CN113186271B 用于慢性心力衰竭的诊断和预后的方法 （新加坡科技研究局）

201680034445.92016.05.09本申请涉及用于确定对象是否患有心力衰力衰竭特别地是左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)和左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)，所述方法包括确定从对象获得的样品中观察到的选定miRNA的水平，并且其中与对照相比miRNA的水平改变指示对象患有心力衰竭或从对象获得的样品中选定miRNA的改变来确定死21.用于测量从对象获得的血浆样品中至少三种miRNA的水平的试剂在制备用于确定所述对象是否患有心力衰竭的方法的诊断剂中的用途，所述至少三种miRNA包括hsa-miR-a)测量从所述对象获得的血浆样品中至少hsa-miR-454-3p、hsa-miR-24-3p和hsa-其中miR-24-3p的水平提高以及hsa-miR-454-3p和hsa-miR-551b-3p的水平降低指示2.用于测量从对象获得的血浆样品中至少三种miRNA的水平的试剂在制备用于确定所述对象是否患有心力衰竭的方法的诊断剂中的用途，所述至少三种miRNA包括hsa-miR-(a)测量从所述对象获得的血浆样品中至少hsa-miR-454-3p、hsa-miR-24-3p和hsa-(b)使用基于步骤(a)中所测量的所述miRNA的水平的评分来预测所述对象患有心力衰式1-其中log2拷贝_miRNAi是单独miRNA的log转换拷贝数，所述拷贝数的单位是拷贝/ml血式2-与样品中BNP和/或NT-proBNP的水平正相关或3.根据权利要求2所述的用途，其中miR-24-3p的水平提高以及miR-551b-3p的水平降低指示所述对象患有心力4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中步骤(a)血浆样品中的表16或表23中列出的至少一种另外的miRNA的水平，其中表16或表23中列出34;56[0001]本申请是申请日为2016年5月9日的PCT国际专利申请PCT/SG2016/050217进入中[0003]本申请要求于2015年5月8日提交的新加坡专利申请No.10201503644Q的优先权权ventricularejectionfraction，LVEF)已被广泛用于限定收缩功能、评估预后和选择患者进行治疗干预。然而，认识到心力衰竭可以在正常或接近正常EF的存在下发生：所谓的“射血分数保留性心力衰竭(heartfailurewithpreservedejectionfraction，的心力衰竭：所谓的“射血分数降低性心力衰竭(heartfailurewithreducedejection有冠状动脉疾病(coronaryarterydisease，CAD)而更可能患有潜在的高血压[7,8,11]。另外，HFPEF患者不从血管紧张素转化酶抑制或血管紧张素受体阻滞获得与HFREF患者相似也可逐渐发展。[0007]及时诊断、心力衰竭亚型-HFREF或HFPEF的分类和改进的风险分层对于心力衰竭7衰竭选自左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)和左心室射血分数保留性心力衰竭平是否指示对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心[0010]在另一方面，提供了一种用于确定心力衰竭患者的死亡风险改变的风险的方miRNA的水平。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：c)确定表14中列出的至少一种miRNA的水平与对照群体中miRNA的水平相比是否不同，其中miRNA的水平改变指示与对照的至少一种miRNA的水平与对照群体中miRNA的水平相比是否不同，其中miRNA的水平改变指示与对照群体相比，对象的疾病发展至住院或死亡的风险可能改变(无事件生存率改测量miRNA的水平的评分来预测对象发生miRNA的水平。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：(c)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象发生或患有心力衰竭[0014]在另一方面，提供了一种确定对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)(c)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象患有左心8心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HF[0015]在另一方面，提供了一种确定对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)包括以下步骤：(c)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF[0018]图2示出了N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)和N端脑钠尿肽激素原的自然对数激素原的自然对数水平用于涉及NT-proBNP的所有[0019]图3示出了N端脑钠尿肽激素原的自然对数(ln_NT-proBNP)作为心力衰竭的生物[0020]图4示出了高通量miRNART-qPCR测量的示例性工作流程。图4所示的步骤包括分至24个碱基的小单链RNA)；多重设计是指有意地通过计算机分为多个多重组(每组45至65种miRNA)以最小化RT和增加过程期间的非特异性扩增和引物-引物相互作用的miRNA测定；(touchdownPCR)以同时增加组中所有cDNA的量；单重qPCR是指将增加的cDNA库分布到用于在所有测量中内插绝对拷贝数的合成miRN9[0021]图5示出了主成分分析的条形图结果。基于log2标度表达水平(拷贝/mL)对所有15个主成分对分离对照(C)和心力衰竭(HF)的分类效率(AUC)。(C)：前15个主成分对分离HFREF(射血分数降低性心力衰竭)和HFPEF(射血分数保留性心力衰竭)的分类效率(AUC)。[0023]图7示出了显示可用于检测心力衰竭的生物标志物的重叠的维恩图(Venn糖尿病的多变量分析(逻辑回归)进行对照(健康)与不同组心力衰竭患者(HF、HFREF和变量分析(A)和多变量分析(B)中p值(经错误发现率校正后)低于0.01的miRNA的数量和重证明两种亚型之间在miRNA表达方面的真正差[0024]图8示出了健康对照与心力衰竭患者之间靠前的上调和下调miRNA的箱线图和接[0025]图9示出了显示用于检测心力衰竭和分类心力衰竭亚型的生物标志物的重叠的维变量分析(A)和多变量分析(B)中p值(经错误发现率校正后)低于0.01的miRNA与用于检测[0026]图10示出了与HFREF患者相比，HFPEF患者名靠前的上调和下调miRNA的箱线图和[0027]图11示出了用于检测心力衰竭和用于分类心力衰竭亚型的重叠miRNA的线图。基NT-proBNP互补以提供更好的HFPEF辨别。[0028]图12示出了所有可靠检测到的miRNA之间的相关分析的散点图。基于log2标度表达水平(拷贝/mL)，在所有137种可靠检测到的miRNA靶标之间计算Pearson线性相关系数为HFREF和HFPEF亚型的327个对象的不同抗HF药物治疗的病例数。应用卡方检验以比较每[0031]图15示出了无事件生存的生存分析。特别地，(A)示出了基于单变量分析(p值<[0032]图16示出了用于观察生存(OS)和无事件生存(EFS)的生物标志物之间的比较的维模型通过单变量分析或多变量分析鉴定miRNA。图16显示死亡和复发性代偿失调性心力衰[0033]图17示出了用于观察生存(OS)和无事件生存(EFS)的生物标志物之间的比较的维了通过CoxPH模型用于预后鉴定(对于OS或对于EPS)和用于分类两种HF亚型的显著miRNA之[0034]图18示出了用于观察生存(OS)的具有最大和最小危险比(hazardratio)的miRNA(hsa-miR-150-5p)的miRNA构建单变量CoxPH模型或包括六个另外临床变量的多变色)。进行对数秩检验以在两组之间进行测试，示出了p值(B)，处理后750天的观察生存EFS的具有最大危险比(hsa-miR-331-5p)和最小危险比(hsa-miR-191-5p)的miRNA构建单变量CoxPH模型或包括2个另外临床变量的多变量CoxPH模型：用于EFS的糖尿病状态和ln_NT-proBNP。所有正常变量水平(包括糖尿病状态ln_NT-proBNP和miRNA表达水平(log2标度))被按比例调整为具有一个标准偏差。基于根据CoxPH模型的解释得评分值，比较了前[0036]图20示出了生成用于心力衰竭检测的多变量生物标志物组的代表性结果。在(A)生物标志物组(miRNA数＝3至10)的诊断力(AUC)。箱线图示出了在健康和心力衰竭患者的AUC提高的显著性，进行了右尾t检验以比较所有相邻的灰色条。*：p值<0.05[0037]图21示出了使用二维图的在HF检测方面的多变量miRNA评分与NT-proBNP之间的比较。(A)示出了所有对象的NT-proBNP水平(y轴)和6-miRNA组评分(x轴)之一的二维图。NT-proBNP(125)的阈值用虚线表示。根据NT-proBNP的错误阳性和错误阴性对象被加框。(B)示出了使用125pg/ml阈值根据NT-proBNP分类的错误阳性和错误阴性对象的NT-p字表示；HFREF对象用填充圆圈表示，HFPEF对象用空三角形表示。图21验证了以下假设：miRNA生物标志物与N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)携带不同信息[0038]图22示出了将miRNA与NT-proBNP组合的用于心力衰竭检测的多变量生物标志物组的分析。(A)示出了在计算机两折交叉验证期间在HF检测的发现和验证阶段中多变量生和验证组(灰色)以及ln-NT-proBNP本身(第一列)的结果的定量表示。误差条表示AUC的标miRNA与N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)组合时分类效率显著提[0039]图23示出了在增加或不增加N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)下多变量选用于多变量HF检测组的miRNA的重叠的维恩图。在多变量生物标志物检索过程期间选用于使用miRNA单独(表16)或使用miRNA与NT-proBNP(表17)进行HF检测的生物标志物之间的比较。[0040]图24示出了生成用于在增加和不增加NT-proBNP下进行心力衰竭亚型分层的多miRNA组的代表性结果。(A)示出了用于心力衰竭亚型分类的多变量miRNA生物标志物组检心力衰竭亚型分类的多变量miRNA和NT-proBNP生物标志物组检索(ln_NT-proBNP加2至8种miRNA)。示出了发现组(黑色条)和验证组(灰色条)以及ln_NT-proBNP本身(第一列)的AUC结果。误差条表示AUC的标准偏差。进行右尾t检验以比较所有相邻的灰色条。*：p值<[0043]表1是用于心力衰竭的已报道血清/血浆miRNA生物标志物的总结。测量无细胞血[0045]表3是列出了健康对象和心力衰竭患者的特征的表格。射血分数(左心室射血分与心力衰竭(C与HF)和HFPEF与HFREF(HFREF与HFPEF)之间变量的比较，t检验用于正常变[0046]表4是列出137种可靠检测到的成熟miRNA的序列的表格。在血浆样品中可靠检测分析(p值，逻辑回归)进行对照(健康的)与所有心力衰竭对象(HFREF和HFPEF二者)之间的miRNA表达水平。[0048]表6是列出了在对照和HFREF对象之间差异表达的miRNA的表格。通过单变量分析[0049]表7是列出了在对照和HFPEF对象之间差异表达的miRNA的表格。通过单变量分析比较。通过针对年龄、AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的逻辑回归测试表达水平。[0050]表8是列出了当前研究与先前公开的报道之间的比较的表格。表4中未列出的的多变量分析(p值，逻辑回归)进行HFREF(左心室射血分数降低性心力衰竭)与HFPEF对象房颤动或心房扑动)和高血压调整的逻辑回归测试miRNA对ln_NT-proBNP区别HFREF与miRNA表达水平除以HFREF对象的miRNA表达水平。[0052]表10是列出了预后研究中包括的对象的临床信息的表格。包括在预后研究中的[0053]表11是列出了预后研究中包括的对象的处理的表格。预后研究中包括327个对象[0054]表12是列出了观察生存的临床变量的分析的表格。使用Cox比例风险模型分析观[0057]表15是列出了显著预测无事件生存的miRNA的表格。用单变量和多变量分析使用[0058]表16是列出了在用于心力衰竭检测的多变量组检索过程中鉴定的miRNA的表格。列出了选用于组装用于心力衰竭检测的具有6、7、8、9和10种miRNA的生物标志物组的的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚群的不准确数据而计数[0059]表17是列出了在用于心力衰竭(HF)检测的多变量组检索过程中结合NT-proBNP鉴定义。排除具有前10％和后10％AUC的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚群的不准确数据而计数错误发现生物标志物。仅列出了超过2％组中使用的选定miRNA和ln_NT-proBNP作为预测变量的逻辑回归确定，其中经FDR校正后显著性miRNA[0060]表18是列出了在用于HF亚型分类的多变量组检索过程中鉴定的miRNA的表格。列AUC的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚群的不准确数据而计数错误发现生物标志物。仅列出了超过2％组中使用的miRNA。HFREF和HFPEF亚型之间的[0061]表19是列出了在用于HF亚型分类的多变量组检索过程中结合NT-proBNP鉴定的miRNA的表格。列出了选用于组装用于HF亚型分类的具有ln_NT-proBNP以及5、6、7和8种具有前10％和后10％AUC的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚NT-proBNP的补充的miRNA的显著性基于使用选定miRNA和ln_NT-proBNP作为预测变量的逻辑回归)进行对照(健康的)与所有心力衰竭对象(HFREF和HFPEF二者)之间的比较。用针对年龄和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压、糖尿病调整的逻辑回归测试miRNA对ln_NT-平。表20对应于表5，区别之处在于表20中列出的miRNA不是本领域已知的miRNA的一部分年龄和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的逻辑回归测试miRNA对ln_NT-年龄、AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的逻辑回归测试miRNA对ln_NT-[0065]表23是列出了在多变量组检索过程中频繁选择的用于心力衰竭检测的miRNA的表的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚群的不准确数据而计数[0066]表24是列出了在多变量组检索过程中频繁选择的结合NT-proBNP用于HF检测的具有前10％和后10％AUC的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚NT-proBNP的补充的miRNA在辨别不同HF亚型方面的显著性基于使用选定miRNA和ln_NT-[0070]及时诊断、对心力衰竭亚型(包括但不限于左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)、左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)等)的准确分类和改善的风险分层对于心力衰竭的管理和治疗具有重要意义。一种有吸引力的方法是使用循环生物标志物[14]。胞伸展，其(依赖于室直径以及心室内压和壁厚)与具有典型扩张心室和偏心重塑的HFREF或替代B型肽在心力衰竭的早期或部分治疗状态筛选心力衰竭以及监测心力衰竭的慢性期的状态的生物标志物具有尚未满足的需求。这对于B肽水平低于HFREF且通常正常的HFPEF60％的所有人基因[28]，其中很多miRNA被鉴定为关键细胞功能(例如增殖[29]和凋亡[30])中的关键参与者。人血清和血浆中miRNA的发现已提高使用循环miRNA作为很多疾病近，已经进行了多种尝试来鉴定血清或血浆中的循环无细胞miRNA生物标志物以区别HF患用定量实时聚合酶链反应(qPCR)筛选已报道的候选miRNA。评价基于阵列与qPCR平台的不同技术显示这些平台用于miRNA测量的性能存在实质性差异。这可能导致观察到的研究之间的不一致性[49]。迄今为止，关于可用作心力衰竭生物标志物的特定循环血清/血浆variablesusinganinterpretationfunctiontoyieldasingle,patient-specifinthediagnosisofdiseaseorotherconditions,orinthecure,mitigation,treatmentorpreventionofdisease,andprovidesaresultwhosederivationisnon-transparentandcannotbeindependentlyderivedorverifiedbytheend他技术的结果(例如测序和微阵列数据)的金标准。这种方法的一种变化形式是数字PCR[0079]在该研究中，通过qPCR在338位慢性心力衰竭患者(180个HFREF和158个HFPEF)和的迄今为止比在文献中报道的任何组群都要大的组群。图1中描述了本研究中使用的不同[0080]本公开内容的发明人已建立了具有多层技术和样品控制的精心设计的工作流基因。miRNA可以是共价连接在一起的至少10个核苷酸且不多于35个核苷酸。在一些实例列与待与参考序列进行比较的给定序列)之间的关系。序列同一性通过在将序列最佳对齐竭的严重程度可以为不严重(轻度)(其表现在对象的身体活动不具有限制)到严重程度递其已具有心力衰竭的初步诊断和/或经治疗3至5天在症状上已改善，具有心力衰竭床旁体代表样品中miRNA表达水平(或miRNA表达谱)的确定或与样品中miRNA表达水平相关的测术(例如LUMINEX)等，其允许分析miRNA表达水平并在对象(例如潜在患病的)和对照对象水平提高可指示对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或可处于发生左心室射竭(HFREF)或可处于发生左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)风险之中。在一些实例水平提高可指示对象患有左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)或可处于发生左心室射竭(HFPEF)或可处于发生左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)风险之中。在一些实例确定其与对照相比是否不同，其中所述miRNA的水平改变可指示对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)或者可能处于其发生平提高可指示对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性miRNA的水平降低可指示对象发生左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血[0114]在用于确定对象是否患有选自左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)和左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的心力衰竭的方法的一些实例中，所述方法可以包括测[0115]在用于确定对象是否患有选自左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)和左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的心力衰竭的方法的一些实例中，对照可以是患有左心的miRNA的差异表达指示对象患有左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)。在一些实例公开内容的方法可用于预测未来死亡或住院事件的可能风险或者通过诊断疾病确定的进展前景。心力衰竭患者中的预后意指预测观察生存(无死亡生存)或无事件生存(无住院或有死亡原因的观察生存率)或慢性心力衰竭患者中复发心力衰竭入院(即心力衰竭治疗后的时间长度，在此期间避免了由于代偿失调性心力衰竭的复发入院)和所有原因死亡的无miRNA的水平；以及b)确定表14中列出的至少一种miRNA的水平与对照群体的所述miRNA的险比可以通过Cox比例危险(CoxPH)模型来计算。象获得的样品中表15中列出的至少一种miRNA的水平和/或测量表15中列出的至少一种miRNA的水平，以及b)确定表15中列出的至少一种miRNA的水平与对照群体的所述miRNA的miRNA的水平提高可指示对象疾病发展到住院或死亡的风险增加(无事件生存率降低)。在miRNA的水平提高可指示对象疾病发展至住院或死亡的风险增加(无事件生存率提高)。在体包括其死亡或疾病发展风险需要用微RNA表达水平来力衰竭的初步诊断和/或在症状改善(心力衰竭的床旁身体症状消退)并且认为适合出院时miRNA是hsa-miR-10b-5p。可以例如通过使用本领域已知的计算模型(作为一个实例，其可以包括但不限于SMV)数学确定的和出于统计学分类目的而使用本领域已知众多数学等式和/或算法中的任一种计算[0141]在一些实例中，本文公开的方法测量(对象的血浆样品中)至少一种(或多种)miRNA的水平。可以将至少一种miRNA的测量组合以生成用于预测心力衰竭或分类HFREF和[0144]其中log2拷贝_miRNAi是单独miRNA的log转换拷贝数(拷贝/ml血浆)；Ki是用于对[0145]式1在此示出了线性模型用于预测心力衰竭或分类HFREF和HFPEF亚型的应用。预测评分(对于每个对象是特有的)是作出预测性[0146]在本公开内容的实验部分中，对所鉴定的miRNA的诊断用途进行进一步的统计学物标志物组(HF组、HFREF和HFPEF组)。本公开内容的发明人发现生物标志物组中的一些miRNA在接受者操作特征(ROC)图中一致地产生用于HF检测的≥0.92的AUC值(曲线下面积)[0152]在一些实例中，本文所述的方法还可包括确定脑钠尿肽(BNP)和/或N端脑钠尿肽可一作为替代地使用式2。在式2中，将血浆样品中BNP/NT-proBNP的水平包括在线性模型[0157]其中log2拷贝_miRNAi是单独miRNA的log转换拷贝数(拷贝/ml血浆)；Ki是用于对[0164]在另一方面，提供了一种确定对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的可[0170]在另一方面，提供了一种确定对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)对象获得的样品中miRNA的存在，和/或测量该样品中表19或表24中列出的至少两种RNA的水平；以及(b)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPE[0177]如实验部分和附图如图22和24中所举例说明的，当本公开内容的方法与确定NT-方法还可包括确定脑钠尿肽(BNP)和/或N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP中的miRNA水平和/或NT-proBNP该方法可以与检测和测量其样品中NTproBNP的水平的附加步骤一[0197]在另一方面，提供了一种确定对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)[0198]在一些实例中，为了分类HFREF和HFPEF亚型，预测评分(其对于每个对象是独有[0202]在另一方面，提供了一种在本文所述的任何方法中使用(或适于使用，或当使用[0204]在一些实例中，所述试剂盒还可包含用于确定脑钠尿肽(BNP)和/或N端脑钠尿肽[0205]在一些实例中，本文所述的方法还可包括用至少一种用于治疗心力衰竭(或心力衰竭亚型)的治疗剂治疗被预测(或被诊断为)患有心力衰竭或心力衰竭亚型的对象的步[0206]本文中说明性描述的本发明可适当地在缺少本文中没有具体公开任意一个或更使用这样的术语和表述中没有意图排除所示出和描述的特征或者其部分的任何等同特征，管移除的材料在本文中是否具体说明的附带条认的TRI试剂(sigma-Aldrich8)按照制造商的方案分离来自200μl各血浆样品的总RNA。多重逆转录反应中转化为cDNA以检测抑制剂的存在并监测RT-qPCR效率。使用ImpromII步骤，并使用基于SybrGreen的单重qPCR测定(符合MIQE)(MiRXESTM)进行量化。使用AppliedBiosystems8ViiA7384实时PCR系统或Bio-radgCFX384Touch实时PCR检测系[0216]进行精心设计的临床研究(病例-对照研究)以确保生物标志物对慢性心力衰竭(HF)的准确鉴定。在该研究中使用总共338位来自新加坡群组的慢性心力衰竭患者(180例行比较。心力衰竭患者从新加坡心力衰竭结局与表型(SingaporeHeartFailure通过正在进行的流行病学新加坡纵向老化研究(SingaporeLongitudinalAgeingStudy，SLAS)招募了没有明显冠状动脉疾病或心力衰竭病史的对照[56]。所有患者和对照都经历国超声心动描记术学会(AmericanSocietyofEchocardiography，ASE)指南推荐的圆盘[0232]根据制造商的说明(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,德国)在自动化Cobase411分析仪上通过电化学发光免疫测定(ElecsysproBNPII测定)在所有样品中测量血浆NT-proBNP。对照、HFREF和HFPEF组中分布的初步检查(图2，A至C)显示，所有组中的NT-proBNP水平都正偏斜(偏斜度/偏斜>2)。由于待应用的统计学方法需要不偏斜的分布[0237]除包括年龄、种族和性别的人口统计学变量之外，还记录了包括LVEF、ln_NT-验进行数值变量的比较，使用卡方检验进行比较对照与HF(C相对于HF，表3)和HFPEF与于HF检测或用于HF亚型分类的miRNA生物标志物的考能。在该研究中，总体上，ln_NT-proBNP对于HF诊断具有0.962AUC(ROC曲线下面积)的miRNA水平变化可能被由于其他刺激而可能从其他来源分泌的相同miRNA的存在而被部测量多个miRNA靶标是至关重要的并且非常具有挑战性。为了最有利于发现显著改变的[0241]所有qPCR测定(由MiRXESTM,新加坡设计)对于miRNA靶标以单重复和对于合成RNA[0242]基于高表达血浆miRNA的先验知识(数据未示出)选择了两百零三(203)个miRNA靶浆样品(HF和对照)中那些miRNA的表达10拷贝/孔)的水平下将量化在血清中以≤500拷贝/ml的水平表达的miRNA。在这样的浓度研究的发明人检测到远远更多先前在心力衰竭中未报道的miRNA，突出了使用谨慎且控制[0251]首先，检测所有测量的miRNA以获得仅在心力衰竭样品中可检测到但在对照样品中未检测到的靶标。心力衰竭患者中由心肌特异性分泌的miRNA是检测该疾病的理想生物标志物。由于血液循环系统中的miRNA已知由不同器官和/或细胞类型(包括心肌)所贡献，因此这些miRNA可能在正常和心力衰竭患者中的血浆已代表并不令人惊讶。然而，这些miRNA在血浆中的差异表达仍然可用作心力衰竭发展期间的有用生物标种心力衰竭亚型：HFREF或HFPEF中任一种(图5，C)的AUC显著高于0.5(包括第一PC(AUC=[0253]将两组对象(C和心力衰竭(HF))在由用于HF检测的两个主要判别性PC限定的空间[0254]鉴定生物标志物的关键步骤是直接比较在正常和疾病状态以及在疾病亚型之间每种miRNA的表达水平。使用Studentt检验进行单变量比较以评估单独miRNA的组间差异[0257]将来自在临床上确诊患有任一种心力衰竭亚型(HFREF或HFPEF)的患者的血浆分[0258]最初使用单变量分析(Studentt检验)进行比较，其中与对照相比，发现94种力衰竭的检测，在多变量分析中发现94种miRNA中的有75种(表5)是显著的(FDR后p值<差异表达miRNA的数量(单变量分析中101种以及单变量分析和多变量分析二者中86种)明物或用作生物标志物组的组分(多变量指标测定)用于心力[0275]文献中总共已报道了47种不同的miRNA(表1)。Hsa-miR-210在心力衰竭患者中的析中的FDR后p值<0.01)与24种报道的miRNA进行比较，在本研究中，仅这些先前报道的[0276]NT-proBNP/BNP是迄今研究最充分的心力衰竭生物标志物并且表现出最佳的临床(p值，ln_BNP，表7)具有与ln_NT-proBNP互补用于HFPEF检测而不用于HFREF的信息(p值，种与ln_NT-proBNP一起组合可以潜在地提高HFPE[0279]单变量分析(Studentt检验)表明，HFREF与HFPEF对象之间40种miRNA显著改变[0281]所有心力衰竭中最上调miRNA(hsa-miR-223-5p，图10，A)和最下调miRNA(hsa-是首次报道使用来自血液(血浆/血清)的循环无细胞miRNA将心力衰竭患者分为两个临床[0282]在HFREF与HFPEF之间差异表达的大多数miRNA(在单变量分析中，中比在HFPEF中具有更独特的水平(C<HFPEF<HFREF或C＝HFPEF>HFREF或C＝HFPEF<HFREF，将一种或更多种特定miRNA替换成另外miRNA来组装miRNA组以系统地优化诊断性能。所有显著改变的miRNA对于开发用于心力衰竭检测或心力衰竭亚型分类的多变量指标诊断测定[0296]在所有研究病例中，115位在随访期间由于心力衰竭而再次住院(表10)，49位死亡。将miRNA作为代偿失调性心力衰竭的观察(全因存活率)OS和无事件生存(EFS)二者(全HFREF预后的药物种类(ACEI/ARB、β阻滞剂和盐皮质激素类拮抗剂)相对于HFPEF患者更常[0308]使用Cox比例危险(CoxPH)建模进行生存分析，并且在相同模型中单独(单变量分量的存在或不存在以及正态分布连续变量的中值上或中值下水平将患者分类为高风险和07，HR＝2.36(95％CI：1.69-3.30))。基于ln_NT-proBNP的水平，低风险组的OS750为miRNA各自组合在CoxPH模型中用于鉴定用于总体生存的预后性miRNA标析，只有两个变量：糖尿病和ln_NT-proBNP被发现是显著的。随后，将这些变量与137种miRNA各自组合用于鉴定无事件生存的预后性miRNA标14)。在单变量分析中发现显著的11种miRNA不能够提高临床参数的预测性能(多变量分[0317]在单变量(HR＝1.90(95％CI：1:36-2.65，p值＝0.00014))和多变量分析(HR=在CoxPH模型中包括2个另外临床变量的多变量分析中发现miRNA对EFS预测均不具有显著或hsa-miR-30e-3p)，高风险组的EFS750为约40低风险组的EFS750为约60而在增加2作慢性HF患者的代偿失调性HF的复发入院风险的[0319]与总体生存(n＝43)相比，较少的miRNA被鉴定为对无事件生存具有预测性(n=物在另外两个列表中仍然没有发现，表明应使用或组合独立的miRNA组以形成用于预后的[0323]组装这样的多变量组的一个重要标准是包括来自每种心力衰竭亚型的特定列表具有最高AUC的miRNA组。还使用现有技术线性支持向量机(用于构建变量组的得到充分利中所有检出miRNA的定量数据不仅提高结果的准确性和精确度，而且还确保所鉴定生物标交叉验证(twofoldcrossvalidation))以在独立的验证样品组(每折的剩余一半样品)中基于发现组(每折的一半样品)测试所鉴定生物标志物组的性能。在大量临床样品(546不一定是相同的。例如，最上调的(hsa-let-7d-3p)miRNA表(表16)的至少6种miRNA的生物标志物组来检[0332]为了比较miRNA生物标志物与NT-proBNP，选择一个六种miRNA生物标志物的组的来计算所有对象的组合miRNA评分，将其针对来自相同对象的NT-proBNP水平作图(图21，[0333]进行相同的生物标志物鉴定过程(多次两折交叉验证)，其中将NT-proBNP预先固定为预测变量之一并将ln_NT-proBNP水平与miRNA表达水平(log2标度)用于使用支持向量的组除NT-proBNP之外还包括发现不显[0336]虽然超过一半的显著miRNA(表17，显著列表)在搜索仅有miRNA的生物标志物组(表16，显著列表)时也被频繁选择(图23，A)，但是流行度的排名是不同的。当搜索基于于有两种miRNA在超过80％的组中存在(hsa-miR-30a-5p(94.6％)和hsa-miR-181a-2-3p[0340]与仅有miRNA的组相比，由miRNA和NT-proBNP二者组成的生物标志物组需要更少不同的miRNA在超过80％的组中被发现：hsa-miR-199b-5p(91.5％)和hsa-miR-191-5p的(hsa-miR-199b-5p)，但是在剩余的显著与不显著列表之间在成份(identity)和排名方stratuminWHOregions,estimatesfor2002.Theworldhealthreport2004-changinghistory,2004.[0343]2.Alla,F.,F.Zannad,andG.Filippatos,Epidemiologyofacuteheartfailuresyndromes.HeartFailRev,2007.12(2):p.91-5.[0344]3.Stewart,S.,etal.,More'malignant'thancancer？Five-yearsurvivalfollowingafirstadmissionforheartfailure.EurJHeartFail,2001.3(3):p.315-22.cautionarynoteforcancerbiomarkerstudies.CancerPrevRes(Phila),2012.5andanalyticalchallenges.ClinChem,2011.57(6):p.833-40.[0347]6.Nishimura,J.andY.Kanakura,[Paroxysmalnocturnalhemoglobinuria(PNH)].NihonRinsho,withpreservedejectionfraction.NEnglJMed,2006.355(3):p.251-9.[0349]8.Bhatia,R.S.,etal.,Outcomeofractioninapopulation-basedstudy.NEnglJMed,2006.355(3):p.260-9.[0350]9.Yancy,C.W.,etal.,Clinicalpresentaoutcomesofpatientsadmittedwithacutedecompensatedheartfailurewithpreservedsystolicfunction:areportfromtheAcuteDecompensatedHeartFailureNationalRegistry(ADHERE)Database.JAmCollCardiol,2006.47(1):p.76-84.aredistinctphenotypeswithintheheartfailurespectrum.Circulation,[0352]11.Hogg,K.,K.Swedberg,andJ.McMurray,Heartfailurewithpreservedleftventricularsystolicfunction；epidemiology,clinicalcharacteristics,andprognosis.JAmCollCardiol,2004.43(3):p.317-27.[0353]12.Yusuf,S.,etal.,Effectsofcandesartaninpatientswithchronicheartfailureandpreservedleft-ventricularejectionfraction:theCHARM-PreservedTrial.Lancet,2003.362(9386):p.777-81.preservedejectionfraction.NEnglJMed,2008.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