2027届高中生物一轮复习讲义第十单元　第54课时　基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)

第54课时基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)考点一基因工程的基本工具1．基因工程(重组DNA技术)的概念归纳总结基因工程的理论基础教材隐性知识源自选择性必修3P68“科技探索之路”：肺炎链球菌的转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移；科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移；多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件；基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。2．重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)提醒①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。②在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。③原核生物中限制酶存在的意义是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。而限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰(甲基化)，使限制酶不能将其切开。(2)DNA连接酶(3)载体归纳总结①在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。②噬菌体或某些动植物病毒作为载体的原理是利用了噬菌体或病毒对宿主细胞的侵染性。③载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞，原理如图所示：分析限制酶的作用和选择将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：(1)限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割产生的黏性末端分别是和。(2)切割图中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。提示用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。归纳总结限制酶的选择(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。考向一辨析基因工程的基本工具1．(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是()A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落答案D解析若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中四环素抗性基因被破坏，因此在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。2.链状DNA分子经限制酶切割产生的黏性末端如图所示。下列叙述正确的是()A．限制酶切断的是同一条链上两个特定相邻碱基间的氢键B．图中同一条链上两个相邻碱基N之间有脱氧核糖、磷酸基团各2个C．每条链5′端、3′端的C原子分别与羟基、磷酸基团相连接D．理论上，图中黏性末端最多可能有256种答案D解析限制酶切断的是DNA分子两条链上两个特定相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，A错误；图中同一条链上两个相邻碱基N之间有2个脱氧核糖和1个磷酸基团，B错误；图中每条链5′端、3′端的碳原子分别与磷酸基团、羟基相连接，C错误；图中黏性末端含有4个碱基，因此，理论上，图中黏性末端最多可能有44＝256(种)，D正确。归纳提升与DNA有关的几种酶的比较考点二基因工程的基本操作程序1．目的基因的筛选与获取(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。(2)筛选合适的目的基因①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。(3)目的基因的获取①人工合成目的基因。②PCR获取和扩增目的基因。③通过构建基因文库来获取目的基因。2．基因表达载体的构建——基因工程的核心归纳总结启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(正常情况下，不编码氨基酸)3.将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法、花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程农杆菌转化法：将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入辨析(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入4．目的基因的检测与鉴定分析基因工程的基本操作程序科学家将苏云金杆菌中“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。回答以下问题：(1)能否让游离的杀虫基因直接进入棉花细胞？并说明理由。提示游离杀虫基因一般会在棉花细胞中被分解，即使能表达，也不能随细胞分裂进行复制，不能稳定地遗传给子代。(2)如何让杀虫基因稳定存在于棉花细胞？提示通过构建基因表达载体实现将杀虫基因整合到染色体DNA上，或者能在细胞内独立稳定存在，且能自我复制并表达，随着细胞分裂传给子代。(3)为确保杀虫基因可以正常表达，在基因表达载体中，其上下游序列需具有启动子和终止子。(4)杀虫基因导入棉花细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从棉花细胞中提取染色体DNA(基因组DNA)并用PCR扩增，电泳后观察是否扩增出目的基因。(5)若要通过实验检测杀虫基因在棉花细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路：从棉花细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带。考向二辨析基因工程的基本操作程序3．(2025·安徽，15)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是()A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌答案C解析使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；如果筛选平板中仅含卡那霉素，能生长出的菌落都具有卡那霉素抗性，白色菌落可能导入了重组质粒(含目的基因)，筛选平板因未加入X-gal无法检验β-半乳糖苷酶基因是否被破坏，也可能是导入了未重组的质粒K，所以不可判定该白色菌落为含目的基因的菌株，B正确；筛选平板中长出的白色菌落，可能导入了重组质粒(含目的基因)，但导入的目的基因不一定成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定其为表达目标蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β-半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β-半乳糖苷酶，分解X-gal进而形成蓝色菌落，D正确。归纳总结双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种：含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的细菌即为含重组质粒的细菌，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。4．(2025·陕晋宁青，21)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题：(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、____________、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的______________________________________________步骤中起作用。(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的____________(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′－____________－3′，切割载体时应选用的两种限制酶是____________，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T－DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到__________________________________________________________，抗性基因______可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。答案(1)4种脱氧核苷酸延伸(2)5′端AGATCTBamHⅠ、EcoRⅠ(3)栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上2再分化解析(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。(2)为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5′端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ的识别序列，而S基因内部含有XbaⅠ、NdeⅠ和BamHⅠ的识别序列，要用BamHⅠ、EcoRⅠ或XbaⅠ切割载体，又不能用XbaⅠ、NdeⅠ或BamHⅠ切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知需要用BamHⅠ、EcoRⅠ切割载体，用BamHⅠ的同尾酶BglⅡ和EcoRⅠ切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5′－AGATCT－3′。(3)T－DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T－DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上，抗性基因1位于T－DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T－DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。考点三DNA的粗提取与鉴定1．基本原理2．操作流程提醒(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。(2)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。(1)DNA的粗提取与鉴定实验中，可用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”(2025·湖南，2)(×)提示猪成熟红细胞没有细胞核和众多细胞器，不含DNA，用猪成熟红细胞替代猪肝细胞用于DNA的粗提取与鉴定实验达不到实验目的。(2)土豆DNA溶于酒精后，与二苯胺试剂混合呈蓝色(2025·四川，5)(×)提示DNA的鉴定需在沸水浴条件下与二苯胺试剂反应呈蓝色。(3)向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物(×)提示向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞吸水涨破，DNA溶于蒸馏水，观察不到白色丝状物。(4)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行(2022·湖北，4)(×)提示动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行。考向三DNA的粗提取与鉴定5．(2024·安徽，14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是()A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAC．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质答案D解析研磨液中含有NaCl，有利于DNA的溶解，若换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，因此利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可用于鉴定DNA，不能检测溶液中是否含有蛋白质杂质，D错误。6．(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列叙述正确的是()A．整个提取过程中可以不使用离心机B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰答案A解析研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理5分钟，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。一、基础排查1．判断下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述(1)与洋葱相比，猪血更适合作为DNA的粗提取与鉴定实验的材料(×)提示猪血主要包括红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞和血小板无细胞核，不适合用于提取DNA。(2)因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质(×)提示DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理可初步分离DNA与蛋白质。(3)研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，取沉淀进一步实验(×)提示研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，故取上清液进一步实验。(4)预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解(√)(5)加入预冷酒精析出白色丝状物的过程中用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌(√)(6)两次离心，第一次DNA主要存在于上清液中，第二次主要存在于沉淀物中(√)(7)将提取的丝状物溶解在2mol/L的NaCl溶液中，将二苯胺试剂加入就能出现蓝色(×)提示将丝状物溶解在2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，经过沸水浴加热5min才会出现蓝色。2．判断下列关于基因工程中工具酶的叙述(1)限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取(√)(2)限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNA(×)提示限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，不能识别剪切RNA。(3)不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端(√)(4)DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键(×)提示DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键。(5)E.coliDNA连接酶只能将有互补黏性末端的两个DNA片段连接起来(×)提示E．coliDNA连接酶既能连接具有黏性末端的DNA片段，也能连接具有平末端的DNA片段，只是连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4DNA连接酶。3．判断下列关于基因工程中载体的叙述(1)基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等(√)(2)基因工程中用的载体大多数为天然质粒(×)提示在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。(3)质粒是常用的载体，有2个游离的磷酸基团(×)提示质粒是一种双链环状DNA分子，无游离的磷酸基团。(4)载体质粒必须具有自我复制能力(√)(5)载体质粒具有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入(√)(6)载体质粒中必须有抗生素抗性基因，便于重组DNA分子的筛选(×)提示载体质粒中必须有标记基因，但不一定是抗生素抗性基因。4．判断下列关于基因表达载体及其构建过程的叙述(1)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建(√)(2)构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代(√)(3)一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止密码子等结构(×)提示基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。(4)基因表达载体的构建至少需要两种工具酶(√)(5)基因表达载体的构建过程中会发生碱基互补配对(√)(6)诱导物与诱导型启动子结合可激活或抑制目的基因表达(√)(7)基因表达载体中启动子具有DNA聚合酶的结合部位，启动复制过程(×)提示启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录过程。5．判断下列关于将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定的叙述(1)农杆菌转化法是利用土壤农杆菌侵染植物细胞，然后将重组Ti质粒整合到受体植物细胞的染色体DNA上(×)提示农杆菌转化法是将目的基因插入农杆菌的Ti质粒中的T－DNA上，让携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞的染色体DNA上。(2)将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌(√)(3)应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T－DNA片段内(√)(4)将目的基因导入动物细胞常用体细胞作受体细胞，采用显微注射技术进行操作(×)提示动物受精卵全能性最高，应采用显微注射技术将目的基因导入受精卵中。(5)可采用PCR技术检测目的基因是否转录和翻译(×)提示可采用PCR技术检测目的基因是否转录，采用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译。(6)检测某抗虫基因转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状(√)二、要语必背1．(选择性必修3P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。2．(选择性必修3P72)载体上有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。3．(选择性必修3P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。4．(选择性必修3P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。5．(选择性必修3P80)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。6．(选择性必修3P81)转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。课时精练[分值：100分][1～2题，每题4分；3～10题，每题5分。共48分]一、选择题1．(2025·河南新高中创新联盟模拟)如表是几种限制酶的识别序列及切割位点(Y＝C或T，R＝A或G)。下列叙述正确的是()限制酶识别序列及切割位点HindⅡ5′－GTY↓RAC－3′AluⅠ5′－AG↓CT－3′BamHⅠ5′－G↓GATCC－3′Sau3AⅠ5′－↓GATC－3′A.限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加2个游离的磷酸基团B．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割C．AluⅠ切割后的DNA片段只可用E.coliDNA连接酶连接D．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割答案A解析限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，形成2个新的游离的磷酸基团，A正确；一种限制酶不一定只识别一种核苷酸序列，如HindⅡ，B错误；用AluⅠ切割得到的是平末端，可用T4DNA连接酶连接起来，C错误；BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ不能识别并切割重组片段，而Sau3AⅠ可识别并切割重组片段，D错误。2．(2024·湖南，5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是()A．限制酶失活，更换新的限制酶B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNAD．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶答案B解析限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；在酶切条件不合适时，可能会出现DNA完全没有被酶切的情况，需要调整反应条件如温度、pH等，但调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变可能会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒DNA，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。3．(2025·江苏，19改编)如图为人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列叙述错误的是()A．基因A突变为基因a是一种碱基的替换B．用两种限制酶分别酶切基因A后，形成的末端类型不同C．用两种限制酶分别酶切基因a后，产生的片段大小一致D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定答案C解析对比基因A和基因a的序列，基因A中“AAGCTT”变为基因a中“AAGCTG”，属于碱基替换(T→G)，A正确；HindⅢ切割产生黏性末端，AluⅠ切割产生平末端，二者形成的末端类型不同，B正确；基因a中HindⅢ有2个切割位点，AluⅠ有3个切割位点，用两种限制酶分别酶切基因a后，产生的片段大小不一致，C错误；因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。4．在基因工程中，被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。某进行改造后的质粒如图所示。用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是()A．若质粒和目的基因都用酶1切割，用T4DNA连接酶连接的效率高于E.coliDNA连接酶B．若质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，重组质粒中的目的基因转录的产物可能不同C．若质粒和目的基因都用酶3和酶4切割，能在含氯霉素的培养基上存活的细菌中含有目的基因D．与用酶3和酶4处理相比，用酶1和酶4处理形成的重组质粒更容易转化到受体菌中答案C解析酶1切割质粒和目的基因产生的DNA片段末端为平末端，T4DNA连接酶“缝合”双链DNA片段平末端的效率比E.coliDNA连接酶高，A正确；酶2和酶4切割质粒和目的基因产生的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下形成重组质粒时，目的基因可能反向连接在质粒上，导致转录产物不同，B正确；若质粒和目的基因都用酶3和酶4切割，可以形成含有目的基因的重组质粒，在导入受体细胞时，导入的可能是重组质粒，也可能是不含目的基因的质粒，含有这两种质粒的受体菌均能在含氯霉素的培养基中生长，C错误；与用酶3和酶4处理相比，用酶1和酶4处理质粒和目的基因形成的重组质粒分子量较小，更容易转化到受体菌中，D正确。5．(2025·绵阳三模)转座子是一段可移动的DNA序列，这段DNA序列可以从原位上单独复制或断裂下来，插入另一位点。转座子既可在真核细胞染色体内部和染色体间转移，该过程依托转座酶将转座子两端特定序列进行切割，再将其插入DNA分子的特定位点中，也可在细菌的拟核DNA、质粒或噬菌体之间自行移动。有的转座子中含有抗生素抗性基因，可以很快地传播到其他细菌细胞。下列叙述错误的是()A．细菌细胞的抗药性可以来自转座子和基因突变B．转座子只能造成染色体变异，不能导致基因重组的发生C．转座子移动过程中，转座酶可使磷酸二酯键断裂与形成D．转座子可以是一段有遗传效应的脱氧核苷酸序列答案B解析根据题干中“有的转座子中含有抗生素抗性基因，可以很快地传播到其他细菌细胞”，说明细菌的抗药性可来自转座子或者自身的基因突变，A正确；根据题干中“转座子可在真核细胞染色体内部和染色体间转移”，说明转座子可造成真核生物染色体变异或基因重组，B错误。6．(2025·河南名校学术联盟一模)含有荧光素酶基因Luc(可让细胞发出荧光)的基因表达载体(该基因与其他构件的关系如图所示)可用于培育转基因植物。科研人员拟利用该基因表达载体将抗旱基因LEA导入烟草中以培养抗干旱烟草。下列叙述正确的是()A．构建基因表达载体时，一般将LEA基因插入BamHⅠ位点处B．启动子的作用是与解旋酶识别并结合，从而开启目的基因的转录C．荧光素酶基因Luc在基因表达载体中的作用是作为标记基因D．被导入了基因表达载体的烟草叶肉细胞通过脱分化形成胚状体答案C解析荧光素酶基因Luc可让细胞发出荧光，将LEA基因插入BamHⅠ位点时，会破坏标记基因Luc，A错误；启动子的作用是与RNA聚合酶识别并结合，从而开启目的基因的转录，B错误；可以通过受体细胞是否发荧光判断基因表达载体是否导入受体细胞，所以荧光素酶基因Luc在基因表达载体中的作用是作为标记基因，C正确；被导入了基因表达载体的烟草叶肉细胞通过脱分化只能形成愈伤组织，还需要经过再分化才能形成胚状体，D错误。7．(2025·湖北圆创联盟一模)如图为pUC18质粒图谱，已知目的基因两侧的酶切位点为EcoRⅠ和BamHⅠ。现需将目的基因插入质粒的LacZ基因内，形成重组质粒并导入受体细胞。下列限制酶组合选择及后续处理最合适的是()注：图中AmpR为氨苄青霉素抗性基因、ori为复制原点，LacZ表达产物可使X－gal的培养基呈现蓝色。A．用BamHⅠ酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素的培养基B．用EcoRⅠ酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素和X－gal的培养基C．用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含X－gal的培养基D．用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素和X－gal的培养基答案D解析单酶切可能导致目的基因反向插入或质粒自连，无法确保定向克隆，A、B错误；缺少氨苄青霉素筛选，无法排除未成功转化的细菌(不含质粒)，C错误；双酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)确保目的基因定向插入LacZ基因内部，破坏其表达，重组质粒在含X－gal的培养基上呈白色，非重组质粒呈蓝色，氨苄青霉素筛选仅保留含质粒的细菌，D正确。8．(2025·武汉三模)Hv-Lv肽链是抗体与抗原识别并结合的关键结构。为筛选特异性高、结合能力强的Hv-Lv肽链，将编码Hv-Lv肽链的DNA片段与丝状噬菌体固有外壳蛋白pVⅢ的基因连接并一起表达，最后用固定化抗原筛选(过程如图)。下列叙述错误的是()A．Hv-LvDNA片段上游需要设计并连接启动子B．Hv-LvDNA片段上无需连接标记基因C．收集不耐受冲洗的噬菌体获得目标肽链D．实验过程须严格遵循生物防护措施答案C解析启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别与结合的位点，可用于驱动基因的转录，故Hv-LvDNA片段上游需要设计并连接启动子，A正确；Hv-Lv肽链是抗体与抗原识别并结合的关键结构，而Hv-LvDNA可表达出Hv-Lv肽链，可通过是否与固定化抗原相结合进行筛选，无需连接标记基因，B正确；结合题意可知，该过程的目的是筛选特异性高、结合能力强的Hv-Lv肽链，因此，需收集耐受冲洗的噬菌体获得目标肽链，C错误；丝状噬菌体为病毒，实验过程须严格遵循生物防护措施，尽可能避免可能会带来的安全问题，D正确。9．(2025·河南豫西北教研联盟二模)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5；该重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。下列叙述错误的是()A．作为基因表达载体，图甲中的质粒还必须具有特殊标记基因、复制原点B．为检测J基因是否插入图甲所示的位置，需用引物F1和R1进行PCRC．若J基因转录的模板链位于b链，则引物F2与图甲中a链相应部分的序列相同D．图乙中，条带1的出现证明重组质粒在受体细胞内表达了J-V5融合蛋白答案B解析作为基因表达载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组后重组质粒的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图甲中的质粒为重组质粒，有启动子和终止子等，因此该质粒还需具备的结构有标记基因、复制原点等，A正确。据图甲可知，引物F1能与J基因左端序列配对，引物R2能与终止子序列配对，因此推测为检测J基因是否插入图甲所示的位置，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1，B错误。b链是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(也就是a链)是5′→3′；考虑到DNA转录的方向是子链的5′→3′，引物基础上延伸的方向肯定是5′→3′，所以引物结合的单链其方向是3′→5′；图中F2是左引物，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同，C正确。据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白，D正确。10．(2022·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列叙述错误的是()A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质答案B解析离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确。二、非选择题11．(14分)(2024·重庆，19)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。(1)基因S启动子的基本组成单位是____________。(2)(6分)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是____________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是________________________________________________________________。(3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有___________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是______________。(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是___________________________________。答案(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)(2)EcoRⅠ酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接(3)酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段PCR(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大解析(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因转录，是一段有特殊序列结构的DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。(2)根据图中信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目的基因序列被破坏；根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段；在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。(4)根据题目信息可知，再生植株YZ－1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。12．(16分)(2024·贵州，21)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因)，检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示(表中“＋”表示有，“－”表示无)。检测用菌株蔗糖NV酶葡萄糖(培养液中)野生型＋＋＋野生型－－－突变体＋－－转基因菌株＋＋＋回答下列问题：(1)据表可推测__________诱导了NV基因表达。NV酶的作用是____________________。检测NV酶活性时，需测定的指标是____________________________________(答出1点即可)。(2)表中突变体由T－DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与________(填“T－DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度__________(填“>”“＝”或“<”)野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是_____________________________。(3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入______________细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是_______________。答案(1)蔗糖参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解成葡萄糖单位时间内葡萄糖的生成量(或蔗糖的减少量等)(2)NV基因＞突变体NV基因中插入了T－DNA序列，使基因中碱基对增加而发生突变(3)突变体便于筛选出成功导入NV基因的细胞解析(1)根据表格可知，野生型菌株在加入蔗糖的培养基中会合成NV酶，不加蔗糖不会合成NV酶，推测蔗糖诱导了NV基因表达。分析表格可知，有NV酶时，菌株就能将蔗糖分解成葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程。检测NV酶活性时，需测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。(2)从题目中可知，突变体是由T－DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得的。在进行PCR扩增时，使用的引物需要与特定的DNA序列互补配对，才能启动DNA的扩增。野生型菌株的基因组DNA中没有T－DNA的插入，所以只有用与NV基因配对的引物进行扩增时，才可以扩增出两种菌株的基因片段。突变体中的NV基因中插入了T－DNA序列，导致其碱基对增加，因此若突变体扩增片段长度＞野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。(3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入突变体细胞获得的。突变体由于NV基因发生突变，无法正常表达NV酶，导致相关生理功能缺失或异常。将正常的NV基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明NV基因确实具有特定的功能。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，便于筛选出成功导入NV基因的细胞。13．(22分)(2025·河北，22)为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题：(1)(6分)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是__________和__________。模板与引物在PCR反应的__________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为_________________________________。