《番茄品种真实性鉴定 SSR分子标记法》

1番茄品种真实性鉴定SSR分子标记法本文件规定了利用SSR分子标记法进行番茄(SolanumlycopersicumL.)品种真实性鉴定的原理和鉴定.2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T3543.1农作物种子检验规程第1部分:总则GB/T3543.2农作物种子检验规程第2部分:扦样GB/T3543.11农作物种子检验规程第11部分:品种质量品种真实性鉴定3术语和定义下列术语和定义适用于本文件.3.1品种真实性身份验证varietyverification经与其对应品种名称的标准样品比较,鉴定供检样品标注的品种名称是否真实.3.2品种真实性身份鉴定varietyidentification经与标准品种指纹数据比对平台筛查比较,鉴定供检样品的品种真实名称或与其他品种的同一性.3.3标准样品standardsample国家指定机构保存的经认定代表品种特征特性的实物种子样品.3.4参照样品referencecontrolsample用于校准待测样品等位变异且已定义基因型的样品.3.5引物组合primerpanel具有不同荧光颜色或相同荧光颜色而扩增片段大小不同、能够组合在一起进行电泳的一组荧光标记引物.3.6SSR指纹数据比对平台SSRfingerprintblastplatform采用SSR分子标记的规定位点组合鉴定品种标准样品等位变异的信息,运用数据库和网络信息技术所构建的品种分子数据信息的检索比对载体.4缩略语下列缩略语适用于本文件.bp:碱基对(basepair)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy_ribonucleosidetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)Taq酶:耐热DNA聚合酶(Taq_DNApolymerase)TBE:三羟甲基氨基甲烷_硼酸盐_乙二胺四乙酸(Tris_Borate_EDTA)Tris:三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]5原理和总则5.1原理番茄不同品种基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR)差异,这种差异可通过从有代表性的混合试样或个体试样中提取DNA,采用SSR位点组合进行扩增,检测其扩增产物加以区分,通过分析样品间DNA位点差异鉴定品种真实性。注:DNA提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液参照附录A配制,所用试剂均为分析纯。5.2总则5.2.1样品状况、引物、检测平台不同,其检测结果准确度、精确度可能有所不同。应依据“适于检测目的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,选定适宜的样品数量、引物、检测平台,制订相应的检测方案。5.2.2首先选择附录B中前14对引物进行检测,当样品间检测出的差异位点数小于3时,再选用附录B中后14对引物进行检测;必要时,进一步选择特定标记进行检测。可选择采用变性PAGE垂直板电泳或者毛细管电泳,送验样品和标准样品在同一块电泳板上比较。对于5.2.3本文件推荐了变性PAGE垂直板电泳和毛细管电泳可选择采用变性PAGE垂直板电泳或者毛细管电泳,送验样品和标准样品在同一块电泳板上比较。对于真实性身份鉴定真实性身份鉴定,宜采用毛细管电泳。如利用SSR指纹数据比对平台,可利用参照样品确定送验样品的指纹后再进行真实性身份鉴定指纹后再进行真实性身份鉴定。6试验条件真实性鉴定应在有利于检测正确实施的控制条件下进行,包括但不限于下列条件:a)检验人员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能;b)所用仪器与使用的技术相适应,并已经过定期维护、验证和校准;c)使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材;d)使用经校准检测评定的参照样品。7试剂7.1DNA提取7.1.1液氮(N2)。7.1.2SDS(C12H25NaSO4,CAS号:151__21__3)。7.1.3氯化钠(NaCl,CAS号:7647__14_5)。7.1.4乙二胺四乙酸二钠(EDTA_Na2●2H2O,C10H14N2Na2O8,CAS号:6381__92__6)。7.1.5三羟甲基氨基甲烷[Tris,NH2C(CH2OH)3,CAS号:77__86__1]。7.1.6无水乙醇(CH3CH2OH,CAS号:64_17__5)。7.1.7盐酸(HCl,CAS号:7647__01__0)。7.1.8氢氧化钠(NaOH,CAS号:1310__73__2)。27.1.9异丙醇(C3H8O,CAS号:67__63__0)。7.1.10醋酸钾(C2H3KO2,CAS号:127__08__2)。7.2PCR扩增7.2.1dNTPs。7.2.210×PCRBuffer(含MgCl2)。7.2.3Taq酶。7.2.42×TaqMix。7.3电泳7.3.1变性PAGE垂直板7.3.1.1丙烯酰胺(C3H5NO,CAS号:79__06__1)。7.3.1.2N,N_亚甲基双丙烯酰胺(C7H10N2O2,CAS号:110__26__9)。7.3.1.3尿素(CH4N2O,CAS号:57__13__6)。7.3.1.4去离子甲酰胺(CH3NO,CAS号:75__12__7)。7.3.1.5乙二胺四乙酸(EDTA,C10H14N2O8,CAS号:60__00__4)。7.3.1.6溴酚蓝(C19H10Br4O5S,CAS号:115__39__9)。7.3.1.7二甲苯青(C25H27N2NaO7S2,CAS号:4463__44_9)。7.3.1.8三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3,CAS号:77__86__1)。7.3.1.9硼酸(BH3O,CAS号:10043__35__3)。7.3.1.10无水乙醇(C2H6O,CAS号:64_17__5)。7.3.1.11亲和硅烷(bindingsilane)。7.3.1.12剥离硅烷(repelsilane)。7.3.1.13过硫酸铵(APS,H8N2O8S2,CAS号:7727__54_0)。7.3.1.14冰醋酸(Aceticacid)(C2H4O2,CAS号:64_19__7)。7.3.1.15四甲基乙二胺(TEMED,C6H16N2,CAS号:110__18__9)。7.3.1.16硝酸银(AgNO3,CAS号:7761__88__8)。7.3.1.17氢氧化钠(NaOH,CAS号:1310__73__2)。7.3.1.18乙二胺四乙酸二钠(EDTA_Na2●2H2O,C10H14N2Na2O8,CAS号:6381__92__6)。7.3.1.19甲醛(CH2O,CAS号:50__00__0)。7.3.1.20DNA分子量标准。7.3.2毛细管电泳与使用的毛细管电泳仪型号相匹配的分离胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液等。8仪器设备8.1高速冷冻离心机:转速≥12000r/min。8.2微量移液器或微量移液工作站。8.3水浴锅或干式恒温金属浴:20℃~65℃。8.4紫外分光光度计:波长定点扫描230nm、260nm和280nm。8.5组织研磨仪。8.6分析天平:感量为0.01g。8.7pH计。8.8涡旋混合器。48.9高压灭菌锅。8.10PCR扩增仪。8.12垂直板电泳槽及其配套的制胶附件。8.13胶片观察灯。8.15凝胶成像系统或数码相机。8.16毛细管电泳仪。9.1送验样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官,需要扦样的种子样品数量应符合GB/T3543.2的规定。送验样品如为种子,质量应不低于3g或数量不少于500粒;送验样品如为幼苗、叶片、果实等组织或器官,应至少来自30个随机个体。9.2试验样品采用混样检测,样品不少于30个个体。根据品种真实性身份验证或身份鉴定的需求,选定附录B的引物进行合成。选用变性PAGE垂直板收波长相匹配的荧光染料。具体引物分组信息见附录C。电泳根据品种真实性身份验证或身份鉴定的需求,选定附录B的引物进行合成。选用变性PAGE垂直板收波长相匹配的荧光染料。具体引物分组信息见附录C。DNA提取方法应保证提取的DNA质量符合PCR扩增的要求,DNA无降解,溶液的紫外光吸光度OD260/OD280宜介于1.7~2.0,OD260/OD230宜介于1.5~2.0。以下为推荐的DNA提取方法,其他能够达到要求的DNA提取方法均适用于本文件。取试样的种子、胚根或叶片300mg~400mg,加入液氮迅速研磨成粉末后,转入2.0mL的离心管匀。待样品冷却至室温后,每管加入0.3倍体积的匀。待样品冷却至室温后,每管加入0.3倍体积的醋酸钾(3mol/L)混合液,充分混合后静置10min,选用适宜SSR标记法的商业试剂盒,并经验证合格后使用。DNA提取方法,按照试剂盒提供的使用说明进行操作。10.3PCR扩增PCR扩增反应体系的总体积和组分终浓度根据表1进行配制。可依据试验条件的不同作适当调整。表1PCR扩增反应体系反应组分原浓度终浓度推荐反应体积,μL10×PCRBuffer(含Mg)2dNTPs10mmol/L0.4mmol/mL0.8Taq酶5U/μL0.05U/μL0.25反应组分原浓度终浓度推荐反应体积,μL上游引物10μmol/L1μmol/L1下游引物10μmol/L1μmol/L1模板DNA50ng/μL5ng/μL2ddHO——注:使用2×TaqMix混合液进行PCR扩增,可直接在反应体系中加入相应的引物和模板DNA,加入量参照表1,用ddHO补齐至反应总体积20μL.反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等的不同作适当调整.通常采用下列反应程序:a)预变性:95℃,5min,1个循环;b)扩增:95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;c)终延伸:72℃,10min;d)扩增产物置于4℃保存.10.4.1变性PAGE垂直板电泳蘸少量洗涤剂和清水仔细反复将玻璃板刷洗,再用蒸馏水冲洗干净,竖置晾干.将玻璃板水平放置,用95%乙醇纵向横向各擦拭板面3次.干燥后使用亲和硅烷工作液均匀涂满无凹槽的玻璃板表面,剥离硅烷工作液均匀涂在有凹槽的玻璃板表面.玻璃板干燥后,将0.4mm厚的塑料隔条放在无凹槽的玻璃板两侧,盖上凹槽短玻璃板,用夹子在两侧夹好固定,用水平仪检测是否水平.量取80mL6%变性聚丙烯酰胺凝胶溶液,加入180μL10%过硫酸铵和60μLTEMED,轻轻混匀后,沿着灌胶口轻轻灌入,防止气泡出现.胶灌满玻璃胶室,在凹槽处将鲨鱼齿梳子的平端插入胶液5mm~6mm.室温下胶聚合0.5h~1.0h后,轻轻拔出梳子,用清水洗干净备用.注:为保证检测结果的准确性,建议玻璃板的规格宜为45cm×35cm.将4μL上样缓冲液(A.3.1)加入PCR扩增产物,离心混匀.95℃变性5min后,取出迅速放置于冰上,冷却10min待用.10.4.1.3.1将聚合好的胶板安装于电泳槽上,在电泳正极槽(下槽)加入600mL的1×TBE缓冲液,负极槽(上槽)加入600mL的1×TBE缓冲液,拔出样品梳,在180V恒压预电泳20min~30min,用注射器或吸管清除加样槽孔内的气泡和杂质,将样品梳插入胶中1mm~2mm.每一个加样孔加入5μL~8μL变性样品,在180V恒压下电泳.10.4.1.3.2电泳的适宜时间参考二甲苯青指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围(见附录C)加以确定.扩增产物片段大小在(100±30)bp、(150±30)bp、(200±30)bp、(250±30)bp范围的,电泳参考时间分别为0.6h、0.9h、1.2h、1.5h.电泳结束后关闭电源,取下玻璃板并轻轻撬开,凝胶附着在无凹槽的玻璃板上.将粘有凝胶的长玻璃板胶面向上浸入“固定/染色液”中,轻摇染色槽,使“固定/染色液”均匀覆盖胶板,置于摇床上染色5min~10min.将胶板移入水中漂洗30s~60s.再移入显影液中,轻摇显影槽,使显影液均匀覆盖胶板,待带型清晰,将胶板移入去离子水中漂洗5min,晾干胶板,放在胶片观察灯上观察记录结果,用数码相机或凝胶成像系统拍照保存.6注:固定液、染色液、双蒸水和显影液的用量,可依据胶板数量和大小调整,以没过胶面为准.10.4.2荧光毛细管电泳稀释约200倍.吸取稀释后的混合液1.5μL,加入毛细管电泳仪专用96孔上样板上.每孔再分别加入0.1μL分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺,95℃变性5min,取出立即置于冰上,冷却10min以上,离心10s后备用.注:本方法是以ABI3730荧光毛细管检测平台为参考,如使用其他平台应根据设备作相应调整.10.4.2.2打开毛细管电泳仪,检查仪器工作状态和试剂状态.10.4.2.3将装有扩增产物的96孔上样板放置于样品架基座上,将装有电极缓冲液的buffer板放置于buffer板架基座上,打开数据收集软件,按照毛细管电泳仪的使用手册进行操作.毛细管电泳仪将自动运行参数,并保存电泳原始数据.10.5.1.1电泳结果需要通过规定程序进行数据分析以降低误读率.在引物等位变异片段大小范围内(见附录C),对于毛细管电泳,特异峰呈现为稳定的单峰型、双峰型或连续峰型;对于变性PAGE垂直板电泳,特异谱带呈现稳定的单谱带、双谱带或连续谱带.10.5.1.2对于毛细管电泳,由于不同引物扩增产物表现不同、引物不对称扩增、试验条件干扰等因素影响,可能出现不同状况的峰型,按照以峰高为主、兼顾峰型的原则依据下列规则进行甄别、过滤处置:峰值升高的,应预先将其干扰消除后再进行分析;a)对于连带(pull－up)峰峰值升高的,应预先将其干扰消除后再进行分析;b)对于(n+1)峰,即对于同一位置出现2个相距1bp左右的峰,应视为单峰;c)对于高低峰,应通过设定一定阈值不予采集低于阈值的峰;d)对于有2个以上特异峰,应考虑是由非纯合SSR位点或混入杂株所致;e)对于连续多峰,即峰高递增或峰高接近的相差一个重复序列的连续多个峰,应视为单峰,取其最右边的峰,峰高值为连续多个峰的叠加值.注:当存在非纯合SSR位点时,将会有2个特异峰,此时应采集2个峰值.10.5.1.3对于变性PAGE垂直板电泳,位于相应等位变异扩增片段大小范围之外的谱带需要甄别是非特异性扩增还是新增的稀有等位变异.采用单个个体扩增的产物,出现3种及3种以上的多带则为非特异性扩增;采用混合样检测的,某些位点出现3种以上的谱带或上下有弱带等情况出现时,则需要通过单个个体进行甄别.10.5.1.4采取混合样检测的,无论是毛细管电泳还是变性PAGE垂直板电泳,送验样品存在异质性时,宜采用单个个体独立检测,试样至少含有30个个体.异质性严重时,可终止真实性检测.10.5.2数据分析和读取10.5.2.1变性PAGE垂直板电泳对甄别后的特异谱带进行扩增片段大小的读取,统一采用两段式数据记录方式(见附录D).纯合位点数据记录为X/X,非纯合位点数据记录为X/Y(其中X、Y分别为该位点2个等位基因扩增片段大小),小片段数据在前,大片段数据在后.缺失位点数据记录为0/0.导出电泳原始数据文件,采用数据分析软件对数据进行甄别,按照下列步骤执行:a)设置参数:在数据分析软件中预先设置好panel、分子量内标、panel的相应引物的Bin(等位变异片段大小范围区间);b)导入原始数据文件:将电泳原始数据文件导入分析软件,选择panel、分子量内标、Bin、质量控制参数等进行分析;c)甄别过滤处置数据:执行10.5.1的规定.7分析软件会对检测质量赋以颜色标志进行评分,绿色表示质量可靠无需干预,红色表示质量不过关或未落入Bin范围内,黄色表示有疑问需要查验原始图像进行确认。数据比对采用10.5.3.1、10.5.3.2方式的,应分别通过同时进行试验的标准样品、参照样品(依据引物选择少量的对照),校准不同电泳板间的数据偏差后再读取扩增片段大小。甄别后的特异峰落入Bin范围内,直接读取扩增片段大小;若其峰大多不在Bin范围内,可将其整体平移尽量使峰落入Bin设置范围内后读取数据。10.5.3数据比对10.5.3.1采用与标准样品比较的,对甄别后的特异谱带或特异峰(见10.5.1),按照在同一电泳板上的送验样品与标准样品逐个位点进行两两比较,确定其位点差异。10.5.3.2采用毛细管电泳与SSR指纹数据库比对的,按照数据导入模板的要求,将数据及其指纹截图上传到SSR指纹数据库,进行逐个位点在线比对,核实确定相互间的指纹数据的异同。10.5.3.3采用PAGE垂直板电泳与SSR指纹数据库比对的,按照数据导入模板的要求,将数据上传到SSR指纹数据库,进行逐个位点的两两比对,核实确定相互间的指纹数据的异同。注:采用PAGE垂直板电泳与SSR指纹数据库比对较为困难,仅作为参考使用,比对前应采取以下措施:a)读取扩增产物片段大小数据的,送验样品与参照样品同时在同一电泳板上电泳;b)电泳时间足够;c)送验样品存在扩增片段为一个基序差异的,按片段大小顺序重新电泳进行复核确定后读取。10.5.4数据记录数据比对后,按照位点存在差异、相同、数据缺失、无法判定等情形,记录每个引物的位点状况。11.1品种真实性身份验证鉴定意见可参考以下原则:a)送验样品与标准样品比较,差异位点数≥3,排除两者为同一品种;b)送验样品与标准样品比较,差异位点数为1或2,不确定两者为同一品种;c)送验样品与标准样品比较,差异位点数为0,不排除两者属于同一品种。11.2品种真实性身份鉴定鉴定意见可参考以下原则:a)送验样品与标准样品或SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数为0,不排除两者属于同一品种;b)送验样品与标准样品或SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数为1或2,不确定两者为同一品种;c)送验样品与标准样品或SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数≥3,排除两者为同一品种。12结果报告按照GB/T3543.1和GB/T3543.11的规定执行。8附录A(资料性)A.1DNA提取A.1.11mol/LTri称取Tris121.1g溶于800mL水中,加入HCl调节pH至8.0,加水定容至1000mL,121℃高温高压灭菌20min。A.1.20.5mol/LEDTA溶液称取EDTA_Na2●2H2O186.1g溶于800mL水中,加入固体NaOH调节pH至8.0,加水定容至1000mL,121℃高温高压灭菌20min。A.1.35mol/LNaCl溶液称取固体NaCl146.1g溶于适量水中,充分搅拌溶解后,加水定容至500mL,121℃高温高压灭菌A.1.4SDS提取液1mol/LTris_HCl50mL、0.5mol/LEDTA50mL、5mol/LNaCl50mL、SDS7.5g,定容至500mL。A.1.53mol/L醋酸钾溶液称取固体醋酸钾147.2g溶于适量水中,充分搅拌溶解后,加水定容至500mL。A.2PCR扩增用超纯水分别配置dATP、dGTP、dCTP、dTTP终浓度为100mmol/L的储存液,分别用0.05ml/L的Tris碱调整pH至7.0。各取8