《微生物检验技术培训课程》课件-分枝杆菌属检验

分枝杆菌属检验COMBINEDWITHMYCOBACTERIUMASSAY分枝杆菌属分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长或略弯曲、有的呈分支状或丝状的杆菌，主要特点是细胞壁含有大量脂质(占其干重的60%)，这与本菌染色性、抵抗力和致病性等密切相关。分枝杆菌一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后，能抵抗3%盐酸乙醇的脱色作用，故又称为抗酸杆菌。分枝杆菌的种类很多，包括结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌或非典型分枝杆菌、麻风分枝杆菌等。高手名牌江湖大名结核分支杆菌人送外号全球不败经典形象万“蓝”丛中一束“红”；菜花样菌落必杀技结核病高手体态分析（生物学性状）（一）形态与染色典型的结核分枝杆菌形态细长，稍弯曲、两端呈圆形，在陈旧培养物中或在抗结核药物作用下可出现球状、颗粒状等多形性。无芽胞、无荚膜、无鞭毛。革兰染色阳性，但不易着色，常用萋-尼抗酸染色法，经此法染色后，结核分枝杆菌呈红色，而标本中其他细菌、细胞、杂质等均呈蓝色。高手体态分析（生物学性状）刁：结合分支杆菌为专性需氧菌，5%~10%CO2可刺激其生长。最适pH值为6.5-6.8，最适生长温度为35-37℃。馋：结核分枝杆菌营养要求较高，初次培养常用罗氏培养基，必须在含血清、蛋黄、甘油、马铃薯、天门冬素（属于氨基酸类物质）、无机盐类等特殊成分的培养基中才能生长良好。懒：因结核分枝杆菌细胞壁的脂质含量较高，影响营养物质的吸收，故生长繁殖缓慢，一般培养2-4周才出现肉眼可见的菌落。丑：典型菌落为乳酪色或米黄色、干燥、表面粗糙呈颗粒状，形似菜花。（二）培养特性高手体态分析（生物学性状）结核分枝杆菌因细胞壁含大量类脂质，对理化因素的抵抗力比一般致病菌的强。在干燥痰中能存活半年以上，附着于灰尘上可保持传染性8-10天。在6%H2SO、或3%HCL、4%NaOH溶液中放置30min内，其活力可以不受影响，故常用酸碱处理有杂菌污染的标本，以此分离结核分枝杆菌。（四）抵抗力结核分枝杆菌不发酵糖类，能产生触酶，而耐热触酶试验大多阴性。（三）生化反应高手体态分析（生物学性状）结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。对异烟肼、链霉素、利福平等较易形成耐药性，耐药菌株毒力减弱。1908年，Calmette与Guerin二人将有毒的牛型结核分枝杆菌培养于含有甘油、胆汁、马铃薯的培养基中，经13年传种230代，获得减毒菌株，制备成卡介苗(BCG)，现已广泛用于结核病的预防。（五）变异性高手技能分析（致病性）（一）致病物质脂质结核分枝杆菌细胞壁中脂质含量约占壁干重的60%，成分复杂，与毒力有关的主要成分有磷脂、索状因子、蜡质D、硫酸脑苷酯。菌体蛋白结核分枝杆菌含有多种蛋白质，有抗原性，能与蜡质D结合而使机体发生迟发型超敏反应，并参与结核结节的形成。高手技能分析（致病性）结核分枝杆菌可经呼吸道、消化道、破损的皮肤黏膜等多种途径进人机体，侵犯多种组织器官，引起相应部位的结核病，其中以通过呼吸道引起的肺结核最常见。传染源主要是排菌的肺结核患者，尤其是痰涂片阳性、未经治疗的患者。由于感染菌的毒力、数量、侵入次数和机体的免疫状态不同，肺结核分为原发感染和继发感染两大类。部分患者结核分枝杆菌可经血液、淋巴液扩散到肺外组织，引起肺外感染，如脑、肾结核。痰菌被咽入消化道可引起肠结核、结核性腹膜炎。通过破损皮肤感染的结核分枝杆菌可导致皮肤结核。免疫力极度低下者如艾滋病患者，结核分枝杆菌可造成全身播散。（二）所致疾病高手印迹追踪（标本采集）痰标本：最好收集清晨第一口痰液，盛于无菌痰盒内或试管内送检，痰应来自于肺部，可嘱患者进行深呼吸，使肺充满空气，然后用力从肺深处咳出，取材时应挑取脓样干酪样颗粒或带褐色血丝部分。尿标本：可收集清晨1次全部尿量或24h尿沉淀10～15mL送检，必要时无菌导尿送检。粪便标本：选取脓性部分。胃液标本：应于空腹时抽取胃液或洗胃液（特别是儿童）置于无菌瓶中送检。穿刺液标本：应置于无菌试管中送检。高手身份鉴定1.直接涂片薄涂片：挑取痰或其他处理过的标本约0.01mL，涂于载玻片上。厚涂片：取标本0.1mL涂于载玻片上。抗酸染色或荧光染色后镜检，涂片镜检的报告方式见表。2.集菌涂片沉淀集菌法：标本加适量无菌蒸馏水高压蒸汽灭菌后，3000r/min离心30min，取沉渣涂片。漂浮集菌法：标本加适量无菌蒸馏水高压蒸汽灭菌后，再加人二甲苯0.3mL，充分振荡后静置15min，将载玻片盖于瓶口15min后取下，干燥后进行抗酸染色镜检,报告方法同直接涂片法。3.荧光显微镜检查法制片方法同前，用金胺“O”染色，在荧光显微镜下可见到分枝杆菌的荧光。本法不用油镜，视野覆盖面积大，节约人力，能够提高工作效率和阳性率，但也有漏检者，必要时还可用抗酸染色法复染核查。（一）直接镜检高手鉴定标本的前处理：痰等含有杂菌的标本须进行适当的处理，以去除杂菌和液化标本。目前多用N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化液进行标本处理。固体培养基培养法：将上述经处理的标本接种子改良罗琴培养基等固体培养基上，35℃、5%~10%CO2中培养。若出现可疑菌落且镜检为抗酸杆菌，则报告“分枝杆菌培养阳性”；若培养8周末见菌落生长，则报告“分枝杆菌培养阴性”。培养阳性者应同时报告生长的茂盛程度，报告方式见表。液体培养基培养法：将标本接种于培养瓶中，置于全自动分枝杆菌快速培养系统中。若培养液变色或变混浊，或仪器自动检测系统报告有菌生长，则涂片染色，镜检见抗酸杆菌，可报告“分枝杆菌培养阳性”。（二）分离培养高手鉴定在结核病发病率最高的15个国家里，13个在非洲，而所有新增病例的三分之一在印度和中国。印度和中国占肺结核所有新增病例的三分