2026年高考生物终极冲刺：专题05 基因工程与细胞工程类（大题专练）（全国适用）（解析版）

PAGE4/20专题05基因工程和细胞工程内容导航【命题解码·定方向】命题趋势+3年高考真题热点角度拆解【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题/变式【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分命题·趋势·定位1.重情境融合：结合农牧业、制药及环境，实验探究，强化实际应用考查。2.重图表信息：以曲线、实验结果表格、PCR扩增图谱，考查信息提取与分析能力。3.重综合关联：与植物组织培养、蛋白质工程、自然选择、DNA的粗提取深度融合，突出知识的系统性。4.重实验探究：侧重实验设计、结果分析，考查科学探究与逻辑推理能力。热点·角度·拆解热点角度01微生物与基因工程的分析2026·浙江·高考真题：微生物的接种方法、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用2025·云南·高考真题：微生物的接种方法、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用热点角度02植物组织培养技术与基因工程的分析2025·陕晋青宁卷·高考真题：基因工程的操作程序综合、植物组织培养技术综合2025·甘肃·高考真题：将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、植物组织培养技术综合热点角度03基因工程与蛋白质工程的分析2025·重庆·高考真题：自然选择与适应的形成、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、蛋白质工程原理及操作流程2025·浙江·高考真题：DNA的粗提取及鉴定、PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测与鉴定、蛋白质工程原理及操作流程热点角度01微生物与基因工程的分析析典例·建模型1.（2026·浙江·高考真题）农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因回答下列问题：(1)表达载体导入农杆菌细胞：用溶液处理农杆菌，制备________，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经________限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。(2)假丝酵母重组菌株的获得：在________中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用________方法接种在固体培养基上培养，适时挑选________再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有________的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。(3)重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是________。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或________，导致甘油合成代谢受阻。【解题建模】第一步，思路模板：定位考点，拆解题干信息本题核心考查微生物的接种方法、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用，题干关键信息：（1）目的基因导入受体细胞的方法。（2）灭菌和消毒的方法。（3）分析图像得出结论。第二步：结合教材知识，逐一突破问题第三步：规范作答，抓关键词得分【答案】(1)感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌EcoRⅠ和HindⅢ(2)超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台（平板）划线法/稀释涂布平板法单菌落腐草霉素(3)提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异得分关键：目的基因导入受体细胞的方法，灭菌和消毒的方法，分析图像得出结论。研考点·通技法核心考点1、导入受体细胞的方法将目的基因导入植物细胞常用的方法：农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞的方法：显微注射技术；将目的基因导入微生物细胞的方法：用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。核心考点2、消毒和灭菌1、消毒和灭菌的方法消毒灭菌概念使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药物消毒法、紫外线消毒法湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌适用对象操作空间、双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等具体操作(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上的酒精灯火焰附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触。核心考点3、微生物的纯培养的方法采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上,之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。核心考点4、分析图像根据横坐标和纵坐标的分析原因。破类题·提能力1.（2025·云南·高考真题）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图甲。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图丙。回答下列问题：(1)要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有___________________________。(2)绘制图乙需统计活菌数，常用方法是___________________________。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是__________________，开始发挥作用的时间是__________________，判断理由是___________________________。(3)基于图丙，利用IR3C三菌混菌发酵的产量_________（填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是___________________________。【答案】目的基因、终止子、复制原点(2)稀释涂布平板法能抑制细菌增殖15h在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升(3)高于IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。【分析】基因工程是指按照人类的愿望，将不同生物的遗传物质在体外人工剪切并和载体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术，基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性，并通过工程化为人类提供有用产品及服务。【详解】（1）要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，基因工程中构建的基因表达载体，除启动子外、还要有目的基因、终止子、复制原点等。（2）统计活菌数目常用稀释涂布平板法，从图2看出，随着时间推移，种群数量不断增加，在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升，所以推测转入的基因ccdB编码的蛋白质诱导能抑制细菌增殖或诱导细菌凋亡，发挥作用的时间大约在15h。（3）从图丙看出，IR3C三菌混菌发酵产生的2-酮-L-古龙酸含量比MSC三菌混菌发酵产量高，因此可以推测，IR3C三菌混菌发酵维生素C产量更高，可能的原因是IR3C转入了ccdB基因，诱导细菌死亡，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。热点角度02植物组织培养技术与基因工程的分析析典例·建模型1．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'-________-3'，切割载体时应选用的两种限制酶是________，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到________，抗性基因________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。【解题建模】第一步：定位考点，明确题目信息本题核心考查基因工程的操作程序综合、植物组织培养技术综合，题目关键信息：（1）PCR扩增的条件。（2）分析引物的序列，限制酶。（3）T-DNA的作用。第二步：结合题目中的知识，拆解过程第三步：规范作答，抓术语与题干信息【答案】(1)4种脱氧核苷酸延伸(2)5'端AGATCTBamHⅠ、EcoRⅠ(3)栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上2再分化得分关键：PCR扩增的条件，分析引物的序列，限制酶，T-DNA的作用研考点·通技法核心考点1：PCR扩增的条件PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。PCR扩增过程中，每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。(1)变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。(2)复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。上一轮循环的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。核心考点2：分析引物的序列，限制酶结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamHI、EcoRI和XbaI的识别序列，而S基因内部含有XbaI、NdeI和BamHI的识别序列，要用BamHI、EcoRI或XbaI切割载体，又不能用XbaI、NdeI或BamHI切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamHI、EcoRI切割载体，用BamHI的同尾酶BglⅡ和EcoRI切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。核心技法：T-DNA的作用农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。破类题·提能力1.（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。(1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过__________（方法）将该质粒转入植物细胞，并将__________整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加__________。(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为__________，对其消毒时需依次使用酒精和__________处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是__________。(3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用__________技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较__________来验证抗病性。(4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为__________。【答案】(1)农杆菌转化法Ti质粒上的T-DNA潮霉素(2)外植体次氯酸钠生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素(3)PCR-测序病斑的大小（或病斑面积、发病情况等合理答案）(4)对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻。【详解】（1）将重组Ti质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。因为农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移DNA）能够整合到植物细胞的染色体DNA上。利用农杆菌侵染植物细胞，从而将重组Ti质粒导入植物细胞。为了筛选出转化成功的细胞，由于重组Ti质粒上含有潮霉素抗性基因（HygR），所以需要在植物组织培养的培养基中添加潮霉素，只有成功导入重组Ti质粒的细胞才能在含有潮霉素的培养基上存活。（2）在植物组织培养中，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体，所以实验中用到的水稻幼胚被称为外植体。对水稻幼胚消毒时需依次使用酒精、次氯酸钠处理。在植物组织培养诱导形成再生植株的过程中，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和细胞分裂素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向，从而诱导形成根和芽等不同的器官，最终形成再生植株。（3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用PCR-测序技术检测目标基因的启动子区是否编辑成功。通过PCR扩增目标基因的启动子区片段，然后进行测序，与编辑前的序列进行对比，看是否发生了预期的改变。在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较病斑的大小（或病斑面积、发病情况等）来验证抗病性。如果基因编辑后的水稻病斑明显小于野生型水稻，说明其抗病性增强。（4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为：对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻，从而使水稻获得了抗病性。热点角度03基因工程与蛋白质工程的分析析典例·建模型1.（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。(1)研究发现，树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异，可设计开展如下实验：①________；②将_______分别进行酶切并连接；③将重组DNA分子导入大肠杆菌；④分离表达的TR1蛋白质测定_______，明确蛋白之间的差异。(2)树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是________。(3)树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是________。【解题建模】第一步：定位考点，明确题目信息本题核心考查自然选择与适应的形成、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、蛋白质工程原理及操作流程，题目关键信息：（1）基因工程的基本操作程序。（2）蛋白质工程。（3）自然选择与适应的形成。第二步：结合题目中的知识，拆解过程第三步：规范作答，抓术语与题干信息【答案】(1)克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1基因目的基因与载体氨基酸序列(2)利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，检测树鼩对辣椒素的敏感性是否提高。(3)树鼩群体出现可遗传的变异和含辣椒素类植物对树鼩的定向选择得分关键：基因工程的基本操作程序，蛋白质工程，适应的形成。研考点·通技法核心考点1：基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。核心考点2：蛋白质工程蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。核心考点3：现代生物进化理论1.种群是生物进化的基本单位。2.突变和基因重组产生生物进化的原材料。3.自然选择决定生物进化的方向。4.隔离导致新物种形成。适应形成的必要条件是树鼩群体出现可遗传的变异，含辣椒素类物质的植物可以拓宽树鼩的食物来源，环境对树鼩进行定向选择，使得树鼩种群中对辣椒素敏感度低的基因频率升高，让树鼩适应含辣椒素类物质的植物。破类题·提能力1.（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：

(1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的___________，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用________凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要__________________。(2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因(3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入________沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的________（A．P1和P2

B．P3和P4C．P1和P4D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有________功能。(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的__________进行比对。将Gpd基因的编码区与____________________连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。【答案】(1)密码子/遗传密码琼脂糖更换微量移液器的枪头(2)C(3)预冷的体积分数为95%的酒精D调控(4)基因数据库/序列数据库表达载体【详解】（1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片段。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以避免交叉污染。（2）A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A不符合题意；B、每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带，B不符合题意；C、在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的DNA是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C符合题意；D、在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外一条条带，D不符合题意。故选C。（3）DNA在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。因为引物P1与P2序列位于模板链上，从左向右为5’→3’，引物P3与P4的序列从右向左为5’→3’，以环形DNA为模板进行第二次PCR时，应选择对已知序列反向，但对未知序列却是相向的引物，即P2和P3，从而得以扩增出未知序列。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。（4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者相同，则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。（建议用时：45分钟）刷模拟1．（25-26高二下·山东临沂·月考）我国科研人员将兔毛角蛋白基因导入到棉花细胞中培育成新型品种“兔毛棉花”。它标志着纺织品已由天然纤维时代、化学纤维时代进入转基因时代。兔毛角蛋白基因片段和质粒的酶切位点如图所示。回答下列问题。(1)可从兔毛囊细胞中提取总RNA，通过________合成cDNA，以此为模板设计特异性引物，通过PCR扩增得到兔毛角蛋白基因的完整编码区序列。(2)为了使兔毛角蛋白基因能够正确地插入质粒中，PCR获取兔毛角蛋白基因时，需在引物a和引物b的______端分别添加酶切位点_____和________的识别序列。扩增缓冲液中Mg2+的作用是__________。(3)采用农杆菌转化法将兔毛角蛋白基因导入棉花细胞中，其中Ti质粒所含T-DNA的作用是_______________。(4)检测转基因棉花是否成功表达出兔毛角蛋白常用方法的原理是________。【答案】逆转录（反转录）(2)5′端EcoRIHindIII激活DNA聚合酶的活性(3)携带目的基因（兔毛角蛋白基因）整合到棉花细胞的染色体DNA上(4)抗原-抗体特异性结合【详解】（1）从兔毛囊细胞中提取总RNA后，通过逆转录（反转录）合成cDNA，以此为模板设计特异性引物，通过PCR扩增得到兔毛角蛋白基因的完整编码区序列。（2）质粒上启动子和终止子之间有HindIII、XbaI、EcoRI位点。为了使目的基因正确插入并表达，应选择能将目的基因定向插入启动子和终止子之间的酶。根据转录方向和质粒图谱，XbaI有两个酶切位点不合适，则选择HindIII和EcoRI可保证目的基因的正确方向。由于转录方向是由右向左，根据质粒中启动子的位置，则引物b的5'端添加HindIII酶切位点，引物a的5'端添加EcoRI酶切位点，扩增缓冲液中Mg²⁺的作用是：作为DNA聚合酶的辅因子，激活DNA聚合酶的活性，同时稳定引物与模板的结合。（3）采用农杆菌转化法将兔毛角蛋白基因导入棉花细胞中，其中Ti质粒所含T-DNA的作用是：携带目的基因（兔毛角蛋白基因）整合到棉花细胞的染色体DNA上，使目的基因能够稳定遗传给子代细胞。（4）检测转基因棉花是否成功表达出兔毛角蛋白常用方法的原理是：抗原-抗体特异性结合（即利用兔毛角蛋白作为抗原，制备特异性抗体，通过检测抗体与棉花提取物中蛋白质的结合情况，判断是否表达出目标蛋白）。2．（25-26高二下·河南洛阳·月考）图中甲、乙分别表示质粒和含目的基因的DNA片段，几种可供选择使用的限制酶识别序列及其切割位点如下：(1)限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间___________的断开。(2)图中甲质粒经Sau3AI完全切割后可得到___________种DNA片段。(3)若将图乙的目的基因正确插入图甲的质粒，需要选择哪两种酶对质粒进行切割？___________。(4)图甲中的tet和AmpR在载体上可作为___________，作用是___________。分别使用含四环素培养基和氨苄青霉素的培养基进行培养，导入重组质粒的菌落的生长情况是___________。【答案】磷酸二酯键3种BclI和EcoRI(4)标记基因对目的基因进行筛选在四环素培养基上不能生长，在氨苄青霉素培养基上能生长【详解】（1）限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且作用于每条链中特定部位两个核苷酸之间的磷酸二酯键，使其断开。（2）Sau3AⅠ的识别序列为-GATC-，观察图甲质粒，其上有三个Sau3AⅠ的酶切位点，分别位于不同位置，经Sau3AⅠ完全切割后，可得到3种DNA片段。（3）根据图乙可知，目的基因的左侧使用Sau3AⅠ切割，右侧使用EcoRI切割。要将图乙目的基因正确插入图甲质粒，需保证目的基因两端的黏性末端能与质粒切割后的黏性末端互补配对。Sau3AⅠ和BclⅠ切割产生的黏性末端相同，且能与目的基因两端的黏性末端互补，所以选择EcoRI和BclⅠ对质粒进行切割。（4）图甲中的tet和AmpR在载体上可作为标记基因，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。由于目的基因插入后破坏了tet基因，保留了AmpR基因，所以在含四环素培养基上不能生长，在含氨苄青霉素培养基上能生长，即导入重组质粒的菌落的生长情况是在含四环素培养基上不能生长，在含氨苄青霉素培养基上能生长。3．（25-26高二下·河南郑州·月考）某真菌的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶：已知乙图中W基因转录方向为从左往右。为使放线菌产生该酶，以图甲中质粒为载体，进行转基因。不同限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。请回答下列问题：限制酶BamHⅠEcoRⅠMfeⅠKpmⅠHindⅢ识别序列及切割位点G↓GATCCG↓AATTCC↓AATTCGCTAC↓CA↓AGCTT(1)限制酶主要是__________中分离纯化出来的。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有___________两种形式。应使用限制酶__________切割图1中质粒，使用限制酶__________切割图2中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。(2)与质粒中启动子结合的酶是____________。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择____________启动子（选填“植物”、“真菌”或“放线菌”）。(3)W基因转录的模板链是____________（选填“甲链”或“乙链”）。子链的延伸方向是____________（“5′→3′”或“3′→5′”）。(4)PCR技术可以分为____________、复性和____________三步。PCR的产物通常用____________进行鉴定。PCR过程中需要在缓冲溶液中添加Mg2+，其作用是_________。【答案】(1)原核生物黏性末端和平末端MfeⅠ、HindIIIEcoRⅠ、HindⅢ(2)RNA聚合酶放线菌(3)乙链5'→3'(4)变性延伸琼脂糖凝胶电泳激活耐高温的DNA聚合酶，使DNA复制能顺利进行【详解】（1）原核生物为了防御外来DNA的入侵，进化出了限制酶，用于切割外源DNA，所以限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种形式，黏性末端是指切割后形成的具有互补碱基的单链末端；平末端则没有单链突出。根据题图信息“图中W基因转录方向是从左往右”、“质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在W基因左侧，终止子应在W基因右侧，W基因右侧只能用HindⅢ切割，W基因左侧有BamHI、KpnI、EcoRI三种酶切位点，由于限制酶MfeI和限制酶EcoRI切割露出相同的黏性末端，结合质粒情况及切割位点识别序列，应使用限制酶MfeI、HindⅢ切割图1中质粒，使用限制酶EcoRI（切割出的黏性末端与MfeI相同）、HindⅢ切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。（2）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，可驱动基因转录出mRNA，所以与质粒中启动子结合的酶是RNA聚合酶。因为要使放线菌产生该酶，且启动子通常具有物种特异性，所以在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择放线菌启动子。（3）W基因转录方向是从左向右，mRNA链的合成方向为5'→3'，与乙链从左向右3'→5'互补，所以W基因转录的模板链是乙链。在转录和DNA复制过程中，子链的延伸方向均为5'→3'。（4）PCR技术可以分为变性、复性和延伸三步。PCR的产物通常用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，通过电泳可以根据DNA片段的大小和迁移率来判断PCR产物的情况。Mg2+是PCR缓冲液中的关键成分，其作用是激活耐高温的DNA聚合酶，使DNA复制能顺利进行。4．（25-26高二下·河南郑州·月考）下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程的图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中LacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题：(1)过程①为了防止目的基因和质粒的自身环化，选用限制酶的最佳方案是________。A．只有BamHⅠ B．BamHⅠ和EcoRⅠ C．EcoRⅤ和BamHⅠ D．EcoRⅤ和EcoRⅠ(2)构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间。启动子的作用是____________。(3)基因工程的四步程序是目的基因的获取、构建基因表达载体、____________和目的基因的检测与鉴定。其中在构建基因表达载体时，所用载体除了质粒以外，还可以选________、动植物病毒等。(4)过程②处理大肠杆菌后，大肠杆菌处于__________的生理状态。(5)为了最终筛选出含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的培养基中额外加入___________，培养一段时间后挑选出____________的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。(6)目的基因导入受体细胞后，常用________技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。【答案】BRNA聚合酶识别和结合位点，驱动转录的进行(3)将目的基因导入到受体细胞噬菌体(4)容易吸收周围环境中DNA分子(5)青霉素和X-gal白色（或白色且存活）(6)抗原-抗体杂交【详解】（1）构建基因表达载体最佳方法是使用双酶切法处理目的基因和载体，使其产生相同的黏性末端，进而通过DNA连接酶构建基因表达载体，选择限制酶的要求是不能破坏目的基因，故不选择EcoRV，可以选择BamHI和EcoRI处理目的基因和质粒。故选B。（2）启动子是指位于基因首端的特殊的DNA序列，是RNA聚合酶识别和结合位点，驱动转录的进行。（3）基因工程的四步程序是目的基因的获取、构建基因表达载体、将目的基因导入到受体细胞和目的基因的检测与鉴定。其中构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，所用载体除了质粒以外，还有噬菌体和动植物病毒等。（4）过程②是用钙离子（Ca2+）处理，目的是将大肠杆菌变成感受态细胞，此时的大肠杆菌处于一种容易吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（5）培养基中额外加入青霉素和X-gal，青霉素可杀死未导入质粒的大肠杆菌，只有导入了质粒的大肠杆菌能存活，而X-gal则可通过菌落颜色进一步筛选：导入空质粒的大肠杆菌因LacZ基因完整，能合成分解X-gal的酶，菌落呈蓝色；导入重组质粒的大肠杆菌因目的基因插入破坏了LacZ基因，无法合成该酶，菌落呈白色，因此培养后需挑选出白色（或白色且存活）的菌落进一步培养，从而获得大量含目的基因表达载体的大肠杆菌。（6）目的基因导入受体细胞后，常用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。如果目的基因表达，是可以检测到相应的蛋白质。5．（2026·山东枣庄·二模）福寿螺Mfcsg基因编码的多功能纤维素酶能够高效降解纤维素。研究人员利用无缝克隆技术构建融合基因导入毛木耳中，以提高其纤维素降解能力，相关流程如图1所示，已知潮霉素对真菌细胞有毒性。限制性内切核酸酶BsmBⅠ具有偏移剪切特性（切割位点在识别序列之外），利用BsmBⅠ可以实现多DNA片段无缝连接，其识别序列及切割位点位于接头序列两侧。(1)为获取Mfcsg基因，可先从福寿螺胃组织细胞中得到mRNA，然后通过_______过程得到cDNA，进而制备目的基因。所构建重组质粒中的S启动子是毛木耳基因的启动子，而没有使用Mfcsg基因自身的启动子，最可能的原因是_______。(2)作为载体，图中重组质粒除标出的结构外，还需具备的结构有_______（答出2点），经过程②构建的重组质粒中不含有BsmBⅠ识别序列，原因是_______。(3)过程①的作用是_______。若Mfcsg基因两端的部分序列为5′-GCGGATGA……TTATGCTCG-3′，已知引物R2的碱基序列为5′-CGTCTCNcgagCATAA…-3′（小写字母表示接头序列），则引物F2的序列可以设计为5′-_______-3′（写出所有已知序列）。若S启动子中与R1互补的核苷酸链从左向右的序列为5′-ATGCGTGA……GGTATGCTT-3′，则引物F2的序列应设计为5′-_______-3′（写出所有已知序列）。(4)将重组质粒的农杆菌导入毛木耳细胞，然后转移至含有_______的培养基中，能正常生长的为符合要求的受体细胞。为检测目的基因是否表达且发挥功能，可以采取的检测方法是_______。【答案】(1)逆转录Mfcsg基因自身的启动子在真菌中不能发挥作用（或者作用效率低）(2)终止子、复制原点识别序列在②过程中被剪切掉(3)各DNA片段添加BsmBⅠ识别序列和接头序列CGTCTCNgcggATGACGTCTCNgcttGCGGATGA(4)潮霉素使用等量的转基因毛木耳和非转基因毛木耳降解纤维素，比较降解效率【详解】（1）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录；所构建重组质粒中的S启动子是毛木耳基因的启动子，而没有使用Mfcsg基因自身的启动子，最可能的原因是Mfcsg基因自身的启动子在真菌中不能发挥作用(或者作用效率低)（2）作为载体的重组质粒，除已标出结构外，还需具备终止子、复制原点等结构。经过程②构建的重组质粒中不含有BsmBⅠ识别序列，原因是BsmBⅠ识别序列在过程②构建的重组质粒时被剪切掉了。（3）过程①是PCR扩增，作用是获取并扩增S启动子、Mfcsg基因、Hpt基因等目的片段，同时为各DNA片段添加BsmBⅠ识别序列和接头序列，以便后续无缝连接。若Mfcsg基因两端的部分序列为5′-GCGGATGA……TTATGCTCG-3′，已知引物R2的碱基序列为5′-CGTCTCNcgagCATAA…-3′，则引物F2的序列可以设计为5′-CGTCTCNgcggATGA-3‘。若S启动子中与R1互补的核苷酸链从左向右的序列为5′-ATGCGTGA……GGTATGCTT-3′，则引物F2的序列应设计为5′-CGTCTCNgcttGCGGATGA-3′。（4）因为Hpt基因表示潮霉素抗性基因，潮霉素对真菌细胞有毒性，所以将重组质粒的农杆菌导入毛木耳细胞后，转移至含有潮霉素的培养基中，能正常生长的是符合要求的受体细胞。为检测目的基因是否表达且发挥功能，可以采取的检测方法是使用等量的转基因毛木耳和非转基因毛木耳降解纤维素，比较降解效率。6．（25-26高二下·江西南昌·月考）动物的某种退行性神经疾病由基因A突变为基因a导致，下图1表示基因A、基因a的部分结构及HindⅢ切割位点。图2表示科学家利用基因编辑（CRISPR/Cas9）技术和其他生物技术为治疗该疾病提供新思路的示意图。回答下列问题：(1)从碱基的角度分析，基因A突变为基因a的突变类型为_______。已知AluI限制酶识别序列及切割位点为，现用HindⅢ和AluI分别完全酶切基因a，形成的末端分别称为_______。为了将AluI切割产生的末端相连，可使用的DNA连接酶是______。(2)利用CRISPR/Cas9编辑基因时，Cas9蛋白依据sgRNA片段（不同的sgRNA可以识别不同的DNA序列），能精准识别并切割细胞中的致病基因a，从而获得不含致病基因a的动物成纤维细胞。CRISPR/Cas9与限制酶的相同点是________。(3)过程①所利用的生物技术是_____________，采集到的卵母细胞需要在体外培养成熟，并通过____________进行去核处理。(4)利用上述思路治疗退行性神经疾病，理论上不会产生免疫排斥反应的原因是_______。【答案】(1)碱基的替换黏性末端和平末端E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶(2)都能识别特定的DNA序列，并断开磷酸二酯键(3)细胞核移植技术显微操作(4)重组细胞的细胞核来自患者，移植的神经干细胞的遗传物质与患者基本相同，因而不会发生免疫排斥反应【详解】（1）对比图1中基因A与基因a的碱基序列，基因A中的一段序列为-AGCTT-，基因a对应位置变为-AGCTG-。这一变化属于碱基对的替换（T//A替换为C//G），未发生碱基的增添或缺失，属于基因突变中的碱基替换。HindIII识别序列为A↓AGCTT（或互补链），切割后产生黏性末端（5'突出），AluI识别序列为AG↓CT（或互补链TCGA），切割位点在中间，产生平末端。E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都是既能连接黏性末端，也能连接平末端，虽然E.coliDNA连接酶连接平末端效率较低，但都可以使用。（2）限制酶的作用特点是特异性识别双链DNA的特定核苷酸序列，并在特定位点切割磷酸二酯键；CRISPR/Cas9本质是一种基因编辑工具，Cas9蛋白依据sgRNA的引导，也能精准识别并切割特定的DNA序列（断开磷酸二酯键），二者在功能本质上的共同点是识别特定的DNA序列，并断开磷酸二酯键。（3）图2中过程①是将患者的成纤维细胞细胞核移入去核的卵母细胞中，构建重组细胞，该技术是体细胞核移植技术；去除卵母细胞的细胞核操作难度高、体积小，必须借助显微操作仪，通过显微操作技术精准去除。（4）本方案中，重构胚的细胞核直接取自患者自身的成纤维细胞，发育成的神经干细胞表面的组织相容性抗原（HLA）与患者完全一致。因此，将修复后的神经干细胞移植回患者体内时，免疫系统会将其识别为“自我”成分，理论上不会发生免疫排斥反应。7．（2026·北京·二模）甘蔗虫害是影响甘蔗产量的重要因素之一，科研人员利用基因工程将S基因导入甘蔗细胞培育抗虫甘蔗植株，相关结构和物质如图所示。回答下列问题：(1)图中作为载体的Ti质粒需具备复制起点、启动子、终止子、__________和多个限制酶切割位点等功能元件，其中卡那霉素抗性基因的作用是________________。(2)构建基因表达载体时，应选择限制酶___________双酶切Ti质粒。酶切后的载体与目的基因通过____________酶连接形成重组DNA。(3)根据S基因的转录方向，_______________链为转录的模板链。(4)转化的植物细胞经____________可快速获得甘蔗植物。为进一步筛选得到抗虫甘蔗，需设置___________________作为对照。【答案】(1)标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，筛选出含有目的基因的受体细胞(2)BamHⅠ和SalⅠDNA连接酶(3)A(4)植物组织培养未导入S基因的普通非转基因甘蔗【详解】（1）基因工程中载体的必备功能元件包括复制起点、启动子、终止子、标记基因和多个限制酶切割位点；卡那霉素抗性基因是标记基因，作用是鉴别受体细胞中是否导入目的基因，进而筛选出含目的基因的受体细胞。（2）构建基因表达载体要求目的基因插入启动子、终止子之间，且不能破坏标记基因（卡那霉素抗性基因）：Ti质粒上卡那霉素抗性基因本身含EcoRⅠ位点，若用EcoRⅠ切割会破坏标记基因，而BamHⅠ和SalⅠ都位于启动子和终止子之间，因此选择这两种酶双酶切；酶切后载体和目的基因需要通过DNA连接酶连接形成重组DNA。（3）转录时RNA聚合酶沿模板链的3'→5'方向移动延伸RNA，图中转录方向为从右向左，要求模板链从右向左移动的方向为3'→5'，即模板链右端为3'、左端为5'，对应图中的A链。（4）转化的植物细胞需要通过植物组织培养，利用植物细胞全能性，快速发育为完整甘蔗植株；筛选抗虫甘蔗时，需要设置未导入S基因的普通非转基因甘蔗作为对照，才能验证转基因甘蔗的抗虫效果。8．（25-26高二下·湖南长沙·月考）人的血清白蛋白（HSA）在临床上需求量很大，通常从人血中提取。但由于艾滋病病毒（HIV）等人类感染性病原体造成的威胁与日俱增，使人们对血液制品顾虑重重，图一是以基因工程技术从植物中获取HSA的途径，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。图二为HSA基因两侧的核苷酸序列（图示为编码链）。图三为相关限制酶的识别序列和切割位点。据图回答下列问题：(1)获取与扩增目的基因：为实现图一过程，先要采用PCR技术扩增HSA基因，根据图二分析，需要选择的一对引物序列是_____。A．引物Ⅰ是5'-GAAGATATCATT-3'，引物Ⅱ是5'-GTAAGTTAAAGAG-3'B．引物Ⅰ是5'-AATGATATCTTC-3'，引物Ⅱ是5'-CATTCAATTCTC-3'C．引物Ⅰ是5'-AATGATATCTTC-3'，引物Ⅱ是5'-GAGAATTCAATG-3'D．引物Ⅰ是5'-GAAGATATCATT-3'，引物Ⅱ是5'-GAGAATTGAATG-3'(2)构建重组Ti质粒：依据图一、图二和图三分析，切割含HSA基因的DNA片段选用的限制酶是_______。为了使目的基因能够表达，构建重组质粒时，目的基因的上游必须有__________，其作用是_______。(3)图一过程①中先用Ca2+处理农杆菌的目的是____________。(4)导入植物细胞：①过程中将植物细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让_____整合到植物细胞染色体DNA上，除尽农杆菌后，还须转接到含_________的培养基上筛选出转化的植物细胞。(5)获得转基因植物：转化的植物细胞经____________可快速获得转基因植株。【答案】C(2)B和C启动子RNA聚合酶识别和结合的位点，启动基因的转录(3)使农杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(4)T-DNA物质K(5)植物组织培养【详解】（1）PCR中需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因模板链的3′端碱基互补配对，子链延伸时是从引物的5′向3′端延伸，根据图二中目的基因HSA处于中间位置及该链两侧的碱基序列可知，符合条件的引物Ⅰ是5'-AATGATATC（酶B识别序列）TTC-3'，引物Ⅱ是5'-GAGAATTC（酶A识别序列）AATG-3′，C正确，ABD错误。（2）图二目的基因所在DNA中只有酶B和酶C的识别序列，可以用限制酶B和C进行切割。启动子和终止子可调控基因的表达，因此为了使目的基因能够表达，构建重组质粒时，目的基因的上游必须有启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动目的基因转录。（3）图一过程①中先用Ca2+处理农杆菌，使农杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（4）图一过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上；除尽农杆菌后，为筛选出转化的植物细胞，利用重组质粒上的报告基因表达产物能催化无色物质K呈蓝色的特性，还须转接到含物质K的培养基上。（5）转化的植物细胞需要经过植物组织培养形成转基因植株。9．（2026·贵州黔东南·三模）小麦条锈病是由条形柄锈菌侵染小麦引起的一种严重的真菌病害，严重影响小麦的产量和品质。某实验室欲利用基因工程技术、植物细胞培养等培育抗病小麦品种，相关结构如图所示，已知AmpR为氨苄青霉素抗性基因，ASA1/B1为色氨酸合成酶基因。不同限制酶的切割位点如表所示。回答下列问题：限制酶识别序列和切割位点BamHⅠ5′-G↓GATCC-3′EcoRⅠ5′-G↓AATTC-3′MfeⅠ5′-C↓AATTG-3′KpnⅠ5′-GGTAC↓C-3′HindⅢ5′-A↓AGCTT-3′(1)已知乙链为模板链，则构建重组质粒时，最好使用限制酶________和________对目的基因进行切割。(2)为初步筛选导入重组质粒的小麦细胞，在培养基成分设置上可采取________两项措施。培养过程中，可通过调整________（写出具体名称）的比例使细胞分化朝着预定方向进行。(3)若利用PCR对目的基因进行扩增，则PCR中复性时降温的目的主要是________。已知某抗病植株由通过农杆菌转化法转入一个抗病基因并成功表达的转化细胞培育而来，现欲通过生物育种方法利用该植株在短期内获得大量能稳定遗传的抗病植株，请对该方法进行简述：________。【答案】(1)EcoRⅠHindⅢ(2)添加氨苄青霉素、不加色氨酸生长素和细胞分裂素(3)使(两种)引物(分别)与两条单链DNA结合(从而使子链进行延伸)利用花药离体培养技术，将该植株的花粉培育至单倍体幼苗植株，淘汰不抗病植株，再将抗病幼苗植株进行低温诱导或用秋水仙素处理，获得正常抗病植株（合理即可）【详解】（1）乙链为模板链，构建重组质粒时，需要将其3´端连接在启动子一侧，根据质粒上限制酶识别切割序列，右侧只能选择HindⅢ切割，BamHⅠ会破坏启动子，MfeⅠ会破坏目的基因，因此应使用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ对目的基因进行切割。（2）重组质粒含有AmpR和ASA1/B1，因此可通过采取向培养基添加氨苄青霉素、不加色氨酸等措施对转化后的小麦细胞进行初步筛选。培养过程中，生长素比例高促进根的分化，细胞分裂素比例高促进芽的分化，因此需调整生长素和细胞分裂素的比例，使细胞分化朝着预定方向进行。（3）PCR的复性阶段降温，主要是为了使引物与模板两条单链DNA的互补序列结合（即引物与模板链退火结合），为后续Taq酶催化子链合成做好准备。可利用单倍体育种在短期内获得大量纯合植株，具体操作利用花药离体培养技术，将该植株的花粉培育至单倍体幼苗植株，淘汰不抗病植株，再将抗病幼苗植株进行低温诱导或用秋水仙素处理幼苗，获得正常抗病植株，优点是能明显缩短育种年限，获得纯合子，这种育种属于单倍体育种。10．（25-26高二下·广东东莞·月考）花椰菜（2n=18）易受黑腐病菌的危害而患黑腐病，野生黑芥（2n=16）具有黑腐病的抗性基因。科研人员用一定剂量的紫外线处理黑芥叶肉细胞原生质体可使其染色体随机片段化甚至丢失。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜幼根细胞原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株，流程如下图。据图回答下列问题：(1)过程①所用的酶是__________，细胞融合完成的标志是________(2)经过②操作后，需筛选出融合的杂种细胞，显微镜下观察融合的活细胞中有黑芥叶肉细胞的_______（填写细胞器名称）存在，可作为初步筛选杂种细胞的标志。(3)采用PCR技术（一种根据DNA特异性鉴定DNA的方法）对花椰菜和黑芥基因组DNA进行鉴定。下图为双亲及再生植株1~4进行PCR扩增的结果。据图判断，再生植株1~4中一定是杂种植株的有_______。(4)黑芥细胞用紫外线照射处理，是为了避免________。(5)对杂种植株进行_______实验，可筛选出具有高抗性的杂种植株。【答案】(1)纤维素酶和果胶酶融合的原生质体再生出细胞壁(2)叶绿体(3)1、2、4(4)黑芥原生质体再生为植株(5)黑腐病菌【详解】（1）过程①表示原生质体的制备，要用纤维素酶和果胶酶去掉植物细胞的细胞壁。细胞融合完成的标志是融合的原生质体再生出细胞壁。（2）用于融合的两个细胞，一个是黑芥苗的叶肉细胞，一个是花椰菜的根部细胞，其中供体细胞特有的结构是叶绿体，可通过观察叶绿体的有无作为初步筛选杂种细胞的标志。（3）根据图谱，花椰菜含有碱基对为300和600的DNA片段，黑芥含有碱基对为1000、1300和1500的片段，再生植株3，只含有长度为300和600的片段，与花椰菜一致，1、2、4既含有花椰菜DNA片段，又含有黑芥DNA片段，为杂种植株。（4）用一定剂量紫外线处理黑芥叶肉细胞原生质体可使其染色体随机片段化甚至丢失，再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜幼根细胞原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株，因此，黑芥细胞用紫外线照射处理，是为了避免黑芥原生质体再生为植株。（5）对杂种植株接种黑腐病菌，能正常生长的即为具有高抗性的杂种植株。11．（2026·河北保定·一模）随着合成生物学的发展，利用工程菌表达具有治疗功效的分子可提高细菌的抗肿瘤能力。已知ClyA基因的表达产物是一种定位于细菌外膜的蛋白，而Noxa基因表达产物可激活小鼠体内的抗肿瘤免疫反应。科研人员将ClyA与Noxa的融合基因插入到温度敏感质粒pBV220中构建了重组质粒，并将其转化至非致病性的大肠杆菌MG1655，从而获得工程菌TRB，构建的过程如图1所示。给小鼠注射大肠杆菌后该菌会靶向肿瘤处聚集，导致肿瘤部位颜色变暗而容易被发现。回答下列问题：注：ori表示复制原点；Tc1表示一种基因；PR―PL表示一种启动子；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。(1)通过PCR分别扩增ClyA和Noxa基因时，缓冲液中添加Mg2+的目的是_______。利用PCR构建ClyA-Noxa融合基因时两种基因在融合处需具有______黏性末端，同时剔除______基因中的编码终止密码的序列。(2)在质粒pBV220中AmpR的功能是作为_____。质粒线性化时，选用EcoRⅠ和SacⅠ进行双酶切以防止_______（答出1点）。将大肠杆菌MG1655置于____（填“高”或“低”）浓度的CaCl2溶液中，可使细胞体积膨胀增加膜的通透性，有利于重组质粒的转入。(3)已知Tc1基因的表达产物可结合到PR―PL启动子上阻止_____识别和结合从而影响转录过程。研究发现，当温度较高时，Tc1蛋白构象会被破坏，ClyA-Noxa融合基因的表达量将_________。(4)将荷瘤小鼠分为5组，分别处理如下：只注入磷酸盐缓冲液（PBS）、注入MG1655、注入MG1655并用激光照射（MG1655+L）、注入TRB、注入TRB并用激光照射（TRB+L），已知用激光照射肿瘤部位时可引发光能转化为热能。处理后监测小鼠肿瘤体积随时间的变化情况，实验结果（如图2）表明，五组实验中，_______组的肿瘤治疗效果最明显，分析其原因是___________。(5)用最优方案治疗后，继续检查小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要器官有无明显病理改变，这些检查的目的是___________。【答案】(1)激活DNA聚合酶相同的（互补的）ClyA(2)标记基因质粒或目的基因自身环化；目的基因的反向连接低(3)RNA聚合酶增加(4)TRB+L热诱导（激光照射肿瘤部位，通过光热转化效应）能触发Noxa基因的表达，Noxa蛋白可提升小鼠体内肿瘤杀伤的效果(5)检测TRB有无引起宿主毒性；评估TRB治疗的安全性【详解】（1）PCR体系中Mg2+的作用是激活TaqDNA聚合酶，维持酶活性；构建融合基因时，两个基因需要产生相同的黏性末端才能连接；融合基因表达完整融合蛋白，需要去除上游基因（本题中ClyA在Noxa上游）的终止密码编码序列，避免翻译提前终止。（2）抗性基因AmpR是标记基因，用于筛选成功导入重组质粒的受体菌；双酶切可以产生不同的黏性末端，有效避免质粒或目的基因自身环化以及目的基因反向连接；制备感受态大肠杆菌时，低浓度CaCl2（低渗溶液）使细胞吸水膨胀，增加细胞膜通透性，利于重组质粒进入细胞。（3）启动子是RNA聚合酶识别结合的位点，Tc1蛋白结合启动子后会阻断RNA聚合酶的结合，抑制转录；高温使Tc1构象破坏，抑制作用解除，因此融合基因的表达量增加。（4）从图2可知，TRB+L组肿瘤体积最小，治疗效果最好；原因是工程菌TRB可靶向肿瘤，热诱导（激光照射肿瘤部位，通过光热转化效应）能触发Noxa基因的表达，Noxa蛋白可提升小鼠体内肿瘤杀伤的效果。（5）治疗后检查正常器官，目的是检测该治疗方案是否存在毒副作用，对治疗的安全性进行评估。所以这些检查的目的是检测TRB有无引起宿主毒性；评估TRB治疗的安全性。12．（2026·甘肃兰州·一模）环黄芪醇是黄芪甲苷的核心活性成分，具有抗氧化、增强免疫力等多种药理作用。传统提取法受黄芪种植周期、产量限制，成本较高。科研人员通过基因工程将黄芪中环黄芪醇合成的两个关键酶基因（CAS基因和CYP基因）导入酿酒酵母，构建高产环黄芪醇的基因工程菌，实现环黄芪醇的微生物合成，部分过程如图所示。回答下列问题：(1)从黄芪根组织中提取的RNA可通过________过程获得cDNA，再以cDNA为模板PCR扩增CAS基因和CYP基因.PCR扩增时，引物的作用是________。(2)基因表达载体的核心组成除目的基因、启动子、终止子外，还必须有________。为避免同一表达载体上的两个目的基因同源重组，需选用________（填“相同”或“不同”）的启动子和终止子分别调控两个基因的表达。(3)构建重组表达载体时，需用限制酶切割载体和目的基因，限制酶的作用特点是________。(4)将重组表达载体导入酿酒酵母前，需用________处理酵母细胞，使其处于感受态。(5)为检测目的基因是否成功导入酿酒酵母，可采用________技术进行分子水平检测；若要检测目的基因是否成功表达，需从工程菌株中提取总蛋白，采用________技术进行检测。【答案】(1)逆转录（反转录）使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(2)标记基因（复制原点）不同(3)识别DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断裂(4)Ca2+（CaCl2）(5)PCR（DNA分子杂交）抗原——抗体杂交【详解】（1）以RNA为模板合成DNA的过程为逆转录，是获取真核生物目的基因（cDNA）的常用方法。PCR中引物的作用是与模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。（2）基因表达载体的必备组件包括目的基因、启动子、终止子、标记基因（用于筛选含重组载体的受体细胞）和复制原点（保证载体在受体细胞中复制）。为避免两个目的基因因共用启动子/终止子发生同源重组，且保证各自独立表达，需选用不同的启动子和终止子分别调控两个基因。（3）识别DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断裂，是限制酶（限制性核酸内切酶）的核心作用特点，其具有特异性，能精准切割特定位点。（4）将重组表达载体导入微生物常用感受态细胞法，用Ca2+（CaCl2）溶液处理细胞，可增大细胞膜通透性，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的感受态。（5）检测目的基因是否导入受体细胞，常采用PCR技术或DNA分子杂交技术。检测目的基因是否成功表达（产生蛋白质），需采用抗原—抗体杂交技术，这是检测翻译层面的直接证据。13．（25-26高二下·山东枣庄·月考）双特异性抗体是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合。目前最常利用杂交瘤杂交法来制备。长春花是原产于非洲东海岸的野生花卉，其所含的长春碱具有良好的抗肿瘤作用，下图1是科研人员通过杂交—杂交瘤细胞技术（免疫的B淋巴细胞和杂交瘤细胞杂交技术）生产能同时识别癌胚抗原和长春碱的双特异性单克隆抗体的部分过程，图2是某双特异性抗体作用图，请分析回答下列问题：(1)对③筛选出的杂交瘤细胞，还需进行______和______，才能筛选出足够量的既能无限增殖又能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。(2)单克隆杂交-杂交瘤细胞在体外培养时，需要满足的条件是充足的营养，无菌无毒的环境，适宜的______和适宜的气体环境等。(3)临床试验发现，从小鼠腹水中提取抗体具有外源性，直接注入人体治疗效果大大降低，因此鼠源性的双特异性单克隆抗体在注射到人体前需要进行人源化改造，除抗原结合区域外，其他部分都替换为人抗体区段，目的是降低______。(4)与直接使用长春碱相比，将长春碱与双特异性单克隆抗体结合后给药，对人体的副作用更小，原因是______。(5)从图中可以看出，单克隆抗体的制备过程运用了动物细胞工程中的______和______两大技术。【答案】(1)克隆化培养抗体检测(2)温度、pH和渗透压(3)免疫排斥反应(4)双特异性单克隆抗体能将抗癌药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞(5)动物细胞培养动物细胞融合【详解】（1）为选出能产生专一抗体的杂交瘤细胞，要将从HAT培养基上筛选出的细胞稀释液滴入多孔培养板中，使多孔培养板每孔中有一个细胞，然后筛选出专一抗体检测呈阳性的细胞，进行克隆化培养。因此对③筛选出的杂交瘤细胞，还需进行克隆化培养和抗体检测，才能筛选出足够量的既能无限增殖又能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。（2）单克隆杂交-杂交瘤细胞在体外培养时，需要满足的条件是充足的营养，无菌无毒的环境，适宜的温度（36.5±0.5℃）、pH（7.2-7.4）、渗透压和适宜的气体环境（95%空气+5%CO2）等。（3）由于从小鼠腹水中提取抗体具有外源性，直接注入人体后会被人体免疫系统识别和清除，因此鼠源性的双特异性单克隆抗体在注射到人体前需要进行人源化改造，除抗原结合区域外，其他部分都替换为人抗体区段，目的是降低免疫排斥反应。（4）双特异性单克隆抗体能将抗癌药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞，避免了对正常细胞的损伤，因而对人体的副作用更小。（5）从图中可以看出，单克隆抗体的制备过程运用了动物细胞工程中的动物细胞培养和动物细胞融合两大技术。14．（2026·天津·模拟预测）金黄色葡萄球菌分泌的葡激酶（SAK）是一种具有溶解血栓功能的药用蛋白。科学家将获得的SAK基因与农杆菌Ti质粒重组，构建了重组质粒（其T-DNA区如图1所示），并将其导入番茄细胞，获得能表达有活性SAK蛋白的转基因番茄植株。注：LB和RB分别是T-DNA区的左、右边界；NPTⅡ为卡那霉素抗性基因；CaMV35S为启动子，NOS-Ter为终止子；BamHⅠ、XbaⅠ是两种限制酶；gusA为标记基因，其表达产物能催化无色底物X-Gluc水解产生蓝色产物。回答下列问题：(1)获取目的基因。构建金黄色葡萄球菌的_______，从中获取SAK基因。(2)构建重组质粒并导入农杆菌，再用含重组质粒的农杆菌感染番茄根部组织。为了检测SAK基因是否导入番茄根部组织中，可将根部组织转至含有_______的培养基上进行筛选，也可将根部组织用X-Gluc溶液进行染色，若根部组织_______，则说明含SAK基因的T-DNA已经成功导入，再通过植物组织培养获得再生植株。(3)转基因植株的鉴定。Ⅰ.检测目的基因。①可用_______技术精准检测转基因番茄植株中是否已成功导入SAK基因，结果如图2所示。注：样品1为重组质粒，样品2～4来自待测的转基因番茄植株。②图2中，样品5来自_______番茄植株。样品2～4的杂交条带位置不尽相同，这可能是因为______。Ⅱ.蛋白表达分析。转基因番茄植株SAK蛋白的表达量测定结果如图3所示，SAK蛋白在_______（填“果实”或“叶片”）中的表达量较高，可选其作为生产SAK蛋白的生物反应器。【答案】基因文库(2)卡那霉素变蓝(3)PCR野生型（或未转SAK基因）SAK基因在基因组DNA上的插入位点不同果实【详解】（1）可通过构建金黄色葡萄球菌的基因文库，从中获取SAK基因。（2）T-DNA区有卡那霉素抗性基因和gusA，二者都会随目的基因导入宿主细胞，要检测SAK基因是否导入番茄根部组织中，可将根部组织转至含有卡那霉素的培养基上进行筛选，也可将根部组织用X-Gluc溶液进行染色，题干信息提到gusA的表达产物能催化无色底物X-Gluc水解产生蓝色产物，因此若发现根部组织变蓝，则说明含SAK基因的T-DNA已经成功导入，再通过植物组织培养获得再生植株。（3）Ⅰ.检测目的基因。①若要检测转基因番茄植株中是否成功导入SAK基因，可使用PCR技术。②题图2中，样品1为重组质粒，样品5无杂交带，说明其不含SAK基因，则5号样品为野生型（或未转SAK基因）。样品2～4的杂交条带位置不尽相同，可能是由于SAK基因在基因组DNA上的插入位点不同。Ⅱ.蛋白表达分析。由题图3可知，SAK蛋白在果实中的表达量较高，可选其作为生产SAK蛋白的生物反应器。15．（2026·新疆·三模）慢病毒（A）属于逆转录病毒，改造后的慢病毒（B）可作为基因工程的载体。已知碱基序列的增强型绿色荧光蛋白基因（eGFP）长度为720bp，其控制合成的蛋白质激发的荧光可用荧光显微镜进行观察。回答下列问题：(1)A的遗传物质为RNA，能通过逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，并整合到宿主细胞染色体DNA中。如图表示中心法则及其补充，①~⑤表示遗传信息的传递过程，A能进行①~⑤中的________过程。(2)为使A能应用于基因工程，消除A的致病性，研究人员删除了A的部分基因，使A不能正常增殖，将A与基因工程有关的基因改造后分别插入四种质粒I~Ⅳ中，并在I质粒中插入eGFP。四种质粒I~Ⅳ分别与经Ca2+处理的细菌混合，培养细菌。将提取纯化的四种质粒包裹于脂质体中，与培养的人胚肾细胞混合。在人胚肾细胞中，四种质粒有关基因形成的RNA和蛋白质结合形成B，最终得到大量的B。Ca2+处理细菌的作用是________，培养细菌的主要目的是________。将人胚肾细胞置于含有95%空气和5%CO2混合气体的CO2培养箱中进行培养，CO2的主要作用是________。检测人胚肾细胞是否导入B的具体方法是________。(3)B作为载体将目的基因插入受体细胞染色体DNA的位点是随机的，对受体细胞基因造成的影响可能是_____________________________（答出1点即可）。【答案】①