3.2基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序本节聚焦:1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？基因表达载体转基因抗虫棉非转基因抗虫棉【从社会中来】1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。将该细菌的Bt抗虫蛋白基因（“杀虫基因”，简称Bt基因）转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。苏云金杆菌与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取导入抗虫基因（Bt抗虫蛋白基因）重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定实例：具体的步骤是？(含抗虫基因）（含有并表达抗虫基因）学习目标与任务1.什么是目的基因？2.目的基因的筛选方法是什么？3.获取目的基因的方法有哪些?

4、简述PCR技术的原理？5、回忆DNA复制的条件和过程？6、PCR技术的三个具体过程？阅读课本P76-77、完成《金》填

空一目的基因的筛选和获取1.目的基因

在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，就是目的基因。根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因也可以是具有调控作用的因子。一目的基因的筛选和获取2.目的基因筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选随着测序技术的发展，以及序列数据库、序列比对工具等的应用，越来越多的基因的

为人们所知。结构和功能DNA测序仪核苷酸序列比对氨基酸序列比对课本P96基于网络数据分析基因和蛋白质的序列信息一目的基因的筛选和获取3.目的基因的获取✭获取目的基因的方法：①从基因文库中获取②人工合成③利用PCR获取和扩增目的基因（常用）前提：方法：DNA合成仪基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成基因文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。1一.目的基因的筛选与获取---利用PCR获取和扩增目的基因PCR——聚合酶链式反应PCR是一项根据

的原理，在

提供参与DNA复制的

与

，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。DNA半保留复制体外各种组分反应条件聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因全称原理操作环境目的优点PCR技术一目的基因的筛选和获取PCR扩增仪控制温度解旋酶DNA聚合酶▲子链的延伸方向：模板：原料：能量：酶：DNA的两条母链4种游离的脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶复制特点:①边解旋边复制②半保留复制碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）要点回顾:体内DNA复制条件5'端→3'端复制原则:

因为DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。DNA复制所需的基本条件:参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（PCR用耐高温的DNA聚合酶）（PCR用高温代替）（PCR的引物2种）引物是一小段能与

的一段碱基序列__________的____________DNA母链互补配对短单链核酸3’5’DNA母链3’5’引物3’5’引物3’5’DNA母链（通常20-30个核苷酸）PCR技术耐高温的DNA聚合酶DNA模板引物缓冲溶液四种脱氧核苷酸PCR扩增仪（PCR仪）条件:微量离心管——控制温度（dNTP）（2种）一般添加Mg2+（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）PCR的条件：目的基因DNA（模板）、四种游离的脱氧核苷酸、耐高温DNA聚合酶、引物、一定的缓冲溶液(维持反应体系的pH）、Mg2+（激活DNA聚合酶的活性）、控制温度变化PCR技术基本过程3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链B.复性（退火）当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合C.延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’变性复性延伸

PCR技术第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第三轮循环的产物完成后，常采用

来鉴定PCR的产物。琼脂糖凝胶电泳PCR技术扩增结果：以指数形式扩增，即____（n为扩增循环的次数）2n（1）若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为

个。（2）若开始有N个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为

个。2nN∙2n变性90℃以上延伸72℃左右复性50℃左右基本过程DNA复制PCR技术场所遵循原则条件解旋方式酶特点结果PCR技术vsDNA复制碱基互补配对原则碱基互补配对原则模板、4种脱氧核苷酸、酶、能量、引物模板、4种脱氧核苷酸、酶、能量、引物(2种）DNA在高温下热变性解旋解旋酶催化半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制细胞内（主要在细胞核内）大量的DNA片段形成整个DNA分子耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶等DNA连接酶①全称：②操作环境：③原理：④前提：⑤条件：⑥过程：⑦优点：聚合酶链式反应体外（PCR扩增仪/PCR仪）可以在短时间内大量扩增目的基因（以指数形式扩增）DNA半保留复制已知目的基因的一段核苷酸序列（为了合成引物）模板DNA、4种游离脱氧核苷酸、引物（1对）、耐高温的DNA聚合酶变性：复性：延伸：DNA解链（超过90℃）引物结合到互补DNA链（50℃左右）Taq酶从引物起始进行互补链的合成（72℃左右）模板、原料、引物、酶、能量（dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP）（本质？如何合成？）引物是一小段核酸，能与DNA母链的碱基序列互补配对。通常20-30个核苷酸，人工合成小结：PCR技术热稳定的DNA聚合酶【例1】利用PCR将某小段DNA分子扩增n代,需 ()A.测定DNA分子两端的核苷酸序列,以便设计引物对B.2n对引物参与子代DNA分子的合成C.向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶等D.保持反应体系温度恒定,确保扩增的正常进行解析:用于PCR的引物是根据扩增的DNA片段两端的核苷酸序列设计的,A项正确;依题意,将某小段DNA分子扩增n代,形成2n个DNA分子,其中除了两条最初的模板不含引物,其他的链均含有引物,因此需要(2n-1)对引物,B项错误;利用PCR在体外进行DNA扩增时,高温使氢键断裂,不需要解旋酶,需要耐高温的DNA聚合酶,C项错误;通过改变温度,从而使DNA变性、复性和延伸循环进行,D项错误。答案:A练一练：《金》P127探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；（2）DNA片段电泳鉴定的原理①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳；②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定；③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关（迁移速率与之呈负相关）④凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定3.方法步骤PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL总体积50μL注：模板DNA的用量为1gp～1μg①加液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分（1）DNA片段的扩增探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定3.方法步骤②离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）③反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定3.方法步骤（2）DNA片段的电泳鉴定①配制琼脂糖溶液

根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀②制备凝胶A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定③加样

将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物④电泳

接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳⑤观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相3.方法步骤探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定注意:①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。

②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。

⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定4.结果分析与评价(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。

可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。

如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定学习目标与任务1.阐述基因表达载体构建的意义；2.说出基因表达载体的结构组成以及各元件的作用；3.辨析启动子和起始密码子、终止子和终止密码子；4.阐述基因表达载体的构建过程。阅读课本P80、完成《金》P90填

空基因表达载体的构建二——核心步骤作为基因表达载体，除了目的基因外，还需要哪些元件呢？启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。终止子：终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。初步筛选出接受了目的基因的受体细胞。常用的标记基因有抗性基因（如抗生素抗性基因）等。试一试：请你画出基因表达载体的结构模式图，标注各组成部分的名称。基因表达载体的构建辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”启动子与终止子位于DNA分子中，作用：起始和终止转录过程。启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中，作用：起始和终止翻译过程。基因表达载体的构建结合图示，概述基因表达载体构建的流程：1.用限制酶切割载体，使它出现一个缺口；2.用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因；3.用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子。目的基因重组DNA分子目的基因思考：目的基因和质粒混合后，可能的连接方式有哪些？[活动]结合下图回答问题，总结出保证目的基因和质粒发生定向连接的解决方法。1.构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能。因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。2.只用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？如果能有何弊端？能。①质粒、目的基因会发生自身环化连接②会发生两两自身连接③质粒与目的基因会发生反向连接[活动]结合下图回答问题，总结出保证目的基因和质粒发生定向连接的解决方法。3.与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接②还可以防止目的基因与载体的反向连接双酶切【小结】限制酶的选择原则①不破坏目的基因②保留标记基因、启动子、终止子、复制原点③确保出现相同黏性末端④保证目的基因和质粒发生定向连接11.下图为某种质粒载体的简图,小箭头所指部位分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的切割位点,AmpR为氨苄青霉素抗性基因,TetR为四环素抗性基因,P为启动子,T为终止子,ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的切割位点。请分析回答下列问题。

(1)将含有目的基因的DNA片段与质粒分别用EcoRⅠ切割,产物用DNA连接酶进行连接后,其中由两个DNA片段连接形成的产物有

、

、

三种。(2)如果目的基因碱基序列已知,且数目较少,可以通过

直接

。(3)在上述实验中,为了防止目的基因和质粒用限制酶切割后产生的末端发生任意连接,应选用的限制酶是

。

练一练：《金》P134确保目的基因在受体细胞中能稳定存在和表达，并能遗传给下一代。基因表达载体构建的目的：1课堂小结2启动子上游RNA聚合酶转录终止子下游RNA聚合酶转录标记目的基因基因表达载体的组成：重组DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶基因表达载体构建模式图限制酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？基因表达载体的构建二——核心步骤基因表达载体构建模式图基因表达载体3.过程学习目标与任务1.说出转化的概念；2.简述将目的基因导入不同受体细胞的方法和过程；将目的基因导入受体细胞三阅读课本P81、完成《金》P90填

空将目的基因导入受体细胞三导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法（常用）基因枪法（单子叶植物常用）花粉管通道法2.将目的基因导入受体细胞的方法：

——显微注射法——Ca2+转化法（我国科学家独创）1.转化的概念：

目的基因进入_________内，并且在受体细胞内_____和_____的过程。受体细胞维持稳定表达花粉管通道法（我国独创）②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液(含目的基因）滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。简便经济，但要求花朵较大方法：实例：优缺点：我国“转基因抗虫棉”农杆菌转化法（常用）

能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种

植物也取得了成功。农杆菌细胞内含有

，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的

可转移至被侵染的细胞，并整合到该细胞的

。2.转化原理：1.农杆菌的特点：T-DNATi质粒大型环状DNA农杆菌T-DNA染色体DNA上单子叶Ti质粒构建基因表达载体时，目的基因该插到Ti质粒哪里？T—DNA上Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞目的基因插入植物细胞染色体DNA上表达新性状转入农杆菌农杆菌转化法（常用）3.过程：植物组织培养农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入①两次拼接:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。

第二次拼接(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的

染色体DNA上。②两次导入:第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。

第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。1.显微注射法科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。2.病毒侵染法导入动物细胞——显微注射法将含目的基因的表达载体提纯受精卵显微注射含目的基因的受精卵具有新性状的动物雌性动物输卵管或子宫胚胎移植早期胚胎

细胞

处理大肠杆细胞

Ca2+感受态

与感受态细胞混合细胞吸收DNA分子基因表达载体使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。导入微生物细胞——Ca2+转化法增加细菌细胞膜的通透性因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。四目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质——“抗原—抗体杂交技术”2.个体生物学水平鉴定1.分子