第9章 免疫组织化学技术

病理检验技术

免疫组织化学技术和应用高职高专医学检验技术专业系列教材目

录第一节免疫组织化学概述01第二节免疫组织化学的基本技术02第三节免疫组织化学的常用染色方法03第四节免疫组织化学在临床病理工作的应用04学习目标知识目标能力目标素质目标掌握免疫组化技术的概念、操作步骤。熟悉免疫组化技术的注意事项。能进行免疫组织化学常用液体及抗体的配制，会操作免疫组织化学常用仪器进行染色。

严格遵守操作规程、规范操作的职业精神。严谨认真的工作态度、一丝不苟的工作作风。第一节

免疫组织化学概述一、免疫组织化学技术的基本原理

免疫组织化学技术(immunohistochemistrytechnique)又称免疫细胞化学技术，习惯简称免疫组化，是利用免疫学反应和化学反应在组织切片或细胞涂片上原位显示组织细胞中的抗原以及抗原的分布和含量，以了解相关抗原在组织和细胞中的变化及其意义的一种方法。二、免疫组织化学技术的特点

1.特异性强

2.敏感性高

3.定性、定位、定量相结合

4.方法基本相同

5.应用范围广三、免疫组织化学技术的局限性

病理诊断主要是依据常规HE染色切片，免疫组化技术只是一种辅助手段。高质量的免疫组化染色结果能辅助病理医师更准确地进行病理诊断，提高病理诊断水平；非特异性的免疫组化染色结果可能会引起漏诊和误诊甚至造成错误的病理诊断。目前，免疫组织化学技术逐步代替了许多特殊染色和组织化学技术方法，但仍无法完全取代。第二节

免疫组织化学的基本技术一、免疫组织化学标本的取材、固定、切片及注意事项(一)取材1.组织标本的取材(1)活体组织标本的取材(2)手术切除标本的取材2.细胞标本的取材(1)穿刺法(2)沉淀法(3)印片法一、免疫组织化学标本的取材、固定、切片及注意事项(二)固定1.常用的固定液用于免疫组织化学的固定液种类较多，不同的固定液有不同的作用。至今还没有一种固定液能用于所有染色组织的固定。(1)醛类固定液。(2)丙酮及醇类固定液。2.常用的固定方法(1)浸泡固定法。(2)注射或灌注固定法。(3)微波固定法。3.固定的注意事项一、免疫组织化学标本的取材、固定、切片及注意事项(三)切片

切片要求薄而平整，一般厚度在3～5μm之间，细胞密集的组织，如淋巴结，应当切3μm薄片，切片太厚会影响免疫组织化学染色的结果和结果判断，还容易在染色过程中发生脱片。1.石蜡切片2.冷冻切片二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(一)常用液体的配制1.常用的缓冲液（1）0.01mol/L磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline，PBS）

NaH2PO40.2gNa2HPO40.5gNaCl8.0g蒸馏水加至1000ml二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(一)常用液体的配制2.常用的抗原修复液（1）0.01mol/L柠檬酸缓冲液（pH6.0）

柠檬酸（C6H8O7·H2O）0.38g柠檬酸钠（Na3C6H5O7,·2H2O）2.41ml蒸馏水加至1000ml二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(二)抗体的稀释和保存1.抗体的稀释(1)影响抗体稀释度的因素(2)抗体最佳稀释度的测定方法1）直接测定法：在二抗或三抗的稀释度已知的情况下,用于检测第一抗体的最佳稀释度。可以将一抗稀释为1:50、1:100、1:200、1:400、1:500等几个稀释度，分别滴加在阳性抗原切片上，同时设置阴性对照。2）棋盘测定法：当两种以上抗体的最佳稀释度都未知时采用此法。将一抗和二抗分别按不同滴度稀释，对已知阳性切片进行染色。二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(二)抗体的稀释和保存2.抗体的分装和保存

分装在安瓿或0.25ml带盖塑料离心管中，可按每安瓿5～50μl分装，并标记清楚(名称、批号、效价、量)，密封后放入-40～-20℃冰箱中保存备用，一般可保存1～2年。3.孵育方法及时间

抗体孵育应在特制的湿盒内进行，以免切片因水分蒸发、干燥而导致染色失败。孵育温度为室温或37℃，孵育时间常为1小时左右，也在4℃冰箱过夜。二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(三)显色与显色剂配制1.显色

免疫组织化学技术中，抗原抗体反应所形成的复合物本身没有颜色，无法进行观察和判断，需要借助某些化学基团的呈色反应使其显色，才能在显微镜下观察。二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(三)显色与显色剂配制2.显色剂及其配置1）DAB显色液DAB2mg0.05mol/LTris-HCI缓冲液（pH7.6)10ml30%H2O2水溶液10μl二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(三)显色与显色剂配制2.显色剂及其配置2）AEC显色液AEC2mg二甲基甲酰胺0.5ml0.02mol/L醋酸盐缓冲液（pH7.4)10ml30%H2O2水溶液10μl二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(四)背景复染及复染剂1.背景复染

免疫组织化学染色后，还必须用其他染料对切片进行复染，才能更好地观察阳性结果与周围组织细胞的关系，使免疫组织化学染色结果定位更为清晰。2.复染剂

常用的细胞核复染剂有苏木精、甲基绿和核固红三种。其中苏木精呈蓝色、甲基绿呈绿色、核固红呈红色。一般情况下，石蜡切片常用苏木精，冷冻切片常用甲基绿，而免疫金银法染色常用核固红。三、免疫组织化学常用仪器的使用方法

免疫组织化学制片所需仪器与常规病理制片基本相同，主要有显微镜、恒温箱、烤箱、冰箱、高压锅、微波炉、湿盒、切片架、冲洗瓶、微量加样器等。其中微量加样器和微波炉的使用需要特别注意。四、载玻片的防脱片处理常用的防脱片方法有以下几种：1.多聚左旋赖氨酸2.

3-氨丙基-3-乙氧基硅烷(APES)五、抗原修复抗原修复(antigenretrieval,AR)是将固定时分子之间形成的交联打开，恢复到原有空间状态，以提高组织抗原检出率。但是，并不是所有的抗体染色都需要抗原修复，不当的抗原修复会引起假阳性或者假阴性的结果。常用的抗原修复方法1.蛋白酶消化法2.热诱导的抗原修复(HIAR)第三节

免疫组织化学的常用染色方法一、免疫组织化学常用染色方法及注意事项免疫组织化学技术根据加入抗体的次数分为直接法和间接法。直接法用标记抗体与组织中的相应抗原直接结合，因为只加一次抗体，所以又叫一步法。间接法包括二步法、三步法等。（一）一步法抗体标记酶直接标记在第一抗体上，染色时，滴加第一抗体与组织细胞抗原结合，形成抗原-抗体结合物，然后加入显色剂显色。目前常用的一步法为增强聚合物（enhancedpolymeronestep，EPOS）一步法。一、免疫组织化学常用染色方法及注意事项（二）二步法抗体标记酶标记在第二抗体上，染色时，滴加第一抗体与组织细胞抗原结合，形成抗原-抗体结合物，然后加入第二抗体与第一抗体结合，把抗原-抗体结合物放大，最后加入显色剂显色。二抗上的标记酶与显色剂起反应，形成有色沉淀定位在组织细胞中。常用的二步法有LDP法、EnVision法等。一、免疫组织化学常用染色方法及注意事项（三）三步法三步法的抗体标记酶标记在第三抗体上。第二抗体标记有生物素，第三抗体为链菌素，染色时，滴加第一抗体与组织细胞抗原结合，形成抗原-抗体结合物，然后加入第二抗体与第一抗体结合，把抗原-抗体结合物放大，再加入第三抗体，三抗链菌素通过生物素与二抗连接，把一抗和二抗结合物放大，最后加入显色剂显色。三抗的标记酶与显色剂起反应，形成有色沉淀定位在组织细胞中。二、常用免疫组织化学染色方法的评价

一般来说，抗体与抗体的连接步骤少，干扰染色结果的因素少，染色特异性高，但由于没有将抗原-抗体结合物放大，所以染色敏感性低；二步法和三步法，连接抗体步骤多，能把抗原-抗体结合物进行特异性放大，因此敏感性高，但由于在放大抗原-抗体结合物过程中，影响染色结果的因素增多，因此，染色特异性相对低。三、免疫组织化学染色结果的判断原则1.HE染色的观察2.对照片结果的观察3.阳性结果定位的观察四、自动免疫组化染色机的应用

免疫组化染色过程步骤繁多，手工操作从第一张片开始滴加试剂到最后一张，很难保证每张片子的时间一样，特别是染片量大的时候。自动免疫组化染色机的应用有利于规范化和标准化操作和染色质量控制，保证染色结果的准确性，也减轻技术人员的工作负担。染色机通过连接实验室信息化管理系统可以实现科室与医院临床科室间的信息共享，这也是未来病理科室发展趋势之一。五、免疫组织化学染色质量控制1.及时取材，及时固定。固定时间一般为为4～6小时，不超过24小时。固定不足或过度固定都不利于免疫组化染色。2.石蜡切片脱蜡要彻底，脱蜡不干净会造成局灶性阳性等染色不均匀的现象，甚至染色失败。3.是否进行抗原修复以及用何种方法修复，应当参考一抗说明书和实验室预实验结果来决定。不当的抗原修复会引起假阳性或假阴性的结果，或者导致抗原定位发生改变。4.使用的二抗为HRP/鼠/兔，不需要考虑所用的一抗是鼠抗还是兔抗。五、免疫组织化学染色质量控制5.不同厂家不同批次的同一种抗体其染色效果不尽相同。6.不同试剂盒标记的酶可能不同，应根据一抗和显色剂合理选择。试剂盒配套使用的一抗所用显色剂HRP/鼠AP/鼠鼠源单克隆抗体DAB,AEC固蓝，固红，CIP/NBTHRP/兔AP/兔兔源单克隆抗体和兔源多克隆抗体DAB,AEC固蓝，固红，CIP/NBTHRP/鼠/兔AP/鼠/兔鼠源单克隆抗体，兔源单克隆抗体和兔源多克隆抗体DAB,AEC固蓝，固红，CIP/NBT五、免疫组织化学染色质量控制7.加抗体前要尽可能甩干切片上的PBS。8.滴加抗体要完全覆盖组织。9.加抗体前后均应用PBS充分浸洗切片，一般用3缸PBS。10.组织切片背景染色深的原因可能是：①第一抗体浓度太高。②抗体孵育时间过长。③抗体孵育温度过高。④DAB显色剂中DAB浓度过高或H2O2太多。⑤正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前用了PBS洗切片。⑥抗体纯度不高。⑦抗体孵育后洗不干净。⑧内源性过氧化物酶的干扰。⑨内源性生物素的干扰。⑩在染色过程中发生干片现象。第四节

免疫组织化学在临床病理工作的应用一、肿瘤良恶性的诊断和鉴别诊断有些肿瘤单纯依靠形态学变化，很难作出确切的诊断，可结合免疫组织化学检查综合判断肿瘤的良恶性。比如滤泡型淋巴瘤与淋巴结滤泡性反应性增生，仅从形态学上很难作出正确诊断，可选用免疫球蛋白轻链k和λ进行标记，如果滤泡内的淋巴细胞单克隆表达k或λ，则提示为淋巴瘤，如果滤泡内的淋巴细胞同时表达k和λ，则提示为反应性增生。二、判断肿瘤的组织学起源

一些组织来源不明的肿瘤，可通过免疫组织化学检测，判断其组织起源。如上皮细胞膜抗原、细胞角蛋白等抗体染色为阳性，支持癌的诊断；波形蛋白抗体染色为阳性，则支持肉瘤的诊断。三、评价肿瘤细胞的增生程度和生物学行为

通过Ki-67和增殖细胞核抗原(PCNA)等抗体的免疫组织化学检查，可对肿瘤细胞增殖核抗原进行定位、定量检测，更加全面、可靠地评价肿瘤细胞的增生程度和生物学行为。Ki-67或PCNA表达越高的肿瘤，恶性程度越高，预后越差。四、指导肿瘤的临床治疗和判断疗效通过免疫组织化学方法，对肿瘤细胞内的各种激素受体进行定位、定量分析，既可指导临床治疗，也可判断肿瘤的预后及疗效。如雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR