核酸检测手册第二版2026.12

前言本手册旨在为临床及公共卫生领域的核酸检测工作提供标准化操作指引。自第一版发布以来，核酸检测技术在疾病防控、临床诊断等方面持续发挥关键作用。第二版在总结前期实践经验基础上，结合最新技术进展与监管要求，对原有内容进行了修订与完善，强化了质量控制体系，细化了关键操作环节，并新增了若干特殊场景下的检测策略。本手册适用于各级医疗机构、疾病预防控制机构及其他经认证的核酸检测实验室操作人员，旨在确保检测结果的准确性、可靠性与时效性，为疫情防控和临床决策提供科学依据。使用者在实际操作中，除遵守本手册规定外，还应同时符合国家及地方相关法律法规要求。1.术语与定义1.1核酸检测(NucleicAcidTesting,NAT)：通过特定技术（如聚合酶链式反应）检测样本中目标核酸（DNA或RNA）的存在与否及浓度，以辅助诊断或监测的方法。1.2样本(Specimen)：从人体采集的用于检测的物质，如鼻咽拭子、口咽拭子、痰液、血液、粪便等。1.4临界值(CutoffValue)：用于判断检测结果阳性或阴性的临界荧光信号值或循环阈值（Ct值）。1.5室内质量控制(InternalQualityControl,IQC)：实验室为保证检测结果的精密度和准确性，在常规检测过程中采取的一系列质量控制措施。1.6室间质量评价(ExternalQualityAssessment,EQA)：由外部机构组织，通过对实验室检测结果的比对和评价，以监控实验室检测能力的活动。2.检测人员资质与职责2.1资质要求检测人员应具备医学检验、分子生物学或相关专业背景，经严格培训并考核合格后方可上岗。需熟悉本手册全部内容、所使用的仪器试剂说明书及生物安全相关规定。每年应参加不少于规定学时的专业技术培训和继续教育，确保知识与技能的更新。2.2主要职责严格按照标准操作规程进行样本接收、处理、核酸提取、扩增及结果判读。负责仪器设备的日常维护、校准与性能验证。执行室内质量控制程序，及时记录并分析质控结果，对失控情况进行调查与纠正。参与室间质量评价活动。负责实验记录的规范填写与妥善保管。遵守生物安全操作规程，防止实验室感染和环境污染。3.实验室环境与设备要求3.1实验室分区实验室应至少划分以下独立区域，并有明确标识，各区之间避免交叉污染：样本接收与处理区：用于样本的接收、核对、编号及前处理（如离心）。核酸提取区：专用生物安全柜内进行核酸提取操作。扩增区：用于PCR反应体系配制及扩增反应。产物分析与结果报告区：用于扩增产物的检测、结果判读、数据分析及报告出具。建议各区在物理空间上完全分隔，气流方向应从清洁区向污染区，或采用独立的空气处理系统。3.2主要仪器设备实时荧光定量PCR仪：应定期进行校准和性能验证，确保扩增效率和检测灵敏度符合要求。核酸提取仪：根据实验室规模和检测需求选择合适的自动化或手动提取设备，定期维护。生物安全柜：A2型或以上级别，定期（至少每半年）进行安全检测。高速离心机：具备防气溶胶功能，用于样本处理。移液器：涵盖不同量程，定期校准（至少每半年一次）。冰箱、冰柜：用于试剂和样本的储存，温度需实时监控并记录。恒温水浴锅或金属浴：用于样本或试剂的温育。紫外灯：用于操作台和生物安全柜的表面消毒。4.试剂与耗材管理4.1试剂选择与验证应选择经国家药品监督管理部门批准或符合相应标准的试剂。新试剂在启用前，需进行性能验证，包括但不限于：准确性（与参考方法或已验证试剂比对）、精密度（批内、批间重复性）、最低检测限、特异性、线性范围及抗干扰能力等。验证结果需记录存档。4.2试剂储存与使用严格按照试剂说明书要求的条件（温度、避光等）储存，不同批号试剂分开存放，先进先出。试剂启用前应检查标签完整性、有效期及外观是否正常（如有无沉淀、变色）。配制好的反应混合液应在规定时间内使用，避免反复冻融。每次实验记录所用试剂的批号、有效期及配制日期。4.3耗材要求使用无RNA酶、无DNA酶、无热原的一次性无菌耗材，如离心管、吸头（带滤芯）、采样管等。耗材应在有效期内使用，储存于干燥清洁环境。5.样本采集、运输与接收5.1样本采集通用原则采集人员需穿戴个人防护装备（PPE），包括医用外科口罩或以上防护级别口罩、护目镜或面屏、乳胶手套、隔离衣等。使用专用采样管（含适当保存液），确保采样管完好、标签清晰。严格无菌操作，避免样本污染和交叉感染。采集量和采集部位应符合检测要求，保证样本质量。5.2常见样本类型及采集方法鼻咽拭子：使用聚酯或尼龙纤维拭子，轻轻插入受检者一侧鼻孔，沿下鼻道底部向后缓缓深入约1-1.5厘米，旋转至少3圈，停留片刻后取出，立即放入含保存液的采样管中，折断拭子杆，旋紧管盖。口咽拭子：使用聚酯或尼龙纤维拭子，嘱受检者张口发“啊”音，暴露咽喉部，用拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，避免接触舌体及口腔黏膜，操作完毕后立即放入含保存液的采样管中。其他样本（如痰液、血液、粪便等）：参照相应标准或试剂盒说明书进行采集。5.3样本标记与运输采样管外标签应清晰注明受检者唯一标识（如姓名、编号）、采样日期和时间、采样地点、样本类型。样本应在规定条件下（如2-8℃或-20℃以下）尽快运输，避免反复冻融。运输过程中应使用符合生物安全要求的转运箱，防止样本泄露。运输时需附带样本交接单，注明样本信息、数量、运输条件等。5.4样本接收与处理实验室接收样本时，需核对样本数量、标识、状态（有无泄露、管盖是否旋紧、保存液是否足量）及运输条件是否符合要求。对不合格样本（如标识不清、严重泄露、疑似污染、超过保存时限等），应注明原因并拒收，同时及时与送样方沟通。接收合格的样本应及时编号登记，尽快处理；若需暂存，应按试剂说明书要求的条件保存，并记录保存温度和时间，避免长时间存放影响核酸稳定性。6.核酸检测操作流程6.1样本前处理根据样本类型和试剂要求，对样本进行必要的前处理，如离心（通常____rpm，离心5-10分钟）以沉淀杂质或浓缩样本。操作应在生物安全柜内进行，打开采样管时动作轻柔，避免气溶胶产生。6.2核酸提取严格按照选定的核酸提取试剂盒说明书进行操作，可采用自动化提取或手动提取方法。提取过程中，加样应准确无误，避免样本间交叉污染。提取产物应立即用于后续扩增反应，若需短期保存，应置于-20℃或以下，避免反复冻融。记录提取日期、时间及操作者。6.3PCR反应体系配制在扩增区的超净工作台或专用试剂配制区进行。根据试剂说明书，在冰上依次加入反应缓冲液、引物探针混合液、酶、RNase抑制剂（如为RNA病毒检测）及无核酸酶水，充分混匀，短暂离心。分装反应混合液至PCR反应管中，然后小心加入已提取的核酸模板（包括阳性对照、阴性对照和空白对照）。注意更换移液器吸头，避免交叉污染。盖紧PCR管盖，做好标记，短暂离心后放入PCR仪。6.4扩增反应按照试剂说明书设置PCR仪的循环参数（如逆转录温度和时间、预变性温度和时间、变性、退火、延伸的温度、时间及循环数）。启动扩增程序，运行期间避免擅自打开仪器盖。记录扩增开始和结束时间、仪器运行状态。6.5结果判读与分析扩增结束后，在产物分析区打开PCR仪，取出反应管。根据试剂说明书设定基线和阈值，由仪器自动生成Ct值。结果判定标准（示例，具体参照所用试剂说明书）：阳性：靶基因Ct值小于或等于临界值，且扩增曲线呈典型的S型。阴性：靶基因Ct值大于临界值，或无明显扩增曲线。无效：阴性对照出现扩增，或阳性对照未出现预期扩增，或空白对照出现非特异性扩增，提示实验可能存在污染或操作失误，需重新检测。对可疑结果（如Ct值接近临界值、扩增曲线异常），应进行重复检测，并结合样本采集情况、临床信息综合判断。7.质量控制7.1室内质量控制阴性对照：每批次实验应设置至少1份阴性对照（如无核酸酶水或已知阴性样本），监控污染。阳性对照：每批次实验应设置至少1份弱阳性对照（接近检测限）和1份强阳性对照，监控试剂有效性和反应体系。内源性对照（如人源RNaseP基因）**：用于监控样本采集质量、核酸提取效率及PCR抑制物的存在。所有质控品应与待测样本一同经历从核酸提取到扩增的全过程。定期绘制质控图（如Levey-Jennings图），对质控结果进行趋势分析。若出现失控，应立即停止报告结果，查找原因并采取纠正措施，验证有效后方可恢复检测。7.2室间质量评价积极参加国家或省级临床检验中心组织的室间质量评价活动。按要求接收、处理和检测EQA样本，独立出具结果并按时回报。对EQA回报结果进行分析，若出现不满意结果，应及时查找原因，制定并实施改进措施，并记录存档。7.3仪器与试剂质量控制新仪器安装或维修后，以及定期（如每半年或每年）需对PCR仪进行温度准确性、均一性、升降温速率等性能验证。移液器、离心机等计量器具应定期校准。每批次试剂在大规模使用前，应进行批间差验证。8.生物安全与防护8.1个人防护装备(PPE)根据操作风险等级选择适当的PPE，至少包括：实验服或隔离衣一次性乳胶或丁腈手套医用外科口罩或医用防护口罩护目镜或防护面屏（在可能产生气溶胶的操作时）PPE应在指定区域穿戴和脱卸，脱卸时避免污染自身，遵循正确的顺序。8.2操作安全禁止在实验区内饮食、饮水、吸烟、化妆或处理隐形眼镜。禁止将个人物品带入实验区。所有操作应在生物安全柜或适当的防护条件下进行，避免产生气溶胶。使用过的锐器（如针头、破碎玻璃）应立即放入专用锐器盒，严禁徒手处理。实验台面和设备表面在操作前后均需用75%乙醇或含氯消毒剂擦拭消毒。8.3应急预案实验室应制定生物安全事故应急预案，包括溢洒处理、职业暴露（如针刺伤、黏膜接触）等情况的处理流程和报告程序。定期组织演练，确保所有人员熟悉预案内容。9.废弃物处理实验过程中产生的所有废弃物均应视为医疗废物或感染性废物，按以下要求处理：感染性废物（如使用过的采样拭子、离心管、吸头、反应管等）：放入专用黄色医疗废物袋，双层包装，密封后标记“感染性废物”，由有资质的单位集中处置。锐器：放入防刺穿、防渗漏的专用锐器盒，装满3/4时及时更换。废弃试剂和污染液体：经适当消毒处理（如化学消毒或高压灭菌）后，方可倒入指定下水道或按固体废物处理。处理废弃物时必须穿戴PPE。10.实验记录与报告10.1实验记录所有实验操作均应及时、准确、完整、规范地记录于专用记录本或电子系统中，至少包括：实验日期、时间、操作者。样本信息（编号、类型、来源等）。试剂信息（名称、批号、有效期、生产厂家）。仪器设备信息（型号、运行状态）。详细的操作步骤及关键参数（如离心速度和时间、PCR循环条件）。质控结果（Ct值、扩增曲线描述）。样本检测结果（Ct值、判定结果）。任何异常情况、问题及处理措施。实验记录应清晰可辨，不得随意涂改，如需修改，应在原记录上划横线，旁注修改内容、日期及签名。记录应妥善保存，保存期限不少于规定年限。10.2结果报告检测报告应包含受检者基本信息、样本信息（采集时间、类型）、检测项目、检测方法、检测结果（定性：阳性/阴性/不确定；定量：具体数值及单位，如适用）、参考范围、报告日期、检测者和审核者签名、实验室名称及联系方式。对“不确定”结果，应注明原因，并建议重新采样检测或结合临床综合判断。报告应及时、准确地发送给送检单位或受检者。原始报告和发送记录应存档。11.结果解读与临床沟通11.1结果解读原则核酸检测结果阳性提示受检者可能感染了目标病原体，但需结合流行病学史、临床表现及其他实验室检查结果综合判断。结果阴性不能完全排除感染的可能，可能与样本采集不当、病毒载量低于检测限、感染早期或恢复期等因素有关。Ct值的大小在一定程度上反映病毒载量，但不同试剂、不同实验室间的Ct值无可比性，不应单纯依据Ct值判断疾病严重程度或传染性强弱。11.2临床沟通实验室应建立与临床科室的有效沟通机制。对于疑难、特殊或与临床不符的检测结果，应及时与临床医生联系，了解患者情况，共同分析原因，必要时提供进一步检测建议。12.