2专题22　基因工程讲解册

第5部分生物技术与工程专题22基因工程重难透析目录考点1重组DNA技术的基本工具考点2基因工程的基本操作程序及应用考点3蛋白质工程题型透析题型1限制酶的选择题型2

PCR引物设计和选择考点1重组DNA技术的基本工具重难透析“分子手术刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)来源主要是原核生物作用具体作用识别并切割双链DNA分子的特定核苷酸序列作用化学键磷酸二酯键作用结果限制酶切割DNA分子产生的末端

通常有两种形式(如图所示):

“分子缝合针”——DNA连接酶作用将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键分类E.coliDNA连接酶来自大肠杆菌,连接互补的黏性末端和平末端的DNA片段,但连接平末端NDA片段的频率远低于T4DNA连接酶T4DNA连接酶来自T4噬菌体,连接互补的黏性末端和平末端的DNA片段“分子运输车”——基因载体作用将目的基因导入受体细胞种类质粒(最常用)定义裸露的(不与组蛋白结合)、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核

DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子结构特点具有复制原点(在细胞中能够自我复制)、标记基因(便于重组DNA分子的筛选)、一个至多个限制酶切割位点(供目的基因插入)其他载体噬菌体、动植物病毒等知识拓展(1)同尾酶是指识别DNA分子中不同核苷酸序列,但能切割产生相同末端的限制酶,如图。由同尾酶产生的黏性末端,能够通过碱基互补配对彼此连接,可用于基因表达载体的构建。(2)限制酶不切割原核生物自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别

序列或识别序列已经被修饰。(3)天然的质粒一般不完全具备载体的条件,往往需要进行人工改造后才能用作基因工程的载体。错DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键形成,但DNA连接酶连接两个

DNA片段,DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有核酸片段3'端。小表达[2024全国甲,38(2)]质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点,限制酶的切割位点如图所

示。构建重组质粒时,与用酶a单酶切相比,用酶a和酶b双酶切的优点体现在__________

________________________________(答出两点即可)。自连,保证目的基因连接方向正确

避免载体考点2基因工程的基本操作程序及应用一、DNA的粗提取与鉴定实验原理粗提取(1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质;(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2mol/L的NaCl溶液鉴定DNA+二苯胺试剂

蓝色实验步骤

注意事项(1)过滤时应选用纱布而不是滤纸,如果用滤纸,可能会把DNA分子吸附在滤纸上。(2)沉淀时用等体积、预冷的体积分数为95%的酒精,主要是低能防

止DNA酶降解DNA。(3)粗提取的DNA中可能含有核蛋白、多糖等杂质小表达

(2023广东,11改编)DNA鉴定时,DNA溶液加入二苯胺试剂后_________(填

“会”或者“不会”)立即呈现蓝色,原因是____________________________________

________________________。浴加热,溶液才能呈现蓝色

将二苯胺试剂加入DNA溶液后,需要沸水不会

原理DNA半保留复制和DNA的热变性PCR的条件模板含有待扩增序列的基因组DNA或从mRNA反转录来的cDNA原料四种游离的脱氧核苷酸或脱氧三磷酸核苷(dNTP)引物一般为根据目的基因两端序列设计的能与之互补配对的短单链核酸片段(一般需要选择2种引物分别扩增两条模板链)酶耐高DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)缓冲液需含有Mg2+,以激活DNA聚合酶二、PCR(聚合酶链式反应)PCR的步骤和结果鉴定一般采用琼脂糖凝胶电泳技术鉴定PCR的产物错(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作

为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。(2)引物是一小段单链的DNA或RNA,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3'端,

使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。小表达(选必3P77改编)PCR技术操作中为什么需要用2种不同的引物?_________

________________________________________________________________________

_________________________。需碱基序列不同的2种引物

由两条反向平行的脱氧核苷酸链构成,PCR扩增时只能从各自模板链的3'端开始,故

DNA分子电泳的相关原理(1)电泳:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极某著名企业。(2)迁移速率:在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关,一般DNA分子越大,迁移速率越慢,距离加样孔越近。(3)电泳鉴定结果的观察:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来三、琼脂糖凝胶电泳电泳结果及初步分析电泳结果示意图(常规结果)

电泳结果及初步分析结果初步分析根据条带位置判断DNA分子大小(1)泳道1为Marker,由一些分子大小已知的DNA片段组成,可以作为电泳结果中的参考系,以反映出待测片段的分子大小。如泳道4中的DNA片段介于3000bp~5000bp。(2)当DNA构象相同、电泳条件基本一致时,相对分子质量大的DNA分子迁移速率较小,相对分子质量小的DNA分子迁移速率较大,故泳道3的片段①的相对分子质量>片段②的相对分子质量根据电泳条带判断限制酶酶切位点数量泳道2和泳道3为同一个质粒经不同限制酶处理得到的结果。泳道2只有1条条带,说明质粒含0或1个相应限制酶切割位点。泳道3含2条条带,说明质粒含2个相应限制酶切割位点。假设泳道2中DNA分子为4800bp,则泳道3中DNA分子的大小分别为3000bp(片段①)和1800bp(片段②)知识拓展(1)PCR扩增后电泳结果异常分析异常分析内容未出现扩增条带的可能原因模板DNA含有杂蛋白或TaqDNA聚合酶的抑制剂;TaqDNA聚合酶失活;引物出现质量问题;引物浓度不合适;Mg2+浓度过低;变性低;变性时间过短等出现非特异性扩增条带的可能原因模板DNA出现污染;TaqDNA聚合酶出现质量问题;引物特异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体;Mg2+浓度过高;复性时的低;PCR循环次数过多等(2)常见电泳种类:琼脂糖凝胶电泳——常用于鉴定核酸片段;聚丙烯酰胺凝胶电泳——

常用于蛋白质分析。四、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取目的基因用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因,主要是指编码蛋白质的基因(也可能是基因调控序列等)筛选合适的目的基因(1)对于未知序列要进行测序及蛋白质功能的鉴定;(2)利用序列数据库和序列比对工具等,筛选结构和功能已知的基因获得目的基因的途径(1)从中获取目的基因;(2)利用PCR获取和扩增目的基因;(3)通过蛋白质工程改建目的基因2.基因表达载体的构建(基因工程的核心步骤)构建目的(1)让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代;(2)使目的基因能够表达和发挥作用基因表达载体的组成

启动子的分类组成型启动子在多数或全部组织中保持持续的驱动转录活性诱导型启动子受外界化学或物理信号调控驱动下游基因转录,如乳糖操纵子特异型启动子具有组织特异性(在特定的组织或器官中驱动下游基因转录)或者发育时期特异性(在特定发育时期驱动下游基因转录),如水稻胚乳细胞启动子构建基因表达载体过程示意图

错启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比

启动子终止子起始密码子终止密码子位置DNADNAmRNAmRNA作用RNA聚合酶识别和结

合的部位,驱动基因

的转录使转录停止翻译的起始信号(编

码氨基酸:甲硫氨酸)翻译的结束信号(一

般不编码氨基酸)知识拓展(1)标记基因的常见类型及相应筛选方法标记基因常见类型筛选方法标记基因为抗生素的抗性基因(1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果目的基因插入某种抗生素抗性基因,则会导致该抗生素抗性基因失活。如图,目的基因插入了四环素抗性基因,则四环素抗性基因失活。(2)处理后的细菌有:未导入质粒的细菌、含重组质粒的细菌、含空质粒的细菌。(3)筛选方法:将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌或含空质粒的细菌,如图中1、2、3、4、5菌落,再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即含有目的基因的导入了重组质粒的菌落,如图中1、5菌落。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养标记基因为必需营养物质合成基因基因表达载体上携带某种必需营养物质的合成基因,而受体细胞本身不能合成这一营养组分。将细胞在不含有此营养组分的培养基中培养,存活的便是转化成功的细胞标记基因为报告基因[如绿色荧光蛋白(GFP)基因]基因表达载体上携带的GFP基因表达的绿色荧光蛋白,在一定条件下可发出绿色荧光。将携带该标记基因的重组质粒导入细胞后,若细胞可发出绿色荧光,则说明转化成功(2)对空质粒的筛选——蓝白斑筛选法:载体上携带有抗生素抗性基因及lacZ基因。

lacZ基因表达产物可分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。该载

体上仅在lacZ基因中存在目的基因插入位点,若目的基因插入lacZ基因,则lacZ基因失

去相应功能。在大肠杆菌的培养基中加入相应抗生素和X-gal后,未导入质粒的菌株不

能生长,白色的菌落便是成功导入目的基因的大肠杆菌,呈现蓝色的菌落则是转入空质

粒的大肠杆菌。3.将目的基因导入受体细胞受体细胞的种类及方法植物细胞花粉管通道法使目的基因借助花粉管通道进入胚囊农杆菌转化法农杆菌能够将其环状质粒上的一段特殊DNA转移并整合到受体细胞的基因组

中,并使之携带的基因在受体细胞中表达动物细胞显微注射法利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中微生物细胞Ca2+处理法先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收境中DNA分子的生

理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中知识拓展农杆菌转化法(1)两次重组①第一次重组:目的基因(①)与Ti质粒构建重组载体。②第二次重组:重组Ti质粒上的T-DNA插入染色体DNA。(2)两次导入①第一次导入:将重组Ti质粒导入经Ca2+处理的农杆菌细胞。②第二次导入:将T-DNA导入植物细胞染色体DNA上。4.目的基因的检测与鉴定分子水平的检测检测目的基因是否导入受体细胞PCR操作方法:设计目的基因特异性引物,提取受体细胞内的基因组DNA进行PCR扩增,如果能够扩增出目的基因片段,说明该基因已经导入受体细胞DNA分子杂交操作方法:把目的基因片段用放射性同位素、生物素或荧光进行标记,与受体细胞的基因组DNA进行杂交,如果目的基因已经导入受体细胞,那么标记的基因片段就会与其结合,通过特殊的仪器就能够检测出来检测目的基因是否转录逆转录-PCR(RT-PCR)操作方法:提取受体细胞内的总RNA进行逆转录,得到cDNA,以获得的cDNA为模板,设计待测目的基因特异性引物进行PCR核酸分子杂交操作方法:从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子,用已标记的目的基因片段作为探针与mRNA杂交分子水平的检测检测目的基因是否翻译抗原—抗体杂交操作方法:从受体细胞中提取蛋白质后,进行电泳分离,然后利用目的蛋白的抗体进行检测个体生物学水平的鉴定检测目标性状的有无等,如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度五、基因工程的应用

简介设计基础以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础目的改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质改造方法由于基因决定蛋白质,因此要对蛋白质的结构进行设计改造,最终还必须通过改造或合成基因来完成基本思路从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质应用速效胰岛素类似物的研发、延长干扰素的体外保存时间、枯草杆菌蛋白酶的改进等考点3蛋白质工程小表达蛋白质工程中为什么要通过基因操作来实现对天然蛋白质的改造?_________

___________________________________________________________________________

_____________________________________。给下一代,而直接改造的蛋白质无法遗传

一般具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容;改造后的基因可以遗传蛋白质题型1限制酶的选择题型透析1.限制酶不能破坏目的基因的完整结构,也不能破坏载体上的启动子、终止子、复制

原点等必要元件。

结合两图可知:最宜选用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。注:若用Ti质粒,目的基因必须插入T-DNA序列。2.应使目的基因按照正确的转录方向插入载体的启动子和终止子之间。3.为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,尽量选用不同的限制酶切割目的基

因和质粒,即双酶切。典例1(2024梅州二模,14)光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨

玉米中光敏色素基因A(含大约256个碱基对)在棉花种质资源创制中的利用价值,研究

人员将A基因转入棉花中,对棉花受体细胞进行检测,并通过电泳技术分析结果。该过

程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示,

电泳检测结果如图丙。下列相关叙述正确的是

(

)CA.为构建正确连接的表达载体,应选用BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶B.PCR扩增目的基因过程中每次循环都要经历一次升次降温C.表达载体导入受体细胞后,可用含四环素的选择培养基进行初步筛选D.由图丙电泳结果可知,1、2、3、4号转基因棉花均培育成功解析为构建正确连接的表达载体,由图甲分析知,不能选用限制酶BamHⅠ,原因是

BamHⅠ会同时破坏质粒的两个标记基因,不利于基因表达载体的筛选,再结合图乙分

析,应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶,可以保证目的基因和质粒正确连接,A错误;

PCR扩增目的基因每次循环分为变性(升温)、复性(降温)和延伸(升温)三步,其中有两

次升次降温,B错误;用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶构建基因表达载体的过程

中,卡那霉素抗性基因被破坏,而四环素抗性基因在含目的基因的表达载体中存在,可用

含四环素的选择培养基进行初步筛选,而后在含有卡那霉素的培养基进行再次筛选,在

含四环素的培养基上存活、在含卡那霉素的培养基上死亡的细胞即为含有目的基因

的受体细胞,C正确;光敏色素基因A含大约256个碱基对,由图丙可知,1、2、3、4号均成功导入光敏色素基因A,但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的

鉴定,D错误。变式(同知识·不同考查角度 双酶切、酶切位点的连接)(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶

的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割

位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是

(

)A.质粒和目的基因都用酶3切割,用

E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coliDNA连接酶连接C解析酶4切割位点位于抗生素抗性基因(标记基因),酶切后会破坏标记基因,D不

符合题意;酶3切割后产生平末端,E.coliDNA连接酶连接平末端的DNA片段的效率远

低于T4DNA连接酶,A不符合题意;若用酶3切割质粒、酶1切割目的基因,两者产生的

末端无法连接在一起,B不符合题意;酶1和酶2切割后产生不同的黏性末端,T4DNA连

接酶既可连接黏性末端,也可连接平末端,若用酶1和酶2同时切割质粒和目的基因,并用

T4DNA连接酶连接,则既可避免质粒和目的基因的自身环化,又能保证目的基因正确

插入质粒,C符合题意。引物的特点(1)是一段短单链核酸,且能与DNA模板链的一段碱基序列互补配对。(2)一般引物的5'端可以被修饰,而3'端需与DNA模板链严格互补配对,故不可被修饰。5'端常见的修饰:加酶切位点、加荧光标记、引入突变位点等。(3)PCR过程中,引物一般成对存在且成对的引物不能碱基互补配对,避免引物之间发生自连判断引物的方向

图1(1)判断引物的3'端、5'端:引物与DNA模板链的3'端互补,方向相反。(