荧光原位杂交实验测定方法

荧光原位杂交实验测定方法荧光原位杂交（FluorescenceinsituHybridization,FISH）是一种利用荧光标记的核酸探针与细胞或组织内的靶核酸序列特异性结合，通过荧光显微镜观察信号位置和强度，从而实现对基因、染色体或核酸分子定位、定性和定量分析的分子生物学技术。该技术具有高灵敏度、高特异性、可视化强等优点，广泛应用于遗传学诊断、肿瘤研究、病原微生物检测、基因组学等多个领域。以下将详细介绍荧光原位杂交实验的完整测定方法，包括实验原理、材料准备、操作步骤、结果观察与分析以及注意事项等内容。一、实验原理荧光原位杂交的基本原理是基于核酸分子的碱基互补配对原则。带有荧光标记的核酸探针（通常是DNA或RNA片段）与样本中变性后的靶核酸序列（染色体DNA、细胞内mRNA等）在适宜的条件下进行退火杂交，形成双链结构。随后通过荧光显微镜检测探针上的荧光信号，即可确定靶核酸在细胞或组织中的位置、拷贝数以及表达水平等信息。根据探针的类型和标记方式的不同，荧光原位杂交可以分为多种类型，如染色体涂抹探针FISH、基因特异性探针FISH、染色体着丝粒探针FISH、RNA原位杂交等。不同类型的FISH技术适用于不同的研究目的，例如染色体涂抹探针可用于检测染色体结构异常，基因特异性探针可用于检测基因的拷贝数变化，RNA原位杂交则可用于检测细胞内特定mRNA的表达定位。二、材料准备（一）样本类型荧光原位杂交实验的样本类型多种多样，常见的包括外周血淋巴细胞、培养细胞系、石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、羊水细胞、绒毛膜绒毛细胞等。不同类型的样本需要采用不同的处理方法，以保证核酸的完整性和可杂交性。（二）主要试剂固定剂：常用的固定剂包括甲醇-冰醋酸固定液（3:1体积比）、多聚甲醛溶液等，用于固定细胞或组织，保持细胞形态和核酸的稳定性。变性液：如70%甲酰胺/2×SSC溶液（pH7.0），用于使样本中的靶核酸和探针核酸变性，解开双链结构，以便进行杂交。杂交液：通常包含甲酰胺、硫酸葡聚糖、氯化钠、Tris-HCl等成分，为杂交反应提供适宜的环境，促进探针与靶核酸的结合。探针：根据实验目的选择合适的荧光标记探针，如直接标记荧光素（FITC、TexasRed、Cy3、Cy5等）的探针，或间接标记生物素、地高辛等，后续通过荧光标记的亲和素或抗体进行检测的探针。洗涤液：如2×SSC、0.1×SSC/0.1%NP-40溶液等，用于去除未杂交的探针和非特异性结合的探针，降低背景信号。复染剂：如DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚），用于复染细胞核，便于观察细胞形态和染色体结构，同时与探针的荧光信号形成对比。其他试剂：包括蛋白酶K、RNaseA、Tween-20、甘油等，用于样本处理、杂交前预处理以及封片等步骤。（三）主要仪器设备荧光显微镜：配备不同波长的荧光滤光片，用于检测不同荧光标记的探针信号。通常需要配备紫外光、蓝光、绿光等激发光源，以及相应的发射滤光片，以实现对多种荧光信号的同时观察。恒温培养箱：用于样本的培养、杂交反应以及洗涤等步骤的温度控制，需要能够稳定控制温度在37℃、42℃、72℃等不同温度条件。离心机：用于细胞样本的离心收集和洗涤，如低速离心机用于收集外周血淋巴细胞，高速离心机用于细胞沉淀的离心。移液器：包括不同量程的微量移液器，用于准确移取试剂和样本。载玻片、盖玻片：用于样本的固定和杂交反应，载玻片需要经过清洁和硅化处理，以防止样本脱落。湿盒：用于杂交反应过程中保持湿度，防止杂交液蒸发，通常可以用密封的塑料盒内放置湿纱布或吸水纸制作而成。三、操作步骤（一）样本制备1.外周血淋巴细胞样本制备（1）采集外周血样本，加入肝素抗凝剂，轻轻颠倒混匀。（2）取适量外周血加入到含有淋巴细胞分离液的离心管中，室温下以2000rpm离心20分钟，吸取中间的淋巴细胞层。（3）用PBS溶液洗涤淋巴细胞2次，每次离心1000rpm，5分钟。（4）将淋巴细胞重悬于完全培养基中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养72小时，培养结束前4-6小时加入秋水仙素（终浓度0.1-0.2μg/mL），以阻断细胞分裂中期。（5）收集培养的细胞，用PBS洗涤2次，然后加入0.075MKCl低渗溶液，37℃水浴低渗处理20-30分钟。（6）加入固定液（甲醇-冰醋酸3:1）进行预固定，室温放置10分钟后离心，弃上清。（7）重复固定3次，每次加入固定液后轻轻吹打细胞，室温放置15分钟，离心弃上清。（8）最后将细胞重悬于适量固定液中，滴加到预冷的清洁载玻片上，自然干燥或在酒精灯火焰上快速烘烤，使细胞均匀分布在载玻片上。制备好的玻片可置于-20℃冰箱中保存备用。2.石蜡包埋组织切片样本制备（1）将石蜡包埋的组织块切成4-5μm厚的切片，贴附于经硅化处理的载玻片上。（2）将切片置于60℃烤箱中烘烤1-2小时，使切片与载玻片紧密结合，同时去除石蜡。（3）用二甲苯脱蜡2次，每次10分钟；然后依次用100%、95%、85%、70%乙醇梯度水化，每次5分钟；最后用PBS溶液洗涤2次，每次5分钟。（4）进行抗原修复：将切片置于柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，用微波炉或高压加热处理，使组织中的抗原表位暴露，同时促进核酸的变性。修复后用PBS洗涤2次，每次5分钟。（5）用蛋白酶K溶液（20μg/mL）在37℃下处理切片10-20分钟，以消化组织中的蛋白质，增加探针的穿透性。处理后用PBS洗涤2次，每次5分钟。（6）用4%多聚甲醛溶液固定切片10分钟，PBS洗涤2次，每次5分钟。（7）用70%、85%、100%乙醇梯度脱水，每次5分钟，自然干燥后备用。3.培养细胞系样本制备（1）取对数生长期的培养细胞，用胰蛋白酶或EDTA溶液消化细胞，离心收集细胞沉淀。（2）用PBS溶液洗涤细胞2次，每次离心1000rpm，5分钟。（3）加入0.075MKCl低渗溶液，37℃水浴低渗处理15-20分钟。（4）加入固定液（甲醇-冰醋酸3:1）进行预固定，室温放置10分钟后离心，弃上清。（5）重复固定3次，每次加入固定液后轻轻吹打细胞，室温放置15分钟，离心弃上清。（6）将细胞重悬于适量固定液中，滴加到预冷的清洁载玻片上，自然干燥或烘烤干燥，制备好的玻片可置于-20℃冰箱中保存备用。（二）探针制备与标记荧光原位杂交探针的制备方法主要包括化学合成法、PCR扩增法、质粒DNA提取法等。探针的标记方式可以分为直接标记和间接标记两种。1.直接标记法直接标记法是将荧光素直接连接到探针核酸分子上，常用的方法包括化学偶联法和酶促标记法。化学偶联法是通过化学反应将荧光素分子与探针的氨基、巯基等基团结合；酶促标记法则是利用DNA聚合酶、RNA聚合酶等酶在合成探针的过程中将荧光标记的核苷酸掺入到探针分子中。直接标记的探针杂交后可直接通过荧光显微镜观察信号，操作简便，但灵敏度相对较低。2.间接标记法间接标记法是先将生物素、地高辛等半抗原标记到探针上，杂交后再用荧光标记的亲和素或抗地高辛抗体与半抗原结合，通过免疫反应放大荧光信号。间接标记法的灵敏度较高，可检测到低拷贝数的靶核酸，但操作步骤相对繁琐。以地高辛标记探针为例，其制备过程如下：（1）取适量的探针DNA模板，加入dNTP混合物（包含地高辛标记的dUTP）、DNA聚合酶、反应缓冲液等，进行PCR扩增或随机引物延伸反应。（2）反应结束后，用乙醇沉淀法纯化标记好的探针，去除未掺入的核苷酸和酶等杂质。（3）将纯化后的探针溶解于TE缓冲液中，测定探针的浓度和标记效率，分装后置于-20℃冰箱中保存备用。（三）杂交前预处理杂交前预处理的目的是去除样本中的蛋白质、RNA等杂质，使靶核酸充分暴露，同时促进探针与靶核酸的结合。不同类型的样本预处理方法有所差异，以下以染色体样本为例进行介绍：RNase处理：将制备好的染色体玻片置于RNaseA溶液（100μg/mL，溶于2×SSC）中，37℃水浴处理1小时，以去除细胞内的RNA，防止RNA与探针非特异性结合。处理后用2×SSC洗涤玻片2次，每次5分钟。蛋白酶K处理：用蛋白酶K溶液（25μg/mL，溶于20mMTris-HCl/2mMCaCl₂，pH7.4）在37℃下处理玻片5-10分钟，以消化染色体周围的蛋白质，增加探针的穿透性。处理后用PBS洗涤玻片2次，每次5分钟，然后用4%多聚甲醛溶液固定5分钟，再用2×SSC洗涤2次，每次5分钟。脱水：将玻片依次用70%、85%、100%乙醇梯度脱水，每次5分钟，自然干燥后备用。（四）变性与杂交样本变性：将预处理好的玻片置于70℃的变性液（70%甲酰胺/2×SSC，pH7.0）中处理2-5分钟，使染色体DNA变性为单链。变性时间需要根据样本类型和玻片质量进行优化，避免过度变性导致染色体形态破坏。变性后立即将玻片置于预冷的70%乙醇中脱水5分钟，然后依次用85%、100%乙醇脱水，每次5分钟，自然干燥。探针变性：取适量标记好的探针，加入杂交液（通常包含50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、2×SSC等），充分混匀后置于70℃水浴中变性5分钟，迅速转移至冰上冷却2-3分钟，使探针DNA变性为单链。杂交：将变性后的探针杂交液滴加到样本玻片的杂交区域，盖上盖玻片，用橡皮胶或封片胶封边，防止杂交液蒸发。将玻片置于湿盒中，37℃恒温培养箱中杂交过夜（12-16小时）。杂交过程中需要保持湿盒内的湿度，避免杂交液干涸。（五）杂交后洗涤杂交后洗涤的目的是去除未杂交的探针和非特异性结合的探针，降低背景信号，提高实验的特异性。洗涤步骤通常包括以下几个阶段：stringent洗涤：将玻片从湿盒中取出，去除盖玻片，置于42℃的洗涤液（50%甲酰胺/2×SSC，pH7.0）中洗涤2次，每次10分钟，以去除非特异性结合的探针。低严格度洗涤：将玻片转移至42℃的2×SSC溶液中洗涤2次，每次5分钟，进一步去除残留的杂质。高严格度洗涤：对于间接标记的探针，还需要用含0.1%NP-40的0.1×SSC溶液在42℃下洗涤2次，每次5分钟，以减少背景信号。PBS洗涤：最后用PBS溶液洗涤玻片2次，每次5分钟，去除残留的SSC溶液，为后续的检测步骤做准备。（六）荧光检测与封片荧光抗体孵育（间接标记法）：对于间接标记的探针，如生物素或地高辛标记的探针，需要进行荧光抗体孵育。将玻片置于湿盒中，滴加适量的荧光标记亲和素或抗地高辛抗体溶液，37℃孵育30-60分钟。孵育结束后，用含0.1%Tween-20的PBS溶液洗涤玻片3次，每次5分钟，去除未结合的抗体。复染：滴加适量的DAPI复染液，室温避光孵育5-10分钟，使细胞核或染色体染色。复染后用PBS溶液洗涤玻片2次，每次5分钟，去除多余的复染液。封片：用吸水纸吸去玻片边缘的水分，滴加抗淬灭封片液，盖上盖玻片，避免产生气泡。封片后可置于-20℃冰箱中短期保存，或立即进行荧光显微镜观察。四、结果观察与分析（一）荧光显微镜观察将制备好的玻片置于荧光显微镜下，选择合适的荧光滤光片，分别观察DAPI染色的细胞核或染色体以及探针的荧光信号。通常DAPI发出蓝色荧光，FITC发出绿色荧光，TexasRed或Cy3发出红色荧光，Cy5发出远红色荧光。通过调整显微镜的焦距和曝光时间，使荧光信号清晰可见，同时避免过度曝光导致信号饱和。在观察过程中，需要注意区分特异性信号和背景信号。特异性信号通常表现为明亮、清晰的点状或片状荧光，位于细胞核或染色体的特定位置；而背景信号则表现为弥散、均匀的荧光，分布在整个视野中。如果背景信号过高，可能是由于杂交前预处理不充分、探针浓度过高、洗涤不彻底等原因导致的，需要对实验条件进行优化。（二）结果分析定性分析：根据荧光信号的位置和形态，判断靶核酸在细胞或组织中的定位情况。例如，在染色体FISH实验中，观察探针信号是否位于预期的染色体区域，是否存在染色体结构异常（如缺失、重复、易位等）；在RNA原位杂交实验中，观察荧光信号是否位于细胞质中，是否与特定的细胞类型相关。定量分析：通过计数荧光信号的数量，对靶核酸的拷贝数或表达水平进行定量分析。在染色体FISH实验中，通常计数至少200个细胞中探针信号的数量，计算阳性细胞的比例和平均信号拷贝数；在RNA原位杂交实验中，可以通过测量荧光信号的强度，比较不同样本或不同细胞类型中靶mRNA的表达水平差异。图像采集与处理：使用荧光显微镜配备的图像采集系统，采集清晰的荧光图像，并利用图像分析软件对图像进行处理和分析，如调整亮度、对比度、叠加不同荧光通道的图像等，以便更直观地观察和分析实验结果。五、注意事项（一）样本质量控制样本的质量直接影响实验结果的准确性和可靠性。在样本制备过程中，需要注意避免样本的污染和降解，保持细胞或组织的形态完整。对于石蜡包埋组织切片，需要确保切片厚度均匀，无褶皱和破损；对于培养细胞，需要选择对数生长期的细胞，避免细胞过度融合或老化。（二）探针选择与优化根据实验目的选择合适的探针类型和标记方式，同时需要对探针的浓度、变性时间、杂交温度等条件进行优化，以提高探针与靶核酸的结合效率和特异性。在使用新的探针时，建议先进行预