高三生物二轮复习课件基因工程PCR微专题

——PCR微专题基因工程二轮复习PCR概念和原理条件模板原料能量酶引物定义和作用选择设计原则应用检测目的基因添加酶切位点或启动子、终止子构建融合基因定点突变相关计算含Mg2+的缓冲液过程产物鉴定PCR的结果计算种类和功能重叠延伸PCR定点突变-重叠延伸PCR/大引物PCR技术反向PCR不对称PCR巢式PCR实时荧光定量PCR反转录PCR（PT-PCR）DNA半保留复制引物(1)PCR技术概念、原理、

条件、产物鉴定PCR由穆里斯等人于1985年发明，1993年获得诺贝尔化学奖知识盘查激活DNA聚合酶(2)PCR技术的过程提醒可通过引物控制PCR扩增的基因片段，并在基因两侧引入限制酶识别序列。复性72℃TaqDNA聚合酶知识盘查●生物体内DNA复制与PCR技术的比较知识盘查引物的选择和设计重点突破01重点突破教材中的引物重点突破例1（江苏卷节选）请回答基因工程方面的有关问题；PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式______(能或不能）正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为________________________________________________________________。考点一：引物的作用引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸规范表达不能DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能将单个脱氧核苷酸连续结合至双链DNA片段的引物链上。例2为使甘蓝具有抗除草剂能力,科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株,获得抗草甘膦转基因甘蓝。

草甘膦抗性基因一条链的两端序列如下,采用PCR技术获取和扩增草甘膦抗性基因,应选用的引物组合为(

)A.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'B.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3'C.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-ATCATCCAAG-3'D.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3'A引物与模板链碱基互补；-OH为3’端，磷酸基团端为5’端引物的5’端与模板链的3’端结合；子链从引物的5’端→3’端考点二：引物的设计原则3’端3’端考点二：引物的设计原则例2：（2011年江苏卷）请回答基因工程方面的有关问题∶设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的2组引物如图，都不合理，请分别说明理由。①第1组：__________________________________________________;②第2组：__________________________________________________。

引物Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效

引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效

二聚体（两个引物间互补）发夹结构（引物自身互补）例3（2023广东三模）

研究者进行PCR扩增前根据

epEGF基因设计了一对引物,据图分析,该对引物序列的设计要求是_____________________________________，____________________________________________________________________和_________________________________________________________（答3点）。

引物之间以及引物自身不能发生碱基互补配对为了防止出现非特异性扩增片段,其长度不能过短,通常为20-30个核苷酸序列在两个引物的5'端分别添加上限制酶BamHI和XhoⅠ的识别序列考点二：引物的设计原则规范表达（2021·湖北卷）某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示,除了目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是（

）A.增加模板DNA的量B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间D.提高复性的温度D考点二：引物的设计原则（1）两种引物方向是对向的，目的基因在中间；引物能与DNA模板通过碱基互补配对结合;（2）引物长度通常为20~30个核苷酸，可防止随机结合。（3）某一引物不能自身折叠出现局部碱基互补配对;（4）两种引物之间不能发生碱基互补配对;（5）常需要在两种引物的5'端添加不同的限制酶的识别序列或启动子(或终止子)序列。注意：复性温度需适宜发夹结构（引物自身互补）二聚体（两个引物间互补）总结：考点二：引物的设计原则长度适中自身不补相互不补5‘修饰模板链的互补链就是引物序列5'端修饰方法作用加入限制酶酶切位点可以利用限制酶切割产生末端,方便基因重组放射性同位素、生物素、荧光素等标记物方便扩增产物的检测增添、缺失或替换部分碱基可以产生定点突变解题思路引物的选择三步走1、明确模板链方向2、明确引物结合位置与方向3、带入验证，排除干扰来道题目（2025，四川，19）（1）用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增IrcA-IrcF目的基因时，应选用_______引物。F2和F4来道题目（2025,湖南，21）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题:(1)制备特定抗原①为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物______对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为_____bp。P1和P3782(1)若扩增目的基因序列,则应选择图1中的引物乙、丙;(2)若要检验目的基因是否以正确方向插入质粒相应位点,应设计一个引物与目的基因外部序列(即质粒序列)碱基互补配对,另一个引物与目的基因内部序列碱基互补配对,如图2所示的引物1、2。答题技巧PCR中的数量关系02PCR的数量关系思考1：图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？比例是多少？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’第3轮；1/4。PCR的数量关系思考2：完成下表PCR中的数量关系小结复制次数123nDNA分子数含引物的DNA分子数共消耗引物的对数含某种特定引物的DNA分子数同时含两种引物的DNA分子数脱氧核苷酸链等长的（目的基因）DNA分子数DNA分子的链数非目标DNA数目目标DNA数目循环次数1234567246810121400282252114非目标DNA数目目标DNA数目循环次数1202403624885102261252714114n2n2n-2nPCR的数量关系思考2：完成下表复制次数123nDNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n共消耗引物的对数1=21-13=22-17=23-12n-1含某种特定引物的DNA分子数1=21-13=22-17=23-12n-1同时含两种引物的DNA分子数0=21-22=22-26=23-22n-2脱氧核苷酸链等长的（目的基因）DNA分子数0=21-20=22-42=23-62n-2nDNA分子的链数48162n+1PCR中的数量关系汇总循环次数123nDNA分子种类2455共消耗引物的DNA分子数2＝22－26＝23－214＝24－22n＋1－2长链-中长链DNA2222中长链-短链DNA0242(n-1)短链-短链DNA（目的基因）0022n-2n含模板链的DNA分子数2222第n次复制需要的引物数2482nPCR中的数量关系汇总[(2n-1)×2]-[(2n-1-1)×2]循环次数123n长单链数2222中单链数2462n短单链数282n+1－2-2n第3轮循环获得了纯目的基因整个体系有3种链整个体系有5种DNA分子PCR中的数量关系汇总例题：玉米是重要的粮食作物,其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白,由P基因编码;科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米,回答下列问题。(1)利用PCR技术以图中的DNA片段为模板扩增P基因,需要的引物有

(从A、B、C、D中选择)。上述过程中,至少经过

次循环后会产生双链等长的P基因片段,循环4次共需要的引物数为

。

30B、C

3

变式训练1：目的基因在DNA分子中间(2)从理论上推测,第四轮循环产物中含有两种引物的DNA片段所占的比例为

。经4轮循环后产物中有

种不同种类的DNA分子,其中只含等长目的基因的DNA分子有

个。

7/8

85

每一条子链都以引物为起点进行延伸,故新合成的子链数=消耗的引物数。合成DNA的数量:________

(a:初始数量;n:循环的次数)合成完整目的基因的数量:_______________PCR产物的鉴定：常采用__________________来鉴定a×2n

a×(2n-2n)琼脂糖凝胶电泳PCR体系需要两种引物,且两种引物同时使用,故消耗某种特定引物的数量=消耗的引物数/2。总结：（PCR应用：利用引物添加酶切位点）

例1：引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的()D解析：DNA聚合酶能特异性地复制处于两个引物之间的的DNA序列。引物中的X经过扩增最终成为目标序列的一部分。题型2：目的基因在DNA分子某端53535353第一轮第二轮题型2：目的基因在DNA分子某端总结：PCR技术获取目的基因（1）目的基因在DNA分子中间：

至少要经过3次循环才能从DNA分子中分离出目的基因（2）目的基因在DNA分子某端：

至少要经过2次循环才能从DNA分子中分离出目的基因考点四：PCR中的计算PCR的应用031、利用引物添加酶切位点2、重叠延伸PCR（融合PCR）3、定点突变-重叠延伸PCR/大引物PCR技术4、反向PCR5、不对称PCR6、巣式PCR7、实时荧光定量PCR技术8、RT-PCR技术031、应用-利用引物添加酶切位点53535353第一轮第二轮1、应用-利用引物添加酶切位点

例1：引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的()D解析：DNA聚合酶能特异性地复制处于两个引物之间的的DNA序列。引物中的X经过扩增最终成为目标序列的一部分。1、应用-利用引物添加酶切位点

例2：①为保证双功能醇醛脱氢酶基因（Adh）能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和引物2，其中引物1的序列为5`—

—3`。GGTACCGTACCTTTGT解析:左边加KpnI识别序列，右边加XbaI识别序列2、重叠延伸PCR（融合PCR）(1）原理：拼接两个或多个DNA序列，可以使用末端可以连接的特殊引物。设计4种引物：引物1和引物4为普通引物。引物2的3′端含有基因M的序列，5′端含有基因N的序列；引物3的3′端含有基因N的序列，5′端含有基因M的序列；引物2和引物3完全互补配对。(2)用途：可以将几段较小的DNA按照顺序连接形成较大的DNA，且不需要限制酶。(3)特点：不需要限制性内切核酸酶和连接酶的处理，用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变，操作非常简便，利用这一技术很快获得利用限制性内切核酸酶消化的方法难以达到的产物，可用于大片段基因的人工合成，且成功率非常高。2、重叠延伸PCR（融合PCR）例1：某科研小组采用PCR技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是（

）A.利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA双链B.不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增C.dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链D.杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物C两基因混合后能得到两种类型的杂交链，另一种类型的杂交链杂交区域为5’端，两侧为3’端

xxxPCR1PCR2链Ｂ基因Ａ基因Ｂ互补P1P2P4P33’--5’-3’5’-5’--5’5’--5’获得融合基因链Ａ5’-3’--3’5’--3’-5’3’--5’5’-3’--3’-5’5’--3’3’--5’①②③④⑤⑥⑦⑧第一种第二种第三种3’--5’5’--3’第四种5’-3’--3’-5’5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’不能PCR延伸可以PCR延伸分别获得PCR1和PCR2将PCR1和PCR2混合，不加引物❆注意❆经过PCR1和PCR2获得的两种DNA混合，经高温变性再低温复性后，只有一种情况可以进行PCR延伸。2、重叠延伸PCR（融合PCR）例2：(2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：

CD3′5′3′5′2、重叠延伸PCR（融合PCR）3、定点突变（1）概念：将某基因中的一个或几个特定的碱基对替换、增加或删除，导致基因中的部分碱基序列发生改变，实现基因的定点突变。

(1)图1所示重叠延伸PCR中，第1对引物选择突变引物FP2和通用引物RP2，要想获得PCR产物甲至少需要

次循环。在第1对引物组成的反应系统和第2对引物组成的反应系统中各进行一次复制，共产生

种DNA分子。此过程不能将2对引物共置于同一反应系统中，原因是

。(2)图1所示部分DNA分子不能延伸，原因是

。重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术，操作过程如图1，可通过测序检验定点突变是否成功。两

3

突变引物FP2和突变引物RP1存在碱基互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用DNA聚合酶只能催化DNA单链从5’到3’的延伸3、定点突变-重叠延伸PCR3、定点突变-大引物PCR技术②大引物PCR技术：需要用到三种引物进行两次PCR，这三种引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一次PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二次PCR利用第一次扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。该技术的流程如图所示：

(1)若突变碱基位于目的基因某一侧，可以采用如图1所示的“大引物PCR技术”，在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物：引物A：5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3'（下划线字母为突变碱基）引物B：5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'（下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列）引物C：5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'（下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列）则PCR1中使用的引物有

，PCR2中使用的引物有

和图中大引物的

（选填“①”或“②”）链。引物A和引物C引物B

②3、定点突变-重叠延伸PCR例题4、反向PCR4、反向PCR情境素材：反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。(1)要扩增未知序列，应选择哪两种引物？

引物1和引物4。4、反向PCR情境素材：反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。(2)上述PCR产物是环状DNA分子还是链状DNA分子？

链状DNA分子。(3)上述PCR过程中使用了哪些酶？

限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶。5、不对称PCR原理：不对称PCR的基本原理是采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果产生大量的单链DNA。应用：产生单链DNA，用于做测序模板、杂交探针等。5、不对称PCR例1．不对称PCR是用一对含量不相等的引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的技术。这两种引物一少一多，比例一般为1：50~1：100，分别称为限制性引物与非限制性引物。另外，限制性引物的退火温度与非限制性引物的退火温度不同，在最初的10~15个循环中使用较低的退火温度，随后将退火温度提高，从而产生大量单链ssDNA。下列说法错误的是（

）A．最初的10~15个循环中DNA分子数将会以指数形式增长B．非限制性引物的退火温度应低于限制性引物的退火温度C．限制性与非限制性引物的比例和退火温度都可影响ssDNA的产量D．所得ssDNA可通过电泳分离、回收，然后作为DNA探针使用B高于6、巣式PCR原理：首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。6、巣式PCR例:1：为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR进行了改良，发明了巢式PCR，其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15～30次循环)，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部，经过15～30次循环，获得第二轮扩增片段(即目的基因)，最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如下图所示。下列叙述错误的是(

)A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段B．使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物C．若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低D．与巢式PCR相比，普通PCR特异性更强，错误率更高D巢式PCR获得产物特异性更强7、实时荧光定量PCR技术病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。TaqMan探针为一寡核苷酸序列，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。7、实时荧光定量PCR技术在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到。例题：荧光定量PCR技术是在常规PCR的基础上，加入与模板DNA某条链互补的荧光探针（一类两端经过特殊基团修饰的单链DNA片段），当子链延伸至探针处时DNA聚合酶会水解掉探针一端并生成荧光分子，使荧光监测系统接收到荧光信号，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，原理如图所示。下列有关叙述正确的是（）A.该项技术可用来直接检测样本中新冠病毒核酸的含量B.1个双链DNA分子经过3轮循环一共会生成8个荧光分子C.1个双链DNA分子经过5轮循环一共需要消耗15对引物D.该PCR技术中DNA聚合酶既催化形成磷酸二酯键，又催化断裂磷酸二酯键D7、实时荧光定量PCR技术

RNA病毒，PCR无法直接检测

8、RT-PCR技术

（3）应用：检测目的基因的转录水平（表达）。8、RT-PCR技术例1.临床上常采用RT-PCR技术(以mRNA为模板逆转录为cDNA，再进行PCR扩增)对受试者的咽拭子取样后进行新冠病毒核酸检测。以下是某医院发热门诊医生采用该项技术对受试者进行新冠病毒核酸检测的相关操作步骤：①从受试者组织样本中提取mRNA；②分析PCR扩增结果；③利用PCR扩增cDNA片段；④采集受试者组织样本；⑤用mRNA逆转录得到cDNA。下列说法错误的是(

)A．RT-PCR技术的正确操作顺序应是④①⑤③②B．RT-PCR操作过程中，所需的酶有逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶C．RT-PCR的产物经过BamHⅠ、EcoRⅠ双限制酶处理以后，再与经过同样双酶处理的小双节病毒(PBV)载体连接，该操作属于基因工程操作步骤中的构建基因表达载体D．利用RT-PCR技术获取的目的基因不能在物种间进行交流DRT-PCR技术获取的目的基因通常无内含子等非编码序列，利于基因在特种间的交流感谢观看20261PCR的概念全称：原理：操作环境：目的：优点：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年发明，1993年获得诺贝尔化学奖PCR扩增仪大量基因模拟细胞内DNA的复制过程，在体外快速扩增特定的DNA片段。PCR某基因体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分

反应还需要其它条件：解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA（目的基因）模板4种脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA）如缓冲液（一般添加Mg2+）和控温设备dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）打开DNA双链，破坏氢键提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸功能：①提供原料；②提供能量2PCR的进行需要的条件激活Taq酶PCR技术体内DNA复制相同点原则碱基互补配对条件DNA母链作为模板、引物(体内引物RNA、体外引物DNA)、4种脱