肝细胞生长因子对肉鸡血管内皮祖细胞氧化损伤的逆转作用

肝细胞生长因子对肉鸡血管内皮祖细胞氧化损伤的逆转作用摘要本研究旨在探讨肝细胞生长因子（HepatocyteGrowthFactor，HGF）对肉鸡血管内皮祖细胞（EndothelialProgenitorCells，EPCs）氧化损伤的逆转作用。通过建立H₂O₂诱导的肉鸡血管内皮祖细胞氧化损伤模型，采用不同浓度的HGF进行干预，运用MTT法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡率，DCFH-DA探针法测定细胞内活性氧（ROS）水平，并通过Westernblot检测相关抗氧化蛋白和凋亡蛋白的表达。结果表明，HGF能够显著提高氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞的活力，降低细胞凋亡率和细胞内ROS水平，上调超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化蛋白表达，下调Bax等促凋亡蛋白表达，上调Bcl-2等抗凋亡蛋白表达。本研究证实了HGF对肉鸡血管内皮祖细胞氧化损伤具有明显的逆转作用，为进一步阐明HGF在肉鸡血管健康维护中的作用机制提供了理论依据，也为改善肉鸡养殖过程中血管相关问题提供了新的思路和潜在方法。关键词肝细胞生长因子；肉鸡；血管内皮祖细胞；氧化损伤；逆转作用一、引言在现代肉鸡养殖业中，肉鸡的快速生长和高效生产是追求的主要目标。然而，随着养殖密度的增加、环境压力的增大以及饲料营养结构的改变，肉鸡血管系统面临着诸多挑战，其中氧化应激引发的血管内皮损伤是一个关键问题。血管内皮祖细胞作为血管内皮细胞的前体细胞，在血管新生、血管修复以及维持血管内皮功能稳定方面发挥着重要作用。当血管内皮祖细胞遭受氧化损伤时，其正常功能受损，会影响血管的完整性和功能，进而导致肉鸡生长性能下降、疾病易感性增加，给养殖业带来严重的经济损失。肝细胞生长因子是一种多功能细胞因子，具有促进细胞增殖、迁移、分化以及抗凋亡等多种生物学活性。在哺乳动物的研究中发现，HGF对多种细胞的氧化损伤具有保护和修复作用，能够通过激活多种信号通路调节细胞的抗氧化能力和凋亡过程。然而，目前关于HGF在肉鸡血管内皮祖细胞氧化损伤修复方面的研究较少。因此，本研究旨在探究HGF对肉鸡血管内皮祖细胞氧化损伤的逆转作用，为提高肉鸡的血管健康和养殖效益提供理论支持和技术参考。二、材料与方法（一）实验材料实验动物：1日龄健康AA肉鸡雏鸡，购自本地正规种鸡场，饲养于符合标准的实验动物房，自由采食和饮水。主要试剂：DMEM培养基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Gibco公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、肝细胞生长因子（HGF，PeproTech公司）、过氧化氢（H₂O₂，Sigma公司）、MTT试剂（Sigma公司）、AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒（BD公司）、DCFH-DA探针（Beyotime公司）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime公司）、兔抗肉鸡SOD抗体、兔抗肉鸡GSH-Px抗体、兔抗肉鸡Bax抗体、兔抗肉鸡Bcl-2抗体（CellSignalingTechnology公司）、HRP标记的羊抗兔IgG抗体（JacksonImmunoResearch公司）。主要仪器：CO₂培养箱（ThermoFisherScientific公司）、倒置相差显微镜（Olympus公司）、高速冷冻离心机（Eppendorf公司）、酶标仪（Bio-Rad公司）、流式细胞仪（BD公司）、荧光显微镜（Nikon公司）、Westernblot电泳及转膜系统（Bio-Rad公司）。（二）实验方法肉鸡血管内皮祖细胞的分离与培养：取7日龄AA肉鸡，颈椎脱臼处死，无菌条件下分离取其股骨和胫骨，用含10%FBS的DMEM培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗液，1500r/min离心10min，弃上清。将细胞沉淀重悬于含20%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，接种于培养瓶，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。24h后更换培养液，去除未贴壁细胞，之后每2-3天换液一次。待细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。取第3-5代细胞用于后续实验。氧化损伤模型的建立：将培养的肉鸡血管内皮祖细胞以1×10⁵cells/well的密度接种于96孔板和6孔板中，培养24h至细胞贴壁。实验组加入不同浓度（50、100、200μmol/L）的H₂O₂，对照组加入等体积的PBS，继续培养2h，通过预实验确定最佳造模浓度，建立氧化损伤模型。HGF干预实验：将处于对数生长期的肉鸡血管内皮祖细胞接种于96孔板和6孔板中，培养24h后，分为正常对照组、氧化损伤模型组、HGF低浓度组（5ng/mL）、HGF中浓度组（10ng/mL）、HGF高浓度组（20ng/mL）。除正常对照组外，其余各组先加入200μmol/LH₂O₂处理2h建立氧化损伤模型，然后HGF各干预组分别加入相应浓度的HGF继续培养24h，正常对照组和氧化损伤模型组加入等体积的无血清培养基。细胞活力检测：采用MTT法检测细胞活力。在上述实验处理结束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4h。弃去培养液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶充分溶解。用酶标仪在570nm波长处测定各孔吸光度（OD值），计算细胞活力。细胞活力（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。细胞凋亡检测：采用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒，按照说明书操作。将6孔板中的细胞用胰蛋白酶消化后，1500r/min离心5min，收集细胞沉淀，用PBS洗涤2次。加入500μLBindingBuffer重悬细胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，室温避光孵育15min，立即用流式细胞仪检测，分析细胞凋亡率。细胞内ROS水平测定：采用DCFH-DA探针法检测细胞内ROS水平。将6孔板中的细胞用PBS洗涤2次，每孔加入10μmol/LDCFH-DA探针工作液，37℃避光孵育20min。用PBS洗涤3次，去除未进入细胞的DCFH-DA。在荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光强度，荧光强度越强表示细胞内ROS水平越高；同时，收集细胞，用流式细胞仪检测细胞内平均荧光强度，定量分析ROS水平。抗氧化酶活性检测：收集6孔板中的细胞，按照SOD和GSH-Px检测试剂盒说明书操作，测定细胞内SOD和GSH-Px的活性。首先，用细胞裂解液裂解细胞，4℃、12000r/min离心10min，取上清。然后，根据试剂盒提供的方法，分别测定样品中SOD和GSH-Px的活性，同时用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度，结果以U/mg蛋白表示。Westernblot检测相关蛋白表达：收集6孔板中的细胞，加入适量RIPA裂解液裂解细胞，4℃、12000r/min离心15min，取上清。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样品与5×SDS上样缓冲液按4:1比例混合，煮沸5min使蛋白变性。进行SDS电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2h。分别加入兔抗肉鸡SOD抗体（1:1000）、兔抗肉鸡GSH-Px抗体（1:1000）、兔抗肉鸡Bax抗体（1:1000）、兔抗肉鸡Bcl-2抗体（1:1000），4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体（1:5000），室温孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统下曝光、显影，分析蛋白表达水平。（三）数据分析采用GraphPadPrism8.0软件进行数据分析，实验数据以“均值±标准差（x±s）”表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用Tukey检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。三、结果（一）H₂O₂诱导肉鸡血管内皮祖细胞氧化损伤模型的确定随着H₂O₂浓度的增加，肉鸡血管内皮祖细胞的活力逐渐下降（图1）。当H₂O₂浓度为200μmol/L时，细胞活力显著低于正常对照组（P＜0.01），且细胞形态发生明显改变，表现为细胞皱缩、变圆，部分细胞脱落。因此，选择200μmol/LH₂O₂处理2h作为氧化损伤模型的建立条件。（二）HGF对氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞活力的影响与氧化损伤模型组相比，HGF各干预组细胞活力均显著提高（P＜0.05或P＜0.01），且呈剂量依赖性（图2）。其中，HGF高浓度组（20ng/mL）细胞活力提高最为显著，表明HGF能够有效恢复氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞的活力。（三）HGF对氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果显示，氧化损伤模型组细胞凋亡率显著高于正常对照组（P＜0.01）。与氧化损伤模型组相比，HGF各干预组细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），且HGF高浓度组（20ng/mL）降低细胞凋亡率的效果最为明显（图3）。这表明HGF能够抑制氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞的凋亡。（四）HGF对氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞内ROS水平的影响荧光显微镜观察和流式细胞仪检测结果均显示，氧化损伤模型组细胞内ROS水平显著高于正常对照组（P＜0.01）。与氧化损伤模型组相比，HGF各干预组细胞内ROS水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），HGF高浓度组（20ng/mL）降低ROS水平的效果最为显著（图4）。说明HGF能够有效减少氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞内ROS的积累。（五）HGF对氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞抗氧化酶活性的影响与正常对照组相比，氧化损伤模型组细胞内SOD和GSH-Px活性显著降低（P＜0.01）。与氧化损伤模型组相比，HGF各干预组细胞内SOD和GSH-Px活性均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），且HGF高浓度组（20ng/mL）升高抗氧化酶活性的作用最为明显（图5）。表明HGF能够增强氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞的抗氧化能力。（六）HGF对氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞相关蛋白表达的影响Westernblot检测结果显示，与正常对照组相比，氧化损伤模型组Bax蛋白表达显著上调（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达显著下调（P＜0.01），SOD和GSH-Px蛋白表达也显著降低（P＜0.01）。与氧化损伤模型组相比，HGF各干预组Bax蛋白表达显著下调（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2、SOD和GSH-Px蛋白表达显著上调（P＜0.05或P＜0.01），HGF高浓度组（20ng/mL）对相关蛋白表达的调节作用最为显著（图6）。说明HGF通过调节抗氧化蛋白和凋亡蛋白的表达，发挥对氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞的保护作用。四、讨论本研究成功建立了H₂O₂诱导的肉鸡血管内皮祖细胞氧化损伤模型，并证实了HGF对该氧化损伤具有明显的逆转作用。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内氧化与抗氧化系统失衡，导致活性氧（ROS）产生过多，从而引起细胞损伤。在本研究中，H₂O₂处理导致肉鸡血管内皮祖细胞活力下降、细胞凋亡增加、细胞内ROS水平升高，同时抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性降低，相关抗氧化蛋白和抗凋亡蛋白表达减少，这与以往在其他细胞中的研究结果一致。HGF作为一种重要的细胞因子，在本研究中表现出显著的细胞保护作用。HGF能够提高氧化损伤后肉鸡血管内皮祖细胞的活力，降低细胞凋亡率，这可能是通过调节细胞内凋亡相关蛋白的表达实现的。Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白，二者的比值决定细胞是否发生凋亡。本研究中，HGF干预后，Bax蛋白表达下调，Bcl-2蛋白表达上调，Bcl-2/Bax比值升高，从而抑制了细胞凋亡。此外，HGF还能够降低细胞内ROS水平，增强细胞的抗氧化能力。SOD和GSH-Px是细胞内重要的抗氧化酶，能够清除过量的ROS，维持细胞内氧化还原平衡。HGF上调SOD和GSH-Px蛋白表达