实时荧光定量PCR原理和实验

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实时荧光定量PCR原理和实验

所属分类：基因检测.

无论是对遗传病（如地中海贫血和血友病）、传染病（如肝炎和

艾滋病）或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的

影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发

挥很大作用,定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量,该技术借

助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面

还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲

线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数,

做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。

根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和

绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个

样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比;绝对定量

则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使

用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR

GreenI荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更

为严格，所得数据更为精确;荧光染料技术则成本更为低廉，实验

设计更为简便.在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度

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图1同一个样本重复96次PCR的扩增曲线

传统的定量方法，如浪乙锭染色或放射性核素掺入标记后的

光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝

数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以

根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。

对于绝大多数实验,比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等，

需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷贝数，经过

PCR扩增以后的DNA拷贝数已经不能反映真实情况。在这种情

况下，就不能采用终点定量，而要根据CT值确定DNA起始拷贝

的数量。

2为什么CT值与起始模板拷贝数成线性关系？

CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入

指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。从图1的重复实验中可

以直观地看到，尽管平台期DNA拷贝数波动很大,CT值却是相对

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固定的。如果用不同浓度的DNA作PCR,可以看出DNA浓度越

高,CT值越小.DNA浓度每增加1倍，CT值减小1个循环。CT

值与模板DNA的起始拷贝数成反比.

这一结论可以从数学上严格证明.为使表达式简便，以下推

导忽略PCR效率等细节。如果考虑这些因素，可以在方程上增

加修正项。这些修正项的增加并不改变方程的线性性质。

一般，我们有Rn=RB+XO(l+EX)nRS,也就是说第n次

PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每

个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。当

循环次数n=CT时，则有RT=RB+XO(1+EX)CTRS,两边取对

数，得log(RT-RB)=logXO+CTIog(l+Ex)+logRs.整理止匕

式,CTIog(l+Ex)=—logXO+log(RT-RB)-logRso

c--8x0]lo虱&--log电

「一1以1+0)-1必1+4)―

所以对于每一个特定的PCR反应来说,EX、RT、RB和RS都

是常数，所以CT值与logX0成反比，也就是说，CT值与起始

模板拷贝数(X0)的对数成反比，起始DNA浓度每增加1倍，CT

值减小1个循环.根据CT值的定量是精确和严格的，而传统的终

点定量则比较粗放。

如果读者有兴趣的话，也可以假设PCR的效率(即Ex)为

100%,从上式推算出定量PCR标准曲线的最佳斜率和CT值的

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最佳范围…/

3怎样确定CT值？

实验操作中，CT值定义为在基线上方产生可检测到的统计

学上显著的荧光发射时所对应的PCR循环次数（图2）・“基线

上方”也就是阈值高度的量化定义是基线范围内荧光信号强度标

准偏差的10倍。阈值所在的横线与PCR扩增曲线的交点所指的

PCR循环次数就是CT值。基线范围的定义是从第3个循环起到

CT值前3个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，

一般取第3到第15个循环之间。早于3个循环时，荧光信号很

弱，扣除背景后的校正信号往往波动比较大，不是真正的基线高

度；而在CT值前3个循环之内，大多数情况下荧光信号已经开

始增强，超过了基线高度，都不宜当作基线来处理。

C-ffi

图2CT值和阈值

显然,CT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验

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的质量,CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的

起始拷贝数越多；CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少.正常

的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的

精度。

4荧光信号和定量数据的归一化

虽然大多数定量PCR仪都会自动扣除本底，但是仍然需要

注意荧光信号强度和定量数据的归一化校正，以便不同样本之间

的实验数据可以严格地相互比较。

由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效

率的差异等偶然误差不可避免，因此仪器收集到的原始信号必须

进行归一化校正,以消除这些因素对定量结果的影响。这种校正

可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料来实现，一般采用红

色ROX荧光，称为阳性参比信号。ROX在反应缓冲液中的浓度

是固定的，因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激

发效率正相关,目标基因和对照基因的信号除以阳性参比信号以

后，即Rn=R/RROX,就可以在同样的起点上进行比较和各种

计算.

ROX校正可以提高定量数据的精度和重现性,减少孔间差异

（图3）。

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图3R0X荧光校正（左）和不校正（右）对实验数据的影响

归一后的荧光信号再扣除本底，就得到DRn：DRn=Rn,

样本一Rn,空白。DRn是最后构建PCR实时扩增曲线的纵坐标.

无论绝对定量还是相对定量，在得到实验结果后，还要考虑

数据之间的可比性问题。在实验操作中，取样都是以体积或重量

为单位的，但是同样体积或重量的样本所来源的细胞数目并不一

样，所以拷贝/uL或拷贝/ng的定量数据相互之间实际上并不可

比.只有将这些数据归一到以拷贝/细胞或拷贝/基因组为单位后，

才可进行严格意义上的比较。

这种校正可以通过适当的参比来完成.参比一般选用b-

actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因.由于它们在细胞中的表达

量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境因素影响较小，其定

量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量,校正方法为：

[DNA]样本/[DNA]IPC,或者DCT=CT,样本・C]IPC。因

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为CT值与起始DNA拷贝数的对数是反比关系，可以证明,这两

种计算方法在数学上是等价的。

为了减少误差，目标基因和参比基因最好在同一反应管内同

时进行定量测定，所以这种对照称为阳性内对照(Internal

PositiveControl,IPC)O要进行IPC归一化校正，定量PCR仪必

须具备多色检测能力，最好是4色。否则，目标基因和参比基因

只能分两管作定量，就不成其为“内”标了。

5污染的预防和热启动

为保证定量的准确性，要预防非特异性PCR扩增和污染。

常用的措施有使用UNG酶(Uracil-N-Glycosygse)和热启动.UNG

酣的作用原理是降解含有dU的双链或单链DNA,它在50°C激

活，95°C灭活.由于商用PCR试剂盒均以dUTP取代dTTP,所

以PCR产物都是含有dU的DNA链,在定量PCR开始前增加50°

C的保温步骤，UNG酶即可将已有的PCR产物降解破坏，防止可

能造成的污染.

普通的Taq酶即使在室温下也有一定的活性,如果不采取措

施，在加入PCR试剂的过程中、正式PCR开始前就会完成少量

PCR扩增,增加了背景，影响定量精度。而金牌Taq酶经过特殊

修饰，常温下其活性部位被封闭，没有活性：只有经过95。C10

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min的热启动以后，封闭被解除，才能开始DNA链延伸，这样就

最大限度地减少了杂讯的生成。

6标准曲线、重复实验和阴性、阳性对照

定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验，对数据进行

统计处理，可以将误差降低到最小,所以定量实验的每个样本至少

要重复3次以上，严格的定量更应当重复6〜8次，以满足小样本

统计的要求。

如果作绝对定量，则标准曲线需要在5个点以上。标准曲线

使用的标准品是

浓度已知的DNA样本,可以自己制备，也可以购买商品化的试剂

盒。其PCR反应条件应当与未知样本的一致，以便在同一反应板

上同时定量。

阴性对照中不加模板DNA,而以水或缓冲液代替，用于检

验是否存在PCR污染。阳性对照则用于检验PCR试剂和实验操

作上可能出现的问题。如果实验中设立了IPC,则IPC既可以用

来校正数据，也可以起到阳性对照的作用。

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7TaqMan霹T技术原理

TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用

归q酶的3'-5'外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。

由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模

板的数量.

在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR

引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两

条引物之间。探针的5,端标记有报告基团(Reporter,R),如

FAM、VIC等，3'端标记有荧光淬灭基团(Quencher;Q)，如

TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被

淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在

链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3'->5'外切核酸酶活

性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收,

即产生荧光信号(图4).所以，每经过一个PCR循环，荧光信号

也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就

代表了模板DNA的拷贝数。

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TaqMan®探针

下曲引物

图4TaqMan探针的荧光信号产生机制

TaqMan探针根据其3,端标记的荧光淬灭基团的不同分为

两种：普通的TaqMan探针和TaqManMGB探针,MGB探针的淬

灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-FluorescentQuencher),本身

不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接

有MGB(MinorGrooveBinder)修饰基团(图5),可以将探针

的Tm值提高10°C左右,因此为了获得同样的Tm值,MGB探针

可以比普通TaqMan探针设计得更短,既降低了合成成本，也使

得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不

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理想的情况下；短的探针比长的更容易没计。实验证明，TaqMan

MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想.

NFQ)洸帛天星国

1MGB]MinorGrooveBinder

图5TaqManMGB探针

8SYBRGreenI荧光染料技术原理SYBRGreenI是一种只

与DNA双链结合的荧光染料（图6）。当它与DNA双链结合时,

发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因

此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。

SYBRGreen荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应,

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当SYBRGreen染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性

时，SYBRGreen染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸

过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后,SYBRGreen

染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

图6SYBRGreenI荧光染料与DNA双链的结合

SYBRGreenI荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA

模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染

料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR

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反应的质量要隶就比较高•在此前提下，本法是一种成本低廉的

选择.

9定量PCR仪简介

目前在国内使用得比较多的荧光实时定量PCR仪有美国应

用生物系统公司(AppliedBiosystems,ABI)的7000>5700>7900>

7700型和罗氏公司的LightCycler等。下面以ABI最新推出的

7000型为例作简单介绍.

7000型荧光定量PCR仪设计满足临床检验、医学研究和基

础实验的要求，面向低通量至中等通量的用户。随机配置的定量

PCR引物和探针设计软件PrimerExpress非常有用，因为到目前

为止还没有其他软件有能力设计定量PCR所需的TaqMan探针.

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7000型有实时动态(Real—Time)和终点读板(PlateRead)

两种运行模式.实时动态模式用于定量，测定DNA或RNA拷贝数。

7000型可以动态显示PCR扩增曲线的生成，定量的线性范围大

于7个数量级，区分5000和10000个拷贝的DNA模板可信度

达99。7%。终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核

甘酸多态性(SNP)分析等•当然,7000型也可以作为普通PCR仪

使用。ABI已经发布12万个商品化的定量PCR试剂盒，覆盖人

类全部4万个基因,平均每个基因3个检测试剂盒,为运用7000.

7700>7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。

7000型最大特色是具备多色检测能力,荧光检测的波长范围

为530-590nm,能够有效地分辨FAMTM/SYBR?GreenL

VICTM/JOETM.TAMRATM和ROXTM等荧光染料。多色荧光

检测技术为多重定量、SNP分析、基因型分型和带阳性内对照的

阴/阳性分析提供了基础。多重定量即在同一反应管内同时对多

个目标基因进行定量，可以大大提高精度并节约成本。

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7000型支存两种定量化学:TaqMan荧光探针和SYBRGreen

I荧光染料淇熔解曲线(DissociationCurve)功能用于判断PCR

扩增反应是否特异，有无杂带生成。

进一步阅读材料基本方法[1]Lie,YoSoandCoJ。，

Petropoulos,"AdvancesinquantitativePCRtechnology:5'

nucleaseassays。”CurrOpinBiotechnol9:43-48o1998.[2]

Orlando,C.,Po,Pinzani,andM。，Pazzaglio"Developments

inquantitativePCR."ClinChemLabMed36:255-269.1998o

绝对定量[3]BeckerKo,D.PanandCoBoWhitley。1999.

Real-timequantitativepolymerasechainreactiontoassess

genetransfer.Hum。GeneTher.10:2559—2566,1999.[4]

deKok,J.Bo,Hendriks,J.Co,vanSolinge,WoWo,Willems,

HoL.,Mensink,EJ,andSwinkels,DoW.Useofreal-time

quantitativePCRtocompareDNAisolationmethods.

Clin.Chem.44(10):2201-2204,1998。[5]Wang