具有独特的抗肿瘤功效，对多种肿瘤细胞都表现出强有力的杀伤作用[17]。如天蚕素、蛙皮素等能作用于微生物和肿瘤细胞同时不损伤正常的组织细胞[18]。1.2.5影响活性因素影响抗菌肽活性的因素主要有，空间构象、电荷和疏水性等。=1\*GB3①空间构象抗菌肽的抗菌活性与其空间构象密切相关。虽然抗菌肽也有一定的空间构象，如α-螺旋和β-折叠，但由于其一级结构较短，因此容易受到环境影响而发生构象改变，从而影响抗菌作用。因此，固定抗菌肽的空间构象是保持其抗菌活性的重要策略之一，这可以帮助抗菌肽在不同的环境中保持其特定的构象，从而发挥最佳的抗菌作用[19]。Mwangi等通过在靠近N-和C-末端的地方引入两个半胱氨酸残基，将线性的抗菌肽CathelicidinBF15-a3转化为环肽ZY4，使其具有良好的抗菌活性，且血清稳定性较高[20]。=2\*GB3②电荷研究表明，正电荷确实会提高抗菌活性,相反,负电荷的存在一定程度上使抗菌活性下降[21]。魏晓晓等设计将牛血红蛋白源AMPs的第1、2位的Val和Asp都替换为Arg后合成多肽之后，牛血红蛋白源AMPs的抗菌活性比原AMPs的高[22]。=3\*GB3③疏水性肽疏水性是细胞溶解酶膜肽发挥其生物活性的重要因素。为了能够在细胞内高浓度贮存和快速运输至目标微生物，肽必须具有一定的水溶性，这意味着其疏水性要相对较低。但是，为了能够扰乱微生物的双分子层膜结构并增加膜的渗透性，肽必须与双层膜的疏水区域相互作用，这需要肽具有一定的疏水性。因此，肽的疏水性需要达到一个平衡点，既能够保证其水溶性，又能够发挥其膜活性。这种平衡点的达成对于肽的生物活性至关重要[23]。Chen等通过用疏水性较弱的丙氨酸取代亮氨基或用亮氨酸残基取代丙氨酸残基，系统性地降低或增加疏水性，发现处于疏水性临界值时抗菌活性最强[24]。1.2.6定向改造的策略抗菌肽主要有两个方面的定向改造，一方面是对其进行密码子偏好性改造，另一方面是对其进行结构改造。=1\*GB3①密码子偏好性分析与定向改造毕赤酵母中以GAU、GAA、GCU、AUU、AAA、AAG为多数，其中GC%为42.7%。首先对目的基因进行有效密码子数统计，然后计算CDS区的GC含量、密码子中第3位碱基的GC含量、密码子使用的相对概率和密码子使用频率。最后将基因的密码子偏好性与酵母基因组的密码子偏好性进行比较分析，改造目的基因密码子，使其满足毕赤酵母的密码子偏好性。=2\*GB3②抗菌肽结构定向改造通过杂合抗菌肽的设计对抗菌肽进行氨基酸替换，指导新型抗菌肽的设计。并且理论计算改造后的影响抗菌效价、活性，如侧链大小、螺旋结构的倾向性、电荷（阳离子性）、整体疏水性、两亲性等参数是否有所优化。1.3NK-lysin的基本情况NK-lysin不仅具有抗菌、抗病毒和抗寄生虫活性，而且在鱼类抵抗病原体感染的先天免疫反应中发挥着重要的作用。这种蛋白质的来源非常特殊，它是由细胞毒性T细胞(cytotoxicT-lymphocytes)和自然杀伤淋巴细胞(naturalkillerlymphocytes)分泌出来的，因此它的生产和释放与免疫系统密切相关。对于鱼类来说，NK-lysin的作用尤为重要，因为鱼类在水中生活，容易受到各种病原体的侵袭，而NK-lysin可以帮助它们抵御这些病原体的攻击[25]。1.4Piscidin的基本情况Piscidin是一种具有重要生物学功能的蛋白质，其由18-26个氨基酸组成，呈α-螺旋结构，并且具有高度保守的氨基末端，富含组氨酸和苯丙氨酸。这种蛋白质最初是从杂交条纹鲈鱼的肥大细胞中分离得到的。Piscidin具有抗真菌、抗寄生虫和抗病毒的活性，因此在医学和农业领域有着广泛的应用前景。简而言之，Piscidin是一种具有重要生物学意义的多功能蛋白质[26]。1.5生物信息学分析生物信息学分析是指利用生物信息学工具、方法和技术对生命科学数据进行分析和研究的一个领域。它主要应用于分子生物学领域，是对大量生物信息数据进行有效处理、挖掘和分析的重要手段。生物信息学分析主要包括两大类：一类是对DNA、蛋白质等进行定量和定性分析；另一类是对复杂的生物信息数据进行图形化展示、可视化分析等。通过生物信息学分析，我们可以对指定的某一序列进行分析，了解它的氨基酸组成、亲/疏水性、跨膜结构、二级结构、三级结构等一系列数据，为人们了解基因组、蛋白质、代谢网络以及其他生物数据提供重要帮助。1.6重组表达载体构建载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。基因工程技术利用限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其他修饰酶对目标基因和载体DNA进行切割和修饰，然后将它们连接在一起，并将这个组合导入宿主细胞中。这样做可以确保目标基因在宿主细胞中得到正确的表达。按照宿主细胞来划分，蛋白质表达系统可以分为原核表达系统和真核表达系统两大类。1.6.1原核表达载体构建原核表达系统有大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统。其中，最常用的就是大肠杆菌表达系统。相较于其他表达系统，大肠杆菌表达系统具有许多优点。首先，由于其遗传背景清楚，其目的基因表达水平高，因此它能够高效地表达所需的蛋白质。其次，大肠杆菌表达系统的培养周期短，抗污染能力强，更易于生长和控制，这使得实验技术相对简单，成本也更为廉价。此外，大肠杆菌表达系统有各种各样的菌株和质粒可供选择，这使得科学家们能够根据实验需要选择最适合的菌株和质粒。总之，大肠杆菌表达系统是一种非常有优势的表达系统，被广泛应用于生命科学研究中。表达载体是一种质粒，它在受体细胞中用于表达外源基因，并且必须包含一些特定的DNA序列，以确保基因能够被转录和翻译成蛋白质。这些特定的DNA序列被称为表达元件，它们包括启动子、转录起始位点、翻译起始位点和终止位点等。表达载体的设计和构建对于基因工程和生物技术的研究具有重要意义，可以用于生产蛋白质、制造药物、研究基因功能等方面。1.6.2真核表达载体构建真核表达系统有酵母菌表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物细胞表达系统。其中，最常用的就是酵母菌表达系统。酵母是蛋白表达宿主细胞的良好选择。酵母细胞发酵简单、快速、便宜，易于遗传操作，具有蛋白质翻译后修饰功能，可分泌表达，纯化工艺简单且安全。原核表达系统虽然是常见的表达系统，但不具有蛋白质的翻译后修饰及加工，存在局限性。而真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系，表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质，利用真核表达系统可以诱导高效表达，加快人们对基因研究以及药物研究的进程。1.7SOE-PCR的原理及应用重叠延伸基因扩增技术简称SOE-PCR（genesplicingbyoverlapextensionpolymerasechainreaction）是一种通过寡聚核苷酸链之间互为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因的方法。1.7.1原理SOE-PCR的原理如下图所示，其中使用了四条引物，其中两条是标准引物，而另外两条则是特别设计的引物。这些引物被用于进行PCR克隆，以产生两个PCR产物。然后，这些产物被处理以添加特殊的接头，这些接头能够互补配对。最后，这些产物被使用接头进行PCR扩增，以将它们连接在一起，从而形成一段新的融合基因。这种方法允许在不需要内切酶的情况下，将两个基因连接在一起，从而产生新的基因组合。图1.1SOE-PCR的原理图1.7.2特点SOE-PCR的特点主要有以下三个方面：=1\*GB3①不需要通过酶切将不同的基因连接起来，仅需设计不同的引物便可将基因片段进行拼接。=2\*GB3②条件简单，不用合成基因。=3\*GB3③目的基因产物特异性好。1.7.3引物设计原则主要有以下几个引物设计原则：=1\*GB3①引物间的长度以18-30bp为最宜，且尽量避免富含GC的序列。=2\*GB3②引物的Tm值尽量保持一致，在介于55-60℃条件最佳。=3\*GB3③引物序列的GC含量最好为40%-60%。=4\*GB3④扩增产物的单链不能形成二级结构。=5\*GB3⑤引物最好设计在mRNA的跨外显子-外显子交界处或侧翼序列上。=6\*GB3⑥在引物3ˊ端最近5个碱基应含有G或C，但应避免超过3个。=7\*GB3⑦在引物5ˊ端添加限制性酶切位点或其他序列错配。=8\*GB3⑧一条引物的3ˊ端不能和另外一条引物的任何区域配对。=9\*GB3⑨引物不能含有反向重复序列或＞3bp的自互补序列。1.8研究内容及技术路线1.8.1研究内容本论文研究的主要内容有以下三个方面：=1\*GB3①设计杂合肽NK-LPD：通过比对NK-lysin与NKL-24的序列及Piscidin家族序列分别得到同源部分，再将它们进行拼接得到NK-LPD。=2\*GB3②对NK-LPD进行生物信息学分析：通过Expasy、PSORTIIprediction、TMHMM2.0、SMOP、SWISS-MODEL、DBAASP等在线网站对NK-LPD进行生物信息学分析。=3\*GB3③构建原核表达载体：根据大肠杆菌密码子偏好性设计NK-LPD的序列，再根据序列设计三条引物，通过SOE-PCR扩增NK-LPD，将其与pET-32a进行双酶切，构建重组表达载体，对其进行核酸电泳检测，确保表达载体构建成功，再将表达载体转化到大肠杆菌感受态中，最后对其进行阳性克隆筛选和分析。1.8.2技术路线图图1.2技术路线图2NK-LPD的设计及生物信息学分析本文所采用的生物信息学分析网站和软件如下表所示。表2.1生物信息学分析网站和软件分析工具网址分析内容DNAMAN-序列比对ProtParamtool/protparam/理化性质PeptideCutter/peptide_cutter/酶解位点PSORTIIprediction/psort.html?src=leftbar亚细胞定位ProtScale/resources/protscale亲/疏水性SignalP4.1https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/信号肽TMHMM2.0https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/跨膜结构HelicalWheelProjections/cgi-bin/wheel.cgi螺旋轮图SMOPhttps://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html二级结构SWISS-MODEL/interactive三级结构DBAASP/tools?page=property-calculation抗菌活性2.1NK-LPD的设计2.1.1NK-lysin与NKL-24比对shan等分析了NKL-24的抗菌活性，而NKL-24由24个残基组成，这些残基构成斑马鱼NK-lysinSapB结构域H2和H3的α-螺旋[27]。由此可以推测出NK-lysin与NKL-24的同源部分也有抗菌活性。取银鲫NK-lysin氨基酸序列与NKL-24氨基酸序列如下表所示。表2.2NK-lysin与NKL-24序列名称氨基酸序列NK-lysinMLRRIVLITLLVSSVCALHWEMHKEASIGNGFEENSGEIETEQLPGKCWACNWVMKKLKKQISNGATPEDIKIKLGMICDEIGFLKSMCRNLVNQFTDILVEELSTTDDARTICANLNKL-24IKNQLAIVCDGIGFLKSLCRWFVN-NH2在DNAMAN软件上将上述氨基酸序列进行比对，结果如图2.1所示，获得同源部分：IKIKLGMICDEIGFLKSMCRNLVN。图2.1NK-lysin与NKL-24序列比对2.1.2Piscidin家族序列比对从NCBI数据库中收集Piscidin家族的氨基酸序列如表2.3所示。表2.3Piscidin家族的氨基酸序列名称序列号氨基酸序列Piscidin-3P0C006.1FIHHIFRGIVHAGRSIGRFLTGPiscidin（Dicentracine）P59906.1MKCATLFLVLSMVVLMAEPGDAFFHHIFRGIVHVGKSIHKLVTGGKAQQDQQDQQYQQDQQDQQAEQYQRFNRERAAFDChainA，Piscidin-32MCW_AFIHHIFRGIVHAGRSIGRFLTGX续表2.3名称序列号氨基酸序列Piscidin1QNV47924.1MKCATLFLVLSMVVLMAEPGDAFFHHIFRGIVHVGKTIHRLVTGGKAQQDQQDQQYQQDQQDQQAQQYQRFNRERAAFDClass=1\*ROMANIPiscidin3APQ32046.1MRCITLFLVLSMVVLMAEPGDAFIHHIFRGIVHAGRSIGRFLTGGKAQQEREQQDQRFMDRERDAFNChainA，Piscidin_AA2OJO_AFFHHIFRAIVHVAKTIHRLVTGChainA，Piscidin_PG2OJN_AFFHHIFRPIVHVGKTIHRLVTGPiscidin（Moronecidin）2JOS_AFFHHIFRGIVHVGKTIHRLVTGPiscidin（Moronecidin）2MCU_AFFHHIFRGIVHVGKTIHRLVTGXPiscidin-1Q8UUG0.1MKCATLFLVLSMVVLMAEPGDAFFHHIFRGIVHVGKTIHRLVTGGKAEQDQQDQQYQQEQQEQQAQQYQRFNRERAAFDPiscidin-2Q8UUG2.1MKCATLSLVLSMVVLMAEPGDAFFHHIFRGIVHVGKTIHKLVTGGKAEQDQQDQQYQQDQQDQQAQQYQRFNRERAAFDPiscidin4QNV47926.1MKCITLFLVLSMVVLMAEPGDAFIHHIFRGIINAGKSIGRFITGGKAQQESEQQDQRFLDREREAFN在DNAMAN软件上将上述序列进行比对，Piscidin家族序列比对结果如图2.2，获得保守序列：HHIFRGIVH。图2.2Piscidin家族序列比对结果2.1.3设计NK-LPD根据上述序列比对结果，选取银鲫抗菌肽NK-lysin与NKL-24的同源部分和Pisicdin的保守序列HHIFRGIVH，将它们用两个甘氨酸进行接头处理，两个片段通过连接得到了新型杂合肽序列，把它命名为NK-LPD：HHIFRGIVHGGIKIKLGMICDEIGFLKSMCRNLVN2.2NK-LPD生物信息学分析2.2.1理化性质理化性质主要有分子量、理论等电点、氨基酸和原子组成、消光系数、估计半衰期、不稳定性指数、脂肪族指数、总平均亲水性、疏水性、酶解位点等。=1\*GB3①利用Expasy中的ProtParamtool在线网站，分析杂合抗菌肽NK-LPD的理化性质。ProtParamtool是Expasy的一个工具，可以帮助用户分析蛋白质的物理和化学性质以及结构。通过输入蛋白质序列，该工具可以计算出分子量、理论等电点、氨基酸和原子组成、消光系数、估计半衰期、不稳定性指数、脂肪族指数和总平均亲水性（GRAVY）等参数。这些参数可以帮助用户更好地理解蛋白质的性质和结构。表2.4NK-LPD的基本信息名称信息结果氨基酸残基数35-分子式C176H290N52O43S4-分子量3950.80-原子数565-续表2.4名称信息结果理论等电点9.39-正电荷氨基酸总数5-负电荷氨基酸总数2-哺乳动物网织红细胞半衰期3.5h-酵母半衰期10min-大肠杆菌半衰期>10h-不稳定系数15.53稳定脂肪系数116.86-总平均亲水性值0.403-表2.5NK-LPD的氨基酸组成氨基酸数量百分比氨基酸数量百分比Ala(A)00.0%Leu(L)38.6%Arg(R)25.7%Lys(K)38.6%Asn(N)25.7%Met(M)25.7%Asp(D)12.9%Phe(F)25.7%Cys(C)25.7%Pro(P)00.0%Gln(Q)00.0%Ser(S)12.9%Glu(E)12.9%Thr(T)00.0%Gly(G)514.3%Trp(W)00.0%His(H)38.6%Tyr(Y)00.0%Ile(I)617.1%Val(V)25.7%Pyl(O)00.0%Sec(U)00.0%图2.3NK-LPD氨基酸组成=2\*GB3②酶解位点预测利用Expasy中的PeptideCutter在线网站分析NK-LPD的酶解位点。表2.6NK-LPD的酶解位点序号酶剪切数量剪切位点1糜蛋白酶111、2、4、9、16、18、25、26、29、332精氨酸-C蛋白酶25、313胃蛋白酶（PH＞1.3）516、24、25、26、324天冬氨酸-N内肽酶+N-末端谷氨酸220、215蛋白酶K143、4、7、8、12、14、16、19、22、23、25、26、33、346葡萄球菌肽酶=1\*ROMANI1227嗜热菌蛋白酶142、3、6、7、11、13、15、17、18、24、25、28、32、338胰蛋白酶55、13、15、27、31由上表可知，NK-LPD能被8种酶酶切，其中除10、30、35个位点为非酶切位点，其余位点均可被一种或多种酶酶切。=3\*GB3③蛋白的亚细胞定位预测亚细胞定位技术是一种非常重要的研究工具，可以帮助科学家们更深入地了解细胞内部的结构和功能。通过确定蛋白质或其他表达产物在细胞中的位置，我们可以更好地理解它们在细胞中的作用，这对于研究基因功能以及疾病发生机制都非常有帮助。利用PSORTIIprediction在线网站对NK-LPD进行分析，结果如图2.4所示。图2.4亚细胞定位结果由上图结果可以看出NK-LPD的亚细胞定位有65.2%在细胞质内，13.0%在线粒体内，13.0%在细胞核内，4.3%在液泡内还有4.3%在质膜上。=4\*GB3④亲/疏水性预测利用Expasy中的Protscale在线网站，分析NK-LPD的疏水性，滑窗大小为11，利用线性加权模型，其结果如图2.5所示。图2.5NK-LPD的疏水性曲线由上述结果，可以看出在21位氨基酸处，得到最大值为1.455，在26、27位氨基酸处得最小值为-0.100，在杨红艳对天蚕素抗菌肽生物信息学分析中提到，其研究的天蚕素抗菌肽疏水性残基占其总数的45%-68%，从而预测其抗菌肽有较高的抗菌活性和较低的溶血活性[28]，而NK-LPD的疏水性残基占其总数的48.57%，为亲水性抗菌肽，并且预测其有较高的抗菌活性和较低的溶血活性。=5\*GB3⑤信号肽预测利用SignalP4.1在线网站对NK-LPD的信号肽进行分析，结果如下图所示。图2.6NK-LPD的信号肽结果C-Score的最高处为信号肽剪切位点，由上图可知，NK-LPD没有信号肽剪切位点，S-Score显示的是信号肽，数值越接近于1，就越有可能有信号肽产生，而由上图可知，NK-LPD没有信号肽。，预测其为非分泌蛋白。冯志国等通过预测SK66的信号肽发现，SK66没有信号肽剪切位点，预测其为非分泌蛋白[29]。NK-LPD的预测结果与其类似。=6\*GB3⑥跨膜结构预测利用TMHMM2.0对NK-LPD的跨膜结构进行预测，其结果如下图。图2.8NK-LPD的跨膜结构预测结果由上图预测结果可知，NK-LPD没有跨膜结构。=7\*GB3⑦螺旋轮图预测利用HelicalWheelProjections绘制杂合肽NK-LPD的螺旋轮图，如下图所示。图2.9NK-LPD的螺旋轮图2.2.2结构预测NK-LPD的结构预测主要有二级结构和三级结构预测。=1\*GB3①二级结构预测利用SMOP在线网站对NK-LPD的二级结构进行预测，结果如下图所示。图2.10NK-LPD的二级结构表2.7NK-LPD各个结构占比结构数量百分比结构数量百分比Alphahelix(Hh)3085.71%Extendedstrand(Ee)00.00%续表2.7结构数量百分比结构数量百分比310helix(Gg)00.00%Betaturn(Tt)25.71%Pihelix(Ii)00.00%Bendregion(Ss)00.00%Betabridge(Bb)00.00%Randomcoil(Cc)38.57%由上表可以看出，NK-LPD中α螺旋占比85.71%，β折叠占比5.71%，无规则卷曲占比8.75%，NK-LPD主要由α螺旋构成。=2\*GB3②三级结构预测利用SWISS-MODEL在线网站分析NK-LPD的三级结构，如下图所示。图2.11NK-LPD的三级结构2.2.3抗菌活性预测DBAASP（抗菌活性和肽结构）的数据库是一种开放式综合数据库，包含有关具有具有抗微生物性质的肽的氨基酸序列，化学修饰，3D结构，生物活化和毒性的信息。DBAASP提供了多种工具，包括相关物理化学性质的复杂多因素分析。此外，DBAASP已经实现了一个结构建模流水线，可自动执行数据库肽的分子动力学（MD）模拟的设置，执行和上载[30]。利用DBAASP在线网站对NK-LPD的抗菌活性进行预测，其结果如下表所示。表2.8NK-LPD对各个菌种的抗菌活性预测抗菌肽菌种抗菌活性预测值NK-LPD细菌EscherichiacoliATCC25922无0.72NK-LPD细菌PseudomonasaeruginosaATCC27853无0.84NK-LPD细菌Klebsiellapneumoniae无0.7NK-LPD细菌StaphylococcusaureusATCC25923无0.79续表2.8抗菌肽菌种抗菌活性预测值NK-LPD真菌Candidaalbicans无0.55NK-LPD真菌Saccharomycescerevisiae无0.55NK-LPD病毒DENV-1有0.76NK-LPD病毒DENV-2有0.65NK-LPD病毒HIV-1有0.54NK-LPD病毒Japaneseencephalitisvirus(JEV)有0.89NK-LPD病毒MERS-CoV有0.77NK-LPD病毒SARS-CoV有0.77NK-LPD病毒SARS-CoV-2有0.77NK-LPD病毒WestNilevirus(WNV)有0.61NK-LPD病毒Zikavirus(ZIKV)有0.63NK-LPD病毒HepatitisCvirus(HCV)有0.87NK-LPD病毒HSV-1无0.6NK-LPD病毒VesicularStomatitisVirus(VSV)无0.55NK-LPD溶血活性Humanerythrocytes无0.79从上述预测表可知，NK-LPD具有较广泛的抗病毒活性，且对人类红细胞没有溶血活性。与上文NK-LPD具有较低溶血活性预测结果一致。2.2.4小结NK-LPD的分子式为C176H290N52O43S4，理论等电点为9.39，不稳定系数为15.53，脂肪系数为116.86，它总共含有5个正电荷氨基酸和2个负电荷氨基酸，在哺乳动物网织红细胞中的半衰期为3.5h，在酵母中的半衰期为10min，在大肠杆菌中的半衰期>10h，其总共有35个氨基酸残基，由14种氨基酸组成，其中异亮氨酸占比最多，为17.1%。NK-LPD能被8种酶酶切：糜蛋白酶、精氨酸-C蛋白酶、胃蛋白酶（PH＞1.3）、天冬氨酸-N内肽酶+N-末端谷氨酸、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶，其中除10、30、35个位点为非酶切位点，其余位点均可被一种或多种酶酶切。NK-LPD的亚细胞定位有65.2%在细胞质内，13.0%在线粒体内，13.0%在细胞核内，4.3%在液泡内还有4.3%在质膜上。由疏水性曲线可以得到在21位氨基酸处，最大值为1.455，在26、27位氨基酸处得最小值为-0.100，其中疏水性残基占其总数的48.57%，为亲水性抗菌肽。NK-LPD没有信号肽和跨膜结构，预测其为非分泌蛋白。NK-LPD由α螺旋、β折叠和无规则卷曲构成，其中占比最多的为α螺旋，占比85.71%。在DBAASP分析中可以得知NK-LPD对细菌和真菌没有抗菌活性，而具有较广泛的抗病毒活性，且对人类红细胞没有溶血活性。3原核表达载体构建3.1实验材料与设备3.1.1实验材料（1）菌株与质粒表3.1主要菌株、质粒及其来源名称来源pET-32a质粒实验室保存大肠杆菌BL21（DE3）TAKARa生物公司DH5α感受态细胞TAKARa生物公司（2）实验耗材表3.2主要实验耗材及其来源名称规格来源DL2000DNAMarker生物试剂TAKARa生物公司DL10000DNAMarker生物试剂TAKARa生物公司DL500DNAMarker生物试剂生工生物工程（上海）股份有限公司2Mixmaster-重庆擎科新业有限公司6LoadingBuffer-生工生物工程（上海）股份有限公司PCR产物纯化回收试剂盒-生工生物工程（上海）股份有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒-生工生物工程（上海）股份有限公司琼脂糖分子生物级GeneCompanyLimited氨苄青霉素USPGrade生工生物工程（上海）股份有限公司酵母提取物生物试剂OXOID蛋白胨生物试剂生工生物工程（上海）股份有限公司琼脂生物试剂成都市科龙化工试剂厂氯化钠分析纯成都市科龙化工试剂厂3.1.2主要仪器与设备表3.3主要仪器与设备名称型号来源超净工作台SW-CJ-IFD苏净安泰紫外可见分光光度计6132Eppendorf高速冷冻离心机5407Eppendorf蛋白质电泳系统042BR12426BIO-RAD电脑三恒多用电泳仪DYY-12北京市六一仪器厂电热恒温水浴锅DZKW-S-6北京市永光明医疗仪器厂磁力搅拌器MS-H280-Pro大龙兴创实验仪器（北京）有限公司微波炉G80D23CN2P-17北京格兰仕集团有限公司振荡器QL-901海门市其林贝尔仪器制造有限公司PCR仪A200杭州朗基科学仪器有限公司高压灭菌锅YXQ-LS-18S1上海博迅实业有限公司真空干燥箱DZF-6020上海齐欣科学仪器有限公司恒温培养箱SPX-250上海跃进医疗器械有限公司电子天平FA2104B上海越平科学仪器有限公司恒温振荡培养箱ZQTY-70N上海知楚仪器有限公司蓝光切胶仪G500312生工生物工程（上海）股份有限公司凝胶成像系统1100/26MQuantumST43.1.3主要培养基及溶液配制表3.4主要培养基和溶液配制表培养基/溶液配方LB培养基0.5%酵母提取物、1%蛋白胨、1%氯化钠、1.5%琼脂（固体）SOC培养基2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.05%NaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4、20mM葡萄糖5TBE缓冲溶液（1L）54gTris碱、27.5g硼酸、20mL0.5MEDTA加水定容至1L3.2实验方法3.2.1引物设计根据设计的杂合肽NK-LPD氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，反翻译得到基因序列为：CATCATATTTTTCGCGGCATTGTGCATGGCGGCATTAAAATTAAACTGGGCATGATTTGCGATGAAATTGGCTTTCTGAAAAGCATGTGCCGCAACCTGGTGAAC。并在5ˊ和3ˊ端分别加上EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点和保护性碱基便于后续进行质粒构建，得到基因序列为：CGGAATTCCATCATATTTTTCGCGGCATTGTGCATGGCGGCATTAAAATTAAACTGGGCATGATTTGCGATGAAATTGGCTTTCTGAAAAGCATGTGCCGCAACCTGGTGAACCTCGAGCGG根据基因序列设计了3条引物用于SOE-PCR合成NK-LPD基因序列。表3.5设计所得引物引物名称序列Tm/℃NY1CGGAATTCCATCATATTTTTCGCGGCATTGTGCATGGCGGCATTAAAATT70NY2CAGAAAGCCAATTTCATCGCAAATCATGCCCAGTTTAATTTTAATGCCGCCATG70NY3CCGCTCGAGGTTCACCAGGTTGCGGCACATGCTTTTCAGAAAGCCAATTTCATC743.2.2SOE-PCR扩增=1\*GB3①第一轮PCR使用引物NY1和NY2互为模板进行PCR扩增，具体扩增体系(50μL)如表4.2所示，将所需试剂加入到PCR反应管中，混匀后置于PCR仪中，设置PCR条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，62C退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸5min，4℃保存。收集PCR产物并将其作为第二轮PCR扩增的模版。表3.6第一轮PCR扩增体系组分体积/µL10×PCRBuffer5NY11NY21续表3.6组分体积/µL2.5mMdNTPs4PfuDNAPolymerase0.5ddH2O38.5Total50=2\*GB3②第二轮PCR以第一轮PCR获得的产物为模版，使用引物NY1与引物NY3进行PCR扩增，PCR体系如表4.3所示，将试剂加入PCR反应管中，混匀后置于PCR仪中，设置反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，扩增循环40次；72C延伸5min，4℃保存。PCR反应结束后所得产物即为目的基因NK-LPD。表3.7第二轮PCR扩增体系组分体积/µL10×PCRBuffer5NY1NY22NY11NY312.5mMdNTPs4PfuDNAPolymerase0.5ddH2O36.5Total503.2.3表达载体pET-32a-NK-LPD的构建用双酶切将目的基因与表达载体连接，将其转化到大肠杆菌中，并进行验证。=1\*GB3①双酶切将上一步获得的基因和重组表达载体pET-32a分别用EcoRⅠ和XhoⅠ酶进行双酶切，37℃反应2h后，用10×Loadingbuffer终止反应。1%琼脂糖凝胶电泳后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因。将双酶切的片段和pET-32a载体按1:4的体积比混合，加入等体积LigationMix在25℃反应5min，构建重组表达载体。表3.8双酶切反应体系组分NK-LPDpET-32addH2O13.8μL40.7μLBuffer2.12.5μL5μL续表3.8组分NK-LPDpET-32aDNA7.7μL2.3μLEcoRI0.5μL1μLNotI0.5μL1μL总体积25μL50μL=2\*GB3②感受态细菌转化实验首先，从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，并将其放置在冰盒中。接着，加入连接液，轻轻混匀后将其置于冰浴中30min。然后，将其放置于42℃金属浴中2min，并迅速放置于冰浴中冷却90s。接下来，加入900μL在37℃中预热的SOC培养基，并混匀后在37℃振荡培养1h以复苏菌液。最后，取200μL涂布于含氨苄的LB固体培养基，放置在37℃的培养箱中直到单菌落长出。=3\*GB3③基因序列测序验证挑取阳性克隆培养过夜后，将菌液送至上海生工进行序列测定，然后使用SnapGene对测得的核苷酸序列进行分析比较。3.3实验结果与讨论3.3.1SOE-PCR扩增结果采用SOE-PCR扩增技术对NK-LPd基因进行扩增，第一次PCR使用NY1和NY2互为模板进行扩增得到中间产物，经3%琼脂糖电泳检测结果如图3.1所示，在86bp处出现明显的条带。图3.1第一轮PCR核酸电泳检测结果切胶回收后以此为模板，NY1和NY3作为引物进行第二次PCR，经3%琼脂糖电泳检测结果如图3.2，在122bp处得到与预期大小相符的目的条带，证明成功扩增得到目的基因。图3.2第二轮PCR核酸电泳检测结果3.3.2表达载体pET-32a-NK-LPD的构建结果将NK-LPD基因与表达载体pET-32a采用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切处理，经1%琼脂糖电泳检测发现酶切后的条带略低于酶切前。将酶切后的条带切胶回收与载体连接。图3.3双酶切结果M1：DL500DNAMarker，1、2、3：基因与载体双酶切后，4、5、6：基因与载体双酶切前M2:DL10000DNAMarker图3.4重组表达载体pET-32a-NK-LPD图谱3.3.3菌落PCR验证结果以菌落PCR的方法筛选阳性克隆，从平板上挑取10个抗性菌落，以T7和T7ter为引物进行PCR扩增，含有空载体的菌落作为阴性对照。图3.5菌落PCR验证结果M：DL2000DNAMarker,1-10:pET-32a-NK-LPD/BL21，11:pET-32a/BL21结果如图所示，NK-LPD基因加上载体部分片段为790bp，孔道11为阴性对照，大小为713bp，说明NK-LPD基因成功导入进了pET-32a载体中。周必英等在菌落PCR鉴定中得到了TSO45W-4B-TSOL18融合基因的长度与预期大小一致，证明TSO45W-4B-TSOL18转入到了载体pMD18-T中[31]。曹洋等在菌落PCR验证，经琼脂糖凝胶电泳分析发现，在381bp处检测到与预期结果一致的条带，成功构建环状RNA表达载体pcDNA3.1(+)CircRNA-mmu-Pax3.1[32]。3.3.4重组质粒测序鉴定结果图3.6基因序列测序结果本研究测序结果如图3.6所示，在序列两端添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点得到的序列与预先设计的杂合肽序列相同，说明NK-LPD成功导入到了表达载体中。周必英等在重组质粒测序验证中将合成的TSO45W-4B-TSOL18融合基因亚克隆到pGEX-1λT载体的BamHⅠ和EcoRⅠ位点,测序结果与预期序列100%匹配，证明TSO45W-4B-TSOL18转入到了载体pMD18-T中[31]。曹洋等在测序验证中发现插入序列与小鼠Pax3基因的外显子6、7的序列完全相同,表明环状RNA表达载体构建成功[32]。4总结嗜水气单胞菌是弧菌科气单胞菌属，是一种广泛分布于水体，空气，土壤等环境中的革兰氏阴性（G-）致病菌，该菌可引起出血病、介水传染病等疾病，在公共卫生和水产养殖中占有举足轻重的地位。嗜水气单胞菌作为一种重要的人-畜-鱼共患病病原，除感染鲤科，还可感染大鲵、乌鳢等鱼类，鸭、水貂和人也是其感染的宿主，目前仍然是水产养殖中危害最大、最普遍的一类病原菌。本研究针对淡水养殖的重要品种—银鲫的养殖过程中的嗜水气单胞菌病害进行防治研究，抗菌肽是新的抗菌治疗药物，相比于传统的抗生素，抗菌肽具有广谱抗菌活性和低细胞毒性等特点，拥有独特的作用机制，且避免了耐药性的产生。因此，本研究设计了杂合抗菌肽NK-LPD，以期解决水产养殖中嗜水气单胞菌对水产的危害和带来的经济损失。本研究首先通过比对NK-lysin与NKL-24得到其同源部分序列：IKIKLGMICDEIGFLKSMCRNLVN再将Piscidin家族进行序列比对，得到其保守序列：HHIFRGIVH，最后将上述序列进行拼接，获得杂合抗菌肽NK-LPD：HHIFRGIVHGGIKIKLGMICDEIGFLKSMCRNLVN。然后对NK-LPD进行生物信息学分析，得到了它的氨基酸组成、理论等电点、半衰期、酶解位点、信号肽、跨膜结构、二级结构、三级结构、螺旋轮图、抗菌活性等。从生物信息学分析中可知，NK-LPD的分子式为C176H290N52O43S4，理论等电点为9.39，不稳定系数为15.53，脂肪系数为116.86，它总共含有5个正电荷氨基酸和2个负电荷氨基酸，在哺乳动物网织红细胞中的半衰期为3.5h，在酵母中的半衰期为10min，在大肠杆菌中的半衰期>10h，其总共有35个氨基酸残基，由14种氨基酸组成，其中异亮氨酸占比最多，为17.1%。NK-LPD能被8种酶酶切：糜蛋白酶、精氨酸-C蛋白酶、胃蛋白酶（PH＞1.3）、天冬氨酸-N内肽酶+N-末端谷氨酸、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶，其中除10、30、35个位点为非酶切位点，其余位点均可被一种或多种酶酶切。NK-LPD的亚细胞定位有65.2%在细胞质内，13.0%在线粒体内，13.0%在细胞核内，4.3%在液泡内还有4.3%在质膜上。由疏水性曲线可以得到在21位氨基酸处，最大值为1.455，在26、27位氨基酸处得最小值为-0.100，其中疏水性残基占其总数的48.57%，为亲水性抗菌肽。NK-LPD没有信号肽和跨膜结构，预测其为非分泌蛋白。NK-LPD由α螺旋、β折叠和无规则卷曲构成，其中占比最多的为α螺旋，占比85.71%。在DBAASP分析中可以得知NK-LPD对细菌和真菌没有抗菌活性，而具有较广泛的抗病毒活性，且对人类红细胞没有溶血活性。最后根据基因序列设计三条引物，通过SOE-PCR对NK-LPD进行扩增，第一次PCR使用NY1和NY2互为模板进行扩增得到中间产物，将中间产物为模板，NY1和NY3作为引物进行第二次PCR，第二轮PCR经3%琼脂糖电泳检测，在122bp处得到与预期大小相符的目的条带，证明成功扩增得到目的基因。将基因与重组表达载体pET-32a分别用EcoRⅠ和XhoⅠ酶进行双酶切，得到原核表达载体pET-32a-NK-LPD，经1%琼脂糖电泳检测发现酶切后的条带略低于酶切前。通过菌落PCR和重组质粒测序来验证基因是否成功插入表达载体中，在菌落PCR中从平板上挑取10个抗性菌落，以T7和T7ter为引物进行PCR扩增，含有空载体的菌落作为阴性对照，NK-LPD基因加上载体部分片段为790bp，孔道11为阴性对照，大小为713bp，说明NK-LPD基因成功导入进了pET-32a载体中，在重组质粒测序中挑取阳性克隆培养过夜后，将菌液送至上海生工进行序列测定，然后使用SnapGene对测得的核苷酸序列进行分析发现在序列两端添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点得到的序列与预先设计的杂合肽序列相同，NK-LPD顺利插入表达载体中，表达载体构建成功。5展望随着高密度、集约化水产养殖的发展，在过度使用抗生素的背景下，寻求抗生素替代物成为当下的趋势。抗菌肽具有广谱抗菌活性和低细胞毒性等特点，是非常具有潜力的能代替抗生素的细菌感染治疗药物。抗菌肽已经在水产养殖中发挥了作用，不仅能提高生产性能，还能提高水产的免疫功能、抗氧化能力，并且还能促进水产的肠道健康[33]。姜珊等通过嗜水气单胞菌攻毒实验发现，在饲料中添加重组中国对虾抗菌肽的吉富罗非鱼存活率明显高于未添加重组中国对虾抗菌肽的吉富罗非鱼，并且显著提高了它的过氧化物酶体的活性[34]。王自蕊等通过实验发现，在湘云鲫的饲料中添加150mg/kg的天蚕素抗菌肽后湘云鲫的增重率和特定生长率分别提高了37.4%和27.5%[35]。史庆超等通过实验发现在高吉富罗非鱼的饲料中添加抗菌肽还能显著提高吉富罗非鱼肠道脂肪酶和蛋白酶的活性[36]。抗菌肽不仅在水产中发挥作用，抗菌肽因其广谱抗菌活性和不易产生耐药性的特点，使其在生活中的各个方面都有涉及。刘春辉等通过研究抗菌肽在消炎祛痘产品中的应用，研究显示了抗菌肽具有调节皮肤皮脂分泌，并且对痤疮丙酸杆菌等细菌有良好的抑制作用，实验表明抗菌肽对青春痘、暗疮、粉刺等预防和治疗非常有效，并且安全无刺激[37]。高瑞佳通过研究发现体外试验中抗菌肽对马拉色菌有抑制作用，且其抑菌效果与浓度呈正比例关系，使用安全性高，不易产生耐药性，副作用少，抑制马拉色菌的效果明显，可用于临床上由于马拉色菌异常增多导致的头屑问题[38]。抗菌肽虽然具有分子量小、广谱抗菌性、不易产生耐药性和较好的食品安全性等诸多优点，但仍存在着一些亟待解决的问题。一是提高获取抗菌肽的能力。若直接从生物体提取纯化抗菌肽，则会面临提取的抗菌肽含量低、资源受限、成本高，无法大规模批量生产等一系列问题。若通过化学合成的方式制备小分子抗菌肽，则难以保持抗菌肽的活性构象，合成成本较高。蛋白酶水解抗菌蛋白可以大批量、低成本地获取具有抗菌活性的水解产物，但水解产物中非抗菌活性产物较多，使用安全性难以完全掌控。利用基因工程方法获取抗菌肽，表达载体菌容易分泌蛋白酶使抗菌肽降解，同时抗菌肽的产生会抑制甚至杀灭表达载体菌。二是提高抗菌肽的抗菌活性。抗菌肽虽然能够替代抗生素预防水产动物疾病，但抗菌肽的抗菌谱及活力与传统抗生素的抗菌效果还有差距。三是抗菌肽药用机理问题。在水产养殖临床应用上，缺乏深入的对抗菌肽的毒理性及药理药效研究，特别是在使用剂量、给药方式和作用时间等内容还需要深入研究。四是兼具高抗菌活性、广抗菌谱和低毒性等优点的新型抗菌肽还有待进一步研究[33]。参考文献农业农村部渔业渔政管理局,全国水产技术推广总站,中国水产学会.中国渔业统计年鉴[M].北京：中国农业出版社,2020.朱湘强.水产养殖疾病的预防及治疗技术[J].江西水产科技,2020,(3):33-36.DaskalovH.TheimportanceofAeromonashydrophilainfoodsafety[J].Foodcontrol,2006.17(6):474-483.HayatgheibN,MoreauE,CalvezS,LepelletierD.AreviewoffunctionalfeedsandthecontrolofAeromonasinfectionsinfreshwaterfish[J].Aquacultureinternational.2020.1-41.ZhangQQ,YingGG,PanCG,LiuYS,ZhaoJL.ComprehensiveevaluationofantibioticsemissionandfateintheriverbasinsofChina:sourceanalysis,multimediamodeling,andlinkagetobacterialresistance[J].Environmentalscience&technology,2015,49(11):6772-6782.LazzaroBP,ZasloffM,RolffJ.Antimicrobialpeptides:applicationinformedbyevolution.Science,2020,368(6490):5480.WangG.Improvedmethodsforclassification,prediction,anddesignofantimicrobialpeptides.MethodsMolBiol,2015,1268:43-66.LiShuqin,WangYajie,XueZihan,JiaYanan,LiRuilin,HeChengwei,ChenHaixia．Thestructure-mechanismrelationshipandmodeofactionsofantimicrobialpeptides:Areview[J]．TrendsinFoodScience&Technology,2021,109(1):103-115.陈雯,叶书培,李秋燕等.两栖类动物抗菌肽对病原微生物作用研究进展[J].广东农业科学,2012,39(16):175-178.LeeHT,LeeCC,YangJR,etal.Alarge-scalestructuralclassificationofantimicrobialpeptides.BiomedResInt,2015:475062.Franz,A.,W.WoodandP.Martin.FatBodyCellsAreMotileandActivelyMigratetoWoundstoDriveRepairandPreventInfection.DevCell,2018,44(4):460-470.OMARDIENS,BRULS,ZAATSAJ.Antimicrobialactivityofcationicantimicrobialpeptidesagainstgram-positives:Currentprogressmadeinunderstandingthemodeofactionandtheresponseofbacteria[J].FrontiersinCellandDevelopmentalBiology,2016,4:111.BRAFFMANNR,PISCOTTAFJ,HAUVERJ,etal.StructuralmechanismoftranscriptioninhibitionbylassopeptidesmicrocinJ25andcapistruin[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2019,116(4):1273-1278.陈陈,佘媛媛,熊苏婉等.高地芽胞杆菌CQC1抗菌肽抑制金黄色葡萄球菌的生物活性研究[J].安徽化工,2022,48(03):40-44.赵连静,黄宜兵,高嵩等.螺旋型抗菌肽的疏水性对抗细菌与抗真菌活性的影响比较[J].中国科学:化学,2013,43(08):1041-1050.王小方,李燕,冯红燕等.抗菌肽抗病毒作用机制研究进展[J].新乡医学院学报,2021,38(9):884-885+889.HoskinDW,RamamoorthyA:Studiesonanticanceractivitiesofantimicrobialpeptides[J].BiochimBiophysActa,2008,1778(2):357-375.RosenfeldY,PapoN,ShaiY:Endotoxin(lipopolysaccharide)neutralizationbyinnateimmunityhost-defensepeptides:Peptidepropertiesandplausiblemodesofaction[J].JBiolChe