NK细胞制备与培养标准操作流程

NK细胞制备与培养标准操作流程

1目的与范围：

目的：规范NK细胞培养操作流程，保证NK细胞产品制备的稳

定性、均一性。

范围：适用于本实验室细胞培养技术人员对NK细胞培养的全过

程。

2文件：

NK细胞制备与培养标准操作流程

3记录：

NK细胞制备与培养记录表、操作1间清场记录表

4试剂、耗材与仪器设备：

试剂：75%酒精、D-PBS缓冲液或生理盐水、淋巴细胞分离液、

AMMS无血清培养基、自体血清、A/B/C/D/E因子、

耗材：T175培养瓶、培养袋、15ml离心管、50ml离心管、50ml

一次性注射器、5ml一次性注射器、1ml一次性注射器、

10ml移液管、1ml枪头、2003枪头、103枪头、巴斯德滴

管、Ep管、一次性过滤器。

仪器设备：超净工作台、离心机、倒置显微镜、CO2培养箱、

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水浴锅、电动移液枪、Ind手动移液枪、200。手动移液

枪、医用剪刀、医用止血钳、试管架、50ml注射器支架、

托盘。

5工作程序：

实验前准备：

洁净区需经紫外线照射，连续照射时间230min,实验室共作

过程中风机始终保持开启运行状态。

超净工作台需经过开机紫外线照射，照射时间230niin,开机

风机运行eiOmin。开启超净工作台玻璃防护窗，待超净工

作台内部气流稳定后才可使用。

将实验室所需的器械、耗材放于物料传递窗进行紫外线照射2

30min（器械与各规格的移液枪头必须经过高温高压灭菌

锅消毒灭菌，且在合格期内），照射完毕后将器械包与所

需耗材用75%酒精纱布擦拭外包装消毒后放入超净工作台

内备用。

将淋巴细胞分离液、AMMS无血清培养基、PBS缓冲液或生理盐

水提前30min从4℃冰箱取出，用75%酒精纱布擦拭后放

入超净工作台，恢复至室温备用。

A/B/C/D/E因子、IL-2在使用时提前lOmin从-20℃冰箱取

出，即用即取，禁止在常温状态下长期放置。

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将所需T175培养瓶、50ml离心管、15ml离心管、50ml一次

性注射器、10ml移液管、hnl移液枪头、200ul移液枪头

经过酒精擦拭后放入超净工作台备用。

试剂配制：

配制要求：实验室所有试剂配制应在超净工作台内，按照试剂

说明书或按照实验室细胞培养耍求配制试剂。

NK细胞培养基配制：

完全培养基：AMMS无血清培养基+5%自体血清

活化培养基：AMMS无血清培养基+IL-2（终浓度为

1000TU/ml）

细胞因子配制：将因子B/C/D/E从4c冰箱取出，打开后，用

1ml移液枪注入1ml活化培养基使其充分溶解后吸出备

用，再用培养基冲洗西林瓶，以减少最大损耗。

T175培养瓶包被预处理（第-1天）

用移液枪将NK试剂A全部转移到事先备有的装有D-PBS的

15mL离心管中，充分混匀30sTmin后将溶液全部转移

入T175培养瓶中，轻轻摇晃使其均匀铺满底部，4C冰

箱平放过夜。（注意：第一次吸取试剂A原液后，可再

用适量PBS冲洗西林瓶洗出残留原液，以最大程度减少

损耗）

24h后取出，直接吸弃包被液，无需清洗即可使用。

6分离提取PBMC（第0天）：

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制备血浆:

将装有全血的采血管用酒精擦拭外表面消毒后放入超净工作台

内，打开采血管盖子，将全血倒入至事先备好的50ml离

心管中，一共2支，每管25ml。

室温2000rpm,离心lOmin（离心机升降速:升9降4）。

离心完毕后，从离心机中拿出离心管，用75%酒精纱布擦拭离

心管外表面消毒，放入超净工作台内，用电动移液枪吸取

上层血清至50ml离心管中，灭活（56℃水浴锅中水浴

30min,4℃放置30min）,剩余下层血细胞备用。

将灭活好的血清2800rpm离心8min,离心完毕后，将上清分

于3支15ml离心管中，-20℃冰箱保存。

提取PBMC：

将生理盐水袋用75%酒精纱布擦拭消毒后放入超净工作台内，

再用75蛤酉精纱布对生理盐水袋口进行擦拭消毒后，用医

用剪刀剪去袋口。

用生理盐水对剩余的下层血细胞进行稀释，稀释比例按生理盐

水:血细胞二：1,最后将稀释好的血细胞重悬、混匀备用。

根据稀释后的血细胞体积，在另一个50ml离心管加入对应体

积的淋巴细胞分离液，将稀释、混匀的血细胞悬液缓慢加

入到装有淋巴细胞细胞分离液的50ml离心管中（即淋巴

细胞分离液:稀释的血细胞悬液=1:1）。

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操作方法：可将离心管倾斜45°,用电动移液枪吸取血细

胞悬液，沿离心管壁缓慢滴加在淋巴细胞细胞分离液

表面，滴加完毕后，缓慢竖立离心管（不耍打乱液面

界面），加入总体积不超过45ml,室温，2500rpm,

离心2（hrin（注意：调整离心机的升降速为最低，调

整电动移液枪输出速度最低）。

离心完毕后，小心取出离心管，可见清晰的细胞分层，用75%

酒精纱布擦拭离心管外表面消毒后放入超净工作台。（注

意轻拿轻放，保持离心管竖直放置，以免破坏细胞分

层）。

用巴斯德滴管或1ml移液枪缓慢插入离心管中，沿管壁提取淋

巴细胞分离液与血浆层交界处的白膜层，将提取的白膜层

细胞加入到备用的50ml离心管中，补充生理盐水至

45ml,混匀，1500rpm,离心5n1in。

离心完毕后，取出离心管，用泗精纱布擦拭离心管外表面后放

入超净工作台内，倒掉上清，补充生理盐水至45ml重

悬，lOOOrpm,离心lOmin（步骤重复两次）。

待步骤第二次离心完毕后，取出离心管，外表面用75%酒精纱

布擦拭消毒后放入超净工作台内，取足量上清至15m离心

管中，做上标记，送微生物检测并留样（检测内容：细

菌、霉菌、为毒素、衣原体、支原体），剩余上清弃去，

离心管底部剩余细胞用10mL活化培养基重悬，计数。

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细胞接种:

根据计数结果将细胞浓度调整为1-2X10,个/mL（最优为XIO，；

个/mL）,用适量活化培养基冲洗离心管并转移入T175包

被培养瓶中，以减少细胞损耗。（注意：包被瓶取出时间

为细胞加入前5min,其他时间需在4c放置保存）

并补加NK试剂B,患者灭活血浆（5%）确保瓶中培养基终体

积为25血,左右，拧紧培养瓶盖，“8”字轻微摇晃培养

瓶，使细胞悬液均匀的铺满培养瓶底部，水平放入

37C、5%C01培养箱中培养。（剩余血浆4℃密封保存备

用）

7NK细胞扩增培养：

第一次补液（第3天）：取出培养瓶，用75%酒精纱布擦拭外表

面消毒后放入超净工作台内，取出事先溶好的

NK试剂3用1ml移液枪吸出后加入培养基中，

同时补加5%的患者灭活血浆至75ml,充分混匀

后竖直放入37℃、5%C02培养箱中培养。（注

意：请勿吹打细胞）

第二次补液（第5天）：取出培养瓶，用75%酒精纱布擦拭培养

瓶外表面消毒后放入超净工作台内，取出事先溶

好的NK试剂D,用1ml移液枪吸出后加入培养

基中，同时补加5%的患者灭活血浆至250ml,充

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分混匀后竖直放入37℃、5%C0z培养箱中培养。

（注意：请勿吹打细胞）

第三次补液及其转袋（第7天）：

取转袋所需的50ml一次性注射器、5ml一次性注射器、托

盘、培养袋与注射器支架，经酒精擦拭消毒后放入超净工

作台备用。

将50ml注射器针头及助推器弃去，放入到注射器支架的圆口

内，用75%酒精纱布擦拭培养袋导管盖子下l-2cni处，擦

拭消毒两次，用医用止血钳取下培养袋前端盖子，连接

导管口与注射器口。

从（%培养箱取出T175培养瓶，用75%酒精纱布擦拭外表面后

放入超净工作台内，打开T175培养瓶盖，将T175培养

瓶中细胞悬液缓慢倒入注射器内，待培养瓶中细胞悬液

倾倒完后，可往培养瓶中倒入5nli活化培养基进行涮

洗，用移液枪轻轻吹打培养瓶底部1切勿剧烈吹打D,

将涮洗的细胞悬液同样按上述方.法倒入培养袋中。

待细胞悬液转袋完毕后，按照上述方法同时补加活化培养

基，NK试剂D及剩余的全部患者灭活血浆至750mL

待细胞悬液及添加因子转袋完毕后，用医用止血钳夹紧培养

袋导管前端，将导管与注射器分离并将导管抬高，确保

细胞悬液全部进入培养袋后，用止血钳将导管盖子盖上

并拧紧，用塑料夹夹紧导管末端。

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将培养袋平放，用双手轻按培养袋，使组胞与培养基混匀。

用酒精擦拭培养袋取样口，培养袋标记后双手托住培养

袋下方放入托盘中，送至37℃、培养箱中培养。

第四次补液（第9天）：主要为分袋操作。

准备一新的未使用的培养袋来，将50ml注射器针头及助推器弃

去，放入到注射器支架的圆口内，用75%酒精纱布擦拭培

养袋导管盖子下l-2cm处（两次），用医用止血钳取下培

养袋前端盖子，连接导管口与注射器口。

从培养箱中取出培养袋，用75%酒精纱布擦拭培养袋外表面后

放入超净工作台内，并挂于超净工作台内的挂钩上。双手

轻轻按压培养袋，使培养袋中的细胞悬液混匀，用止血钳

夹紧培养袋导管，用75%酒精纱布对导管口1-2cm处进行

擦拭消毒，并拧开培养袋导管盖子。

轻轻按压培养袋，使袋中的细胞悬液缓慢匀速经由导管流入注

射器内，当转入新袋的细胞悬液体积达到约为375ml时，

将导管口抬起，使导管内的细胞悬液回流至旧培养袋中，

用止血钳将导管前端夹紧，置于工作台内。

按照步骤的方法分别往两个培养袋中补充添加活化培养基，

至终体积为750ml。

补液完毕后，将培养袋平放，用双手轻按培养袋，使细胞与

培养基混匀。用酒精擦拭培养袋取样口，培养袋标记后

双手托住培养袋放入托盘内，送至培养箱中培养。

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第五次补液（第12天）：主要为补液操作，按照步骤的方法分

别往两个培养袋中补充添加剩余的活化培养基，至终体积为

1000mlo

8细胞回输（第13/14天）：

细胞收获：

检查NK培养袋标记是否与回输计划相符。取出培养袋，用

75%酒精纱布擦拭培养袋外表面后放入超净工作台内，并

挂于超净工作台内的挂钩上。

取8个250ml离心瓶，标记，打开离心瓶盖子，整齐摆放于工

作台内，将离心瓶刻度面向操作者。

混匀培养袋中的细胞悬液，用止血钳夹紧培养袋导管，用75%

酒精纱布对导管口l-2cm处进行擦拭消毒，并拧开培养袋

导管盖子。左手握住止血钳，右手拿住导管，慢慢松开止

血钳，由慢到快将培养袋中的细胞悬液引入到离心瓶内，

当需要换离心瓶时，只需左手提紧止血钳，右手将导管放

至新的离心瓶口即可。

细胞清洗

用75%酒精纱布擦拭生理盐水袋外表面后放入超净工作台内，

并对生理盐水袋口进行两次擦拭消毒，用医用剪刀剪开消

毒过的袋口，备用。

将上述收集的细胞悬液，1200rpm,离心8min。待离心完毕，

取出离心瓶，用75%酒精纱布擦拭离心瓶外表面后放入超

1010

净工作台内，将上清倒入事先备好的无菌密闭容器内

（收集贮存），离心瓶中添加50ml生理盐水重悬、混

匀。

将重悬的细胞收集到四个250ml离心瓶中，剩余的两个离心瓶

可每瓶用20ml生理盐水涮洗，将涮洗的细胞悬液也倒入

收集的两个离心瓶中重悬、混匀，1200rpm,离心8min。

待离心完毕，取出离心瓶，用75%酒精纱布擦拭离心瓶外表面

后放入超净工作台内，倒掉上清，离心瓶中添加100ml生

理盐水重悬、混匀，1200rpm,离心8min（注意:此骤重

复2-3次，且最后一次离心前按照步骤方法将两个离心瓶

中的细胞收集到一个离心瓶内）。

待离心完毕，取出离心瓶，用75%酒精纱布擦拭离心瓶外表面

后放入超净工作台内，往15ml离心管内倒入10ml上清，

标记，做霉菌、内毒素、支原体、衣原体检测并留样，多

余上清倒掉。离心瓶内留下的NK细胞用生理盐水20ml重

悬，取20ul中间层细胞悬液计数及活率检测。

根据计数及活率检测结果，调整NK细胞浓度为广2x10",通过

一次性细胞筛网过滤，将重悬混匀的NK细胞悬液通过注

射器注入100-200ml的生.理盐水袋中，旦NK细胞悬液中

添加终浓度为设的白蛋白。

轻按生理盐水袋，使生理盐水、\K细胞与白蛋白充分混匀，

在生理盐水袋上粘贴相应回输信息标签（核对姓名、TD

1111

号、性别等），用外包装带密封，通过传递窗传出实验

室。

9注意事项、微生物检测控制点与