鬼针草醇提物对大肠杆菌抑菌机理的研究

目录TOC\o"1-3"\u1.材料与方法 51.1试验材料 51.1.1试验药材 51.1.2试验菌株 51.1.3试剂及仪器 51.2试验方法 51.2.1鬼针草醇提物的制备 51.2.2培养基的制备 61.2.3大肠杆菌悬液制备 61.2.4最低抑菌浓度（MIC）测定 61.2.5鬼针草醇提物对大肠杆菌生长曲线抑制作用的测定 61.2.6鬼针草醇提物对大肠杆菌细胞蛋白的SDS电泳分析 61.2.7鬼针草醇提物对大肠杆菌AKP的影响 61.2.8鬼针草醇提物对大肠杆菌细胞膜完整性的影响 72.试验结果 72.1不同浓度的鬼针草醇提物对大肠杆菌的MIC 72.2鬼针草醇提物对大肠杆菌生长曲线的影响 72.3鬼针草醇提物对大肠杆菌蛋白质的影响 82.4鬼针草醇提物对大肠杆菌AKP的影响 92.5鬼针草醇提物对大肠杆菌细胞膜完整性的影响 92.6扫描电镜结果图 103.讨论 114.结果 12致谢 12参考文献 12

鬼针草醇提物对大肠杆菌抑菌机理研究StudyontheAntibacterialMechanismofEthanolExtractfromBidenspilosaAgainstEscherichiacoli【摘要】探究鬼针草醇提物对鸡源性大肠杆菌的抑菌机理。制备鬼针草醇提物，通过最低抑菌浓度（MIC）测定、生长曲线研究、SDS电泳、碱性磷酸酶（AKP）影响试验及细胞膜完整性破坏试验对其展开研究。将鬼针草进行适当处理后，放入90%浓度的乙醇溶液中进行浸泡、浓缩后对大肠杆菌的抑菌效果最佳；MIC和1/2MIC浓度的醇提取物均可以抑制大肠杆菌生长，其中MIC浓度抑制作用更显著。鬼针草醇提物会干扰大肠杆菌蛋白质合成，使蛋白质条带变淡甚至消失；还会破坏细胞壁和细胞膜完整性，导致细胞外AKP含量升高(P<0.01)。鬼针草醇提物可以通过多种途径抑制大肠杆菌生长。【Abstract】ToexploretheantibacterialmechanismofPhalloidesalcoholextractonchicken-derivedEscherichiacoli.ThealcoholextractofPhalloidesofficinaliswaspreparedandstudiedbythedeterminationofminimuminhibitoryconcentration(MIC),growthcurvestudy,SDSelectrophoresis,alkalinephosphatase(AKP)effecttestandcellmembraneintegritydestructiontest.Afterpropertreatment,itwassoakedin90%concentrationethanolsolutionandconcentratedtohavethebestantibacterialeffectonE.coli.BothMICand1/2MICconcentrationsofalcoholextractscouldinhibitthegrowthofE.coli,andtheinhibitioneffectofMICconcentrationwasmoresignificant.PhalloidesealcoholextractcaninterferewithE.coliproteinsynthesis,makingproteinbandsfadeorevendisappear;Italsodisruptstheintegrityofthecellwallandcellmembrane,resultinginanincreaseinthecontentofextracellularAKP(P<0.01).PhalloidosaalcoholextractcaninhibitE.coligrowththroughavarietyofpathways.【关键词】鬼针草醇提物；大肠杆菌；抑菌机理【Keywords】Bidenspilosaethanolextract,Escherichiacoli,antibacterialmechanism我国目前对禽大肠杆菌的防控还不全面，在一些地方好会频繁出现禽感染大肠杆菌的情况，患大肠杆菌的病鸡常表现精神不振，缩头，呆立，不愿走动，食欲减少或不食，嗜饮，嗉囊积液或积食，羽毛松乱无光泽，冠发紫，拉绿白色稀粪，泄殖腔周围的羽毛被粪便污染，症状出现后2至5天死亡REF_Ref1981\r\h[1]。对于养殖业的危害越来越严重，有研究发现海安某鸡场鸡群大量死亡，经鉴定为大肠杆菌、沙门氏菌的混合感染REF_Ref19715\r\h[2]；还有研究发现，从肝周炎与心包炎样本里分离出的大肠杆菌，在血清型及耐药性层面均展现出显著的多样性特征REF_Ref19920\r\h[3]；成年动物则可能发生乳房炎、子宫炎或呼吸道感染等，造成繁殖率下降和产奶量降低。此外大肠杆菌还会通过粪便污染环境，甚至通过禽蛋、乳制品等途径危害人类健康，对养殖业经济效益和公共卫生安全构成双重危害。鬼针草为菊科植物鬼针草的全草，又称鬼钗草、鬼黄花、山东老鸦草、婆婆针、鬼蒺藜等REF_Ref2083\r\h[4]；其味苦，性平，无毒，主治腹泻、急性败血症、肝周炎等。在药性上，鬼针草“苦、平、无毒”，显示出其温和而广泛的治疗潜力REF_Ref2207\r\h[5]。其作为一种常见野生中草药，在农村路边、荒地十分常见，尤其值得注意的是，在广东等低海拔地区，鬼针草因其强大的繁殖能力而大面积分布，甚至被列为该地区的入侵植物物种REF_Ref2236\r\h[6]，但是其在养殖业中有一定的应用价值，如：鬼针草可以调节肠道菌群，改善鸡的腹泻症状，减少鸡群因为肠道问题导致的生长迟缓和死亡率升高；鬼针草还富含维生素、矿物质及抗氧化物质，可以增强家禽的免疫力，改善消化吸收功能，加快肉鸡的增重速度；以及鬼针草含有活性成分，可以驱除家禽体内寄生虫，并抑制细菌感染，减少寄生虫病和细菌疾病的发生等。在畜禽养殖领域，鸡源性大肠杆菌078型标准菌株引发的感染性疾病一直是困扰行业发展的重要难题，这类革兰氏阴性菌不仅容易引发禽类肠道炎症、败血症等病症，还会导致养殖率下降、食品安全风险增加。从资源利用和绿色养殖的角度出发，鬼针草具有极高的开发价值，鬼针草在我国分布广泛，尤其在广东等气候温暖湿润的地区生长茂盛，资源极为丰富REF_Ref2266\r\h[7]，同时其采集和加工成本相对较低作为饲料添加剂应用于畜禽养殖，不仅能够有效抑制大肠杆菌等有害菌的生长，还能显著减少化学合成抗菌药物的使用，降低药物残留风险，符合当前绿色养殖、健康养殖的发展趋势；从科研探索的角度而言，尽管目前已有众多天然植物被证实具有抗菌活性，但对于其具体抗菌作用机制的研究仍存在很多空白，鬼针草成分复杂，多种活性成分协同发挥抗菌作用的机制尚不明确，所以揭示鬼针草对大肠杆菌的抑制机理，不仅能够丰富天然植物抗菌理论体系，还能为其他天然抗菌药物的研发提供重要的理论参考和技术支持；此外，研究鬼针草醇提物的抑菌机理还具有更为深远的社会与生态意义，在当今社会，绿色环保和可持续发展理念已深入人心，化学合成抗菌剂虽然在疾病防治方面具有见效快的优点，但其在环境中的残留问题不容忽视，这些残留的抗菌剂不仅会对土壤、水体等生态环境造成污染，还可能通过食物链传递，对人类健康产生潜在威胁。与之形成鲜明对比的是，天然植物提取物来源广泛，大部分成分能够在自然环境中迅速降解，不会对生态环境造成长期危害。如果鬼针草提取物能够成功开发为高效、安全的抗菌药物或饲料添加剂，不仅能够有效解决大肠杆菌感染带来的实际问题，还将为人类健康保障和生态环境保护开辟新的途径，带来不可估量的经济、社会和生态效益。材料与方法1.1试验材料1.1.1试验药材本试验中用的鬼针草药材是在康佰家药店中购买。1.1.2试验菌株本试验选用的菌株为鸡源性大肠杆菌078型标准菌株。1.1.3试剂及仪器试剂仪器无水乙醇电子天平营养琼脂培养基高速冷冻离心机碱性磷酸酶检测试剂盒（AKP）恒温培养箱快速银染试剂盒无菌超净工作台LB肉汤培养基旋转蒸发仪麦康凯培养基紫外分光光度计超微量分光光度计1.2试验方法1.2.1鬼针草醇提物的制备称取鬼针草40g，置于烧杯中，用无水乙醇置于室温下浸泡48h后，将烧杯中液体用8层纱布滤过倒入崭新的烧杯中，再往第一个烧杯中再次加入无水乙醇浸泡48h，倒入第二个烧杯中与第一次液体混合后，用旋转蒸发器将滤液浓缩，使其终浓度为2g/mL，冷却后保存在4℃冰箱中备用。1.2.2培养基的制备称取试剂的干燥粉末置于锥形瓶中，依照说明书配置成相应的液体培养基，将以上液体培养基全部置于121℃高压灭菌2h。等到锥形瓶中的液体稍微冷却后，在超净工作台中将灭菌完成后的培养基倒入无菌培养皿中，制作成固体培养基，放于4℃冰箱保存备用。1.2.3大肠杆菌悬液制备将大肠杆菌划线接种在营养琼脂培养基上，放置于37℃恒温培养24h，然后选取单个活菌菌落，接种于LB营养肉汤培养基中制备菌悬液，并将浓度调整为107CFU/mL，用于后面的各种实验。1.2.4最低抑菌浓度（MIC）测定在每支试管内先加入1mL的TSB液体，在1至7支试管中加入不同浓度的鬼针草醇提物液体，1至8支试管加入50μl的菌液，每个浓度设置3个重复，以不加鬼针草醇提物的作为阴性对照，以加入硫酸庆大霉素的作为阳性对照，将配置好的试管放置于37℃的恒温培养箱中培养24h后，取出以肉眼观察试管中浑浊程度，浑浊程度最少的对应的浓度为鬼针草醇提物对该菌的MIC。1.2.5鬼针草醇提物对大肠杆菌生长曲线抑制作用的测定将培养至对数期的大肠杆菌悬液用TSB培养基稀释成每毫升含菌体107CFU/mL，加入鬼针草醇提物分别至MIC浓度和1/2MIC浓度，放于37℃、200rpm恒温培养震荡器中培养，用不加任何药物的营养肉汤培养基作为对照组，在0、2、4、6、8、10、12h时分别取出2mL样品，使用分光光度计测定菌体浓度OD600的值，由此分析鬼针草醇提物对大肠杆菌菌株生长的影响。1.2.6鬼针草醇提物对大肠杆菌细胞蛋白的SDS电泳分析首先将浓度为107CFU/mL的大肠杆菌细菌悬液放置在37℃摇床上培养12h，然后分别向菌悬液中加入不同浓度MIC和1/2MIC，以未添加鬼针草醇提物的样本作为对照组，分别在培养3、6、9h时各取样品2mL，将各样品以4000rpm离心10分钟，取上清液稀释至蛋白浓度20μg/mL后再次4000rpm离心10分钟，之后用80μlPBS缓冲液沉淀，加入20μl5×SDS上样缓冲液，充分混匀后沸水浴处理10分钟。最终取20μl样本进行SDS电泳，并使用银染试剂盒对凝胶进行染色。1.2.7鬼针草醇提物对大肠杆菌AKP的影响首先将培养至对数期的大肠杆菌的菌液用TSB培养基将菌液稀释至107CFU/mL，后取大肠杆菌菌液5μl与鬼针草醇提物溶液混合，使药物浓度至MIC和1/2MIC，将配好的液体放置于37℃、1500rpm/min条件下培养，分别在培养0、0.5、1、2、3、4、5、6h时取液体2mL于3500rpm/min离心10分钟后，取上清液按照AKP试剂盒测定。1.2.8鬼针草醇提物对大肠杆菌细胞膜完整性的影响将大肠杆菌的细菌悬液以3000rpm/min离心10分钟，并且使用PBS（pH=7.2）洗涤沉淀两次，然后再以3000rpm/min离心5分钟后，得到沉淀，加入无菌生理盐水代替LB培养基，实验组加入浓度为0.125g/mL和0.0625g/mL的鬼针草醇提物药液，对照组不加入药液，在37℃旋转振荡器中继续培养后，在2、4、6、8、10、12h时取样品2mL细菌悬浮液，通过以6000rpm离心5分钟后获得上清液，OD260纳米用紫外可见分光光度计测量，以指示细菌悬浮液中的核酸含量。2.试验结果2.1不同浓度的鬼针草醇提物对大肠杆菌的MIC表1鬼针草醇提物对大肠杆菌MIC的检测浓度（g/mL）1.00.50.250.1250.0625对照鬼针草醇提物90%++鬼针草醇提物70%--++++鬼针草醇提物50%++++++鬼针草醇提物20%++++++注：+表示有菌生长，-表示无菌生长。由表1可知，不同浓度的鬼针草醇提物对大肠杆菌有不同程度的抑菌作用，在鬼针草醇提物相同浓度，对大肠杆菌的抑菌效果随着纯度的降低而减弱，在培养基上表现出来的就是灰白色圆形菌落数越来越多，并且单个菌落的面积越来越大，鬼针草醇提物70%、鬼针草醇提物50%和鬼针草醇提物20%对大肠杆菌的抑菌作用效果较差或者无抑菌作用；鬼针草醇提物90%对大肠杆菌的抑菌效果最佳，所以在后面试验中选取鬼针草醇提物90%作为试验对象，探讨鬼针草醇提物对大肠杆菌抑菌机理的研究。2.2鬼针草醇提物对大肠杆菌生长曲线的影响为了深入研究鬼针草醇提物对大肠杆菌的抗菌效果，本试验争对不同浓度下大肠杆菌的生长曲线进行了分析，由图1可知，无论是MIC还是1/2MIC的浓度，鬼针草醇提物均对大肠杆菌的生长表现出了抑制作用；与对照组相比试验组的生长曲线均有所降低，并且MIC浓度的鬼针草醇提物抑制作用更加显著。在两种浓度的鬼针草醇提物的影响下，大肠杆菌的生长曲线均在前4h内上升较快，这可能和醇提取物前期对大肠杆菌的适应过程有关，在之后生长曲线趋于平稳，与对照组相比较生长速率还是有明显减缓，综上所述，鬼针草醇提物可以抑制大肠杆菌的生长，并且具有降低大肠杆菌菌体分裂，延缓大肠杆菌生长的作用。图1鬼针草醇提物对大肠杆菌生长曲线的影响2.3鬼针草醇提物对大肠杆菌蛋白质的影响在图2中展示出了不同组别在不同的时间点大肠杆菌蛋白质表达的不同，其中图中明显的展示出对照组均呈现出清晰且丰富的蛋白质条带，这一现象有力的表现出了在正常培育条件下大肠杆菌的蛋白质合成与表达过程稳定且活跃，为后面的对比分析提供了坚实的基准。相比较之下，图中的MIC组和1/2MIC组在加入特定的物质和处理后，这两个组的蛋白质条带随着时间的推移逐渐呈现出变淡甚至消失的趋势，这一显著变化提示我们，这些蛋白质的合成过程受到了明显的干扰和抑制。深入分析这一变化，我们可以推测，由于特定物质或者处理可能通过干扰大肠杆菌正常的代谢过程，进一步影响了蛋白质的合成和表达，这种干扰可能导致了大肠杆菌内部代谢途径的紊乱，从而使得蛋白质合成所需要的原料、能量或酶等关键因素供应不足，最终导致蛋白质产量显著下降这一变化。图2鬼针草醇提物对大肠杆菌蛋白质的影响注：1-3：分别为对照组、1/2最小抑菌浓度组、最小抑菌浓度组的3小时；4-6：分别为对照组、1/2最小抑菌浓度组、最小抑菌浓度组的6小时：7-9：分别为对照组、1/2最小抑菌浓度组、最小抑菌浓度组的9小时。2.4鬼针草醇提物对大肠杆菌AKP的影响通过检测细胞外碱性磷酸酶（AKP）的水平试验可以从中反应出细胞壁的通透性，从图3中可以看出对照组的AKP水平稳定而且不受外界各种因素的影响，在加入药液之后，实验组的上清液中的AKP含量显著高于对照组上清液中的AKP（P<0.01）；在1/2MIC组中，通过图表可以得出AKP的表达量在1至4小时内呈现出下降的趋势；在图3中还可以看出MIC组的AKP含量始终高于1/2MIC组，并且随着药物浓度的增加以及作用时间的延长而表现持续升高的趋势，这一变化趋势直观地反映出细胞壁的损伤程度在不断加剧，其完整性遭受破坏的程度逐渐加深。综合上述试验结果可以为深入理解鬼针草醇提物对大肠杆菌的抗菌作用机制提供了重要的试验依据和研究线索，对后面的探究研究有着重要的理论指导意义。图3鬼针草醇提物对大肠杆菌AKP的影响注：*与对照组比较差异有统计学意义（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.001）2.5鬼针草醇提物对大肠杆菌细胞膜完整性的影响根据图4所显示，在不加任何其他物质的对照组中，随着时间的增加对照组的吸光度呈现先上升在6小时后呈现逐渐下降趋势；在MIC组和1/2MIC组中，吸光度也是随着时间的增加先上升在6小时后呈现逐渐下降的趋势；而在MIC组和1/2MIC组两组对比中，根据图表信息我们可以看出，浓度高度一组其吸光度也相对较高。由此我们可以得到，在本试验体系中，在相同时间变化的趋势下，物质浓度与吸光度存在着正相相关关系，即浓度越高，吸光度越高。图4鬼针草醇提物对大肠杆菌细胞膜完整性的影响2.6扫描电镜结果图根据图5所示，通过扫描电镜观察鬼针草醇提物对大肠杆菌细胞膜的影响。对照组中大肠杆菌外形呈现典型形态特征：表面平滑、结构完整、呈现棒状短杆形，无明显褶皱现象；1/2MIC浓度组中大肠杆菌开始出现轻微的褶皱和破损现象；而MIC浓度组和2MIC浓度的图片中，随着浓度的升高大肠杆菌菌体形态遭到破坏，表现为细胞出现大量褶皱、膜结构破裂，导致大肠杆菌形态发生显著改变。这些结果表明鬼针草醇提物的使用引起了大肠杆菌细胞膜的破坏，从而发挥抗菌作用。（a（a）（b（b）（c（c）（d（d）图5鬼针草醇提物不同浓度下大肠杆菌的电镜扫描图注：（a）对照组（b）1/2MIC（c）MIC（d）2MIC3.讨论在畜禽养殖方面上，大肠杆菌对养殖业的危害是很大的，所以本试验针对的是鬼针草醇提物对鸡源性大肠杆菌078型标准菌株的抑菌机理展开的研究，成果具有不一样的意义，为兽医临床治疗提供了新的方向和思路。通过试验成果显示，鬼针草醇提物抑菌效果显著，90%醇提取物浓度效果最佳，其中MIC和1/2MIC浓度均可以抑制大肠杆菌的生长，且MIC浓度抑制作用更好，这为解决大肠杆菌感染问题提供了新的方法，同时这一结果对兽医临床意义重大，在以前的养殖业中往往使用化学抗菌剂，虽然化学抗菌剂见效快，但是药物残留和环境污染问题严重，而鬼针草醇提物源自天然植物，其成本低、容易获得，还符合绿色养殖的趋势，有希望成为理想替代品。例如有试验将鬼针草作为饲料添加物喂给鸡群，喂有鬼针草添加过的饲料的鸡在感染鸡球虫后体重流失、死亡率、卵巢排放及血痢程度相较于阳性对照组均有明显的改善，粘膜完整性及肠道上皮结构的受损程度也较为轻微REF_Ref2207\r\h[5]。在实际兽医临床应用中，鬼针草醇提物可以添加到畜禽饲料或者饮水中，用来预防和治疗大肠杆菌的感染，例如可以在鸡的养殖过程中，可以减少大肠杆菌所引发的急性败血症、肝周炎等疾病，从而降低发病率和死亡率，而后提高养殖的经济效益。然而，鬼针草醇提物在畜禽养殖应用中仍然面临很多挑战，目前试验仅针对鸡源性大肠杆菌078型标准菌株，后续可以扩大菌株的种类和动物模型研究范围，探究对其他大肠杆菌菌株以及不同畜禽的抑菌效果，评估其对不同畜禽的适用性，此外，明确最佳使用剂量和方式至关重要，剂量过低可能无法达到理想的治疗效果，剂量过高则可能产生毒副作用或造成资源浪费，长期使用的安全性和稳定性需要进行进一步研究。所以对于鬼针草醇提物在畜禽养殖业的应用需要通过不断探索和完善，期望将其开发成安全、高效的抗菌药物或饲料添加剂，推动绿色养殖发展，保障畜禽健康和公共卫生安全，从而推动该药在兽医临床上的广泛应用，助力绿色养殖的发展。4.结果综上所述，鬼针草醇提物可以干扰大肠杆菌蛋白质的合成；还会破坏细胞壁和细胞膜的完整性，导致细胞外AKP含量升高，从而抑制大肠杆菌生长。鬼针草醇提物应用潜力高，其有望代替化学抗菌剂，虽然其可添加到畜禽饲料或饮水中预防大肠杆菌干扰，但是目前仅针对特定菌株，后续需扩大研究范围，提升其应用价值。参考文献王海梅.鸡的常见细菌性疾病防控[J].山东畜牧兽医,2017,38(07):25-26.王秋生.一例禽白血病与大肠杆菌、沙门氏菌混合感染诊断[J].畜牧兽医科学(电子版),2020,(17):11-13.崔珂玮,柯航,李哲,等.重组禽β-防御素-6、9抗禽致病性大肠杆菌感染的研究[J].微生物学通报,1-13.王少杰,邱深本,康健