生物工程实验指导-课件 05-微生物学实验

微生物学实验实验一

培养基的配制与灭菌实验二

无菌操作接种技术实验三

细菌、放线菌的形态观察实验四

酵母菌、霉菌的形态观察实验五

微生物的分离和计数实验六

物理、化学因素对微生物生长的影响实验七

食品中大肠菌群检验实验八

药品微生物学检查实验九

产酶微生物的分离和筛选实验一

培养基的配制与灭菌1实验目的了解培养基的主要营养成分、培养基的类型,掌握试管斜面培养基、液体培养基和固体平板培养基的配制和灭菌方法。2实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型,对营养物质的要求也各不相同,加之实验和研究的目的不同,所以培养基的种类很多,使用的原料和配制方法也各有差异。但从营养角度分析,培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长因子及水分等。另外,培养基还应具有适宜的pH、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。按培养基在常温下的物理状态可将培养基分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。呈液体状态的培养基,叫作液体培养基。液体培养基因营养物质分布均匀,与菌体表面接触充分,还能大量溶解微生物的代谢产物等优点,广泛用于微生物的生理、代谢研究,以及大规模的工业化生产中。在液体培养基中加入2%左右的琼脂,加热至98~100℃使其融化,冷却至45℃以下凝固,使其成为固体状态即为固体培养基。在液体培养基中加入少量的凝固剂(如0.2%~0.5%的琼脂)而制成的培养基为半固体培养基。这种培养基常用于观察细菌的运动、厌氧菌的分离和菌种鉴定等。由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物,已配制好的培养基必须立即灭菌,以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。通过加热使菌体内的蛋白质凝固变性,从而达到杀菌目的。3实验材料及设备3.1培养基①牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂15~20g,蒸馏水1000mL,培养基为pH为7.2~7.4。②高氏一号(Gause’sI)合成培养基可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,磷酸氢二钾0.5g,七水硫酸镁0.5g,氯化钠0.5g,七水硫酸亚铁0.01g,琼脂15~20g,蒸馏水1000mL,pH为7.0~7.4。③孟加拉红培养基蛋白胨5g,葡萄糖10g,磷酸二氢钾1g,七水硫酸镁0.5g,琼脂20g,孟加拉红0.0333g,氯霉素0.1g,蒸馏水1000mL。④YEPD培养基(用于培养酵母)酵母粉10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,蒸馏水1000mL,琼脂15~20g,培养基pH为5.8~6.2。3实验材料及设备3.2溶液10%氢氧化钠溶液、10%盐酸溶液。3.3仪器设备天平1台、称量纸5张、牛角匙3支、精密pH试纸(5.4~9.0)、量筒1个(500mL)、试管10支(18mm×180mm)、三角瓶1个(500mL)、漏斗1个(7cm)、铁架台及铁圈1组、移液管1支(10mL)、塑料无菌培养皿10个(90mm)、玻璃棒1支、烧杯1个(1000mL)、试管架1个、酒精灯2个、硅胶发泡试管塞(18~20mm)、耐高温橡皮筋(10个)、牛皮纸1张、组培封口膜(10个)、酒精棉球2瓶、镊子2个、电炉1台、超净工作台1台、高压蒸汽灭菌锅1台、电热恒温干燥箱1台、恒温培养箱1台。说明:上述为每组所需数量。4实验步骤4.1选择培养基配方、计算用量根据培养的微生物种类和实验目的,选择适当的培养基。然后,根据计划用量,依据配方计算各种成分的用量。选择培养基配方→计算→器皿的准备→称药品→溶解→调pH→分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板→无菌检查4.2器皿的准备将实验所需器皿准备好,其中试管、三角瓶最好是干燥的,培养皿必须提前灭菌。4.3配制培养基①称量药品根据配方,计算出实验中各种药品所需的量,然后分别称(量)取。蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。②溶解用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水,倒入烧杯中。在放有石棉网的电炉上小火加热,并用玻璃棒搅拌,以防液体溢出。一般情况下,几种药品可一起倒入烧杯内,先加入少许水进行加热溶解(但在配制化学成分较多的培养基时,有些药品,如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀,故宜按配方依次溶解。个别成分如能分别溶解,经分开灭菌后混合,则效果更为理想)。加热溶解时,要不断搅拌。待各种药品完全溶解后,停止加热,补足水分。如果配方中有淀粉,则先将淀粉用少量冷水调成糊状,再在火上加热搅拌,然后加足水分及其他原料,待完全溶化后,补足水分。4实验步骤4.3配制培养基③调节pH根据培养基对pH的要求,用滴管逐滴加入用10%氢氧化钠溶液或10%盐酸溶液,边滴加边搅拌均匀,用精密pH试纸测定其pH,直到符合要求时为止。pH也可用pH计来测定。在配制pH较低的琼脂培养基时,如预先调好pH并在高压蒸气下灭菌,则琼脂因水解不能凝固。因此,应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合,或在中性pH条件下灭菌后,再调整pH。④溶化琼脂固体或半固体培养基通常加入一定量琼脂。琼脂加入后,将烧杯置于电炉上一边搅拌,一边加热,直至琼脂完全融化后才能停止搅拌,并补足水分(水需预热)。注意控制火力,不要使培养基溢出或烧焦。若制备固体平板,琼脂粉可在液体培养基分装三角瓶后按比例加入,灭菌时琼脂会被溶化。⑤过滤如需过滤,要先将过滤装置安装好。如果是液体培养基,玻璃漏斗中放一层滤纸;如果是固体或半固体培养基,则需在漏斗中放多层纱布,或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉,趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。⑥分装分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口,以免浸湿棉塞,引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜;固体分装量为试管高度的1/5;半固体分装一般以试管高度的1/3为宜;分装三角瓶时,其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。用于振荡培养时,250mL三角瓶中装50mL液体培养基。4实验步骤4.3配制培养基⑦包扎标记培养基分装好以后,在试管口或烧瓶口上应加上一支棉塞。棉塞的作用有两点:一方面阻止外界微生物进入培养基内,防止由此引起的污染;另一方面保证良好的通气性能,使微生物能不断地获得无菌空气。因此,棉塞质量的好坏对实验的结果有很大影响。另外,也可以用硅胶发泡试管塞来代替棉塞,对通气要求不高的可用试管帽。塞好后,再包上一层牛皮纸,用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称,制备组别和姓名、日期等。

也可采用硅胶发泡试管塞代替棉塞,注意选用合适的型号。4.4灭菌培养基的灭菌时间和温度需按照各种培养基的规定进行,以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。普通培养基通常为121℃,灭菌20min,以保证灭菌效果且不损伤培养基的有效成分。4.5摆斜面或倒平板培养基经灭菌后,如需要做斜面固体培养基,则灭菌后应立即摆放成斜面,斜面长度为试管长度1/3~1/2,不能超过1/2;半固体培养基灭菌后,应垂直冷凝成半固体深层琼脂。将需倒平板的培养基置于水浴锅中冷却到55~60℃,立刻倒平板。4.6培养基的无菌检查取出1~2个培养基,置于37℃培养箱中培养1~2d。确定无菌后,培养基方可使用。5结果与分析(1)记录所在组的实验任务、采用的培养基配方及用途,分析培养基中碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子的来源。计算并记录所用药品用量,所需器皿名称、规格及数量。(2)记录灭菌条件(温度、压力、时间等)。(3)观察所制备的斜面培养基和平板培养基,检查其是否平整,凝固是否结实,冷凝水是否过多,有无不溶物。同时,检查斜面长度是否适宜,液体培养基是否浑浊。记录结果并分析原因。检查培养基的灭菌是否彻底。6思考题①做过本次实验后,你认为在制备培养基时要注意哪些问题?②培养基为什么要调整pH?细菌、放线菌、酵母菌、霉菌生长最适pH为多少?实验二

无菌操作接种技术1实验目的掌握无菌操作的原理和斜面接种、液体接种、平板接种和穿刺接种操作过程。接种是指在无菌操作条件下将一定量的纯种微生物转移到另一已灭菌且适宜该菌生长繁殖的培养基上的过程。接种操作一般是在无菌操作台或在实验室内火焰旁进行。根据不同的实验目的和培养方式,可以采用不同的接种工具和接种方法。2实验原理3实验材料及设备3.1菌种大肠杆菌(Escherichiacoli)24h营养琼脂斜面菌种1支金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)24h琼脂斜面菌种1支酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)斜面菌种1支3.2培养基牛肉膏蛋白胨平板培养基10个、牛肉膏蛋白胨斜面培养基10个、YEPD液体试管培养基4个、明胶半固体培养基10个。3.3仪器设备移液管、移液器、涂布棒(玻璃刮铲)、接种环4支、接种针4支、酒精灯2个、镊子2个、酒精棉球2瓶、记号笔2支,超净工作台1台、电热恒温培养箱1台、摇床培养箱1台。4实验步骤4.1接种前的准备工作在微生物实验中,一般小规模的接种操作,使用无菌接种箱或超净工作台;工作量大时,使用无菌室接种,要求严格在无菌室内,再结合使用超净工作台。(1)无菌室的设计无菌室的设计可因地制宜,但应具备下列基本条件:①无菌室要求严密、避光,隔板以采用玻璃为佳。但为了在使用后排湿通风,应在顶部设立百叶排气窗。窗口加密封盖板,可以启闭,也可在窗口用数层纱布和棉花蒙罩。无菌室侧面底部应设进气孔。最好能通入过滤的无菌空气。②无菌室一般应有里外两间。较小的外间为缓冲间,可提高隔离效果。③无菌室应安装拉门,以减少空气流动。必要时,在向外一侧的玻璃隔板上安装一个双层的小型玻璃橱窗,便于内外传递物品,减少进出无菌室的次数。④室内应有照明、电热和动力用的电源。⑤工作台面应抗热、抗腐蚀,便于清洗消毒。可采用橡胶板或塑料板铺设台面。4.1.1无菌室的准备4实验步骤4.1接种前的准备工作(2)无菌室内的设备①无菌室的里外两间均应安装日光灯和紫外线杀菌灯。紫外灯常用规格为30W,吊装在经常工作位置的上方,距地高度为2~2.2m。②缓冲间内应安排工作台,供放置工作服、鞋、帽、口罩、消毒药物、手持式喷雾器等,并备有废物桶等。③无菌室内应备有接种用的常用器具、如酒精灯、接种针、不锈钢刀、剪刀、镊子、酒精棉球瓶、记号笔等。(3)无菌室的灭菌①熏蒸:在无菌室全面彻底灭菌时使用。先将室内打扫干净,打开进气孔和排气窗通风干燥后,重新关闭,进行熏蒸灭菌。常用的灭菌药品为福尔马林(含37%~40%甲醛的水溶液)。按6~10mL/m3的标准计算用量,熏蒸液取出后,盛于铁制容器中,利用电炉或酒精灯直接加热,应能随时在室外停止热源;也可以加半量高锰酸钾,通过氧化作用加热,使福尔马林蒸发。熏蒸后应保持密闭12h以上。由于甲醛气体具有较强的刺激作用,所以在使用无菌室前1~2h,在一搪瓷盘内加入与所用甲醛溶液等量的氨水,放入无菌室,使其挥发中和甲醛,以减轻刺激作用。除甲醛外,也可用硫黄等进行熏蒸灭菌。②紫外灯照射:在每次工作前后,均应打开紫外灯,分别照射30min,进行灭菌。在无菌室内工作时,切记要关闭紫外灯。③石炭酸溶液喷雾:每次临操作前,用手持喷雾器喷雾5%石炭酸溶液,主要喷于台面和地面,兼有灭菌和防止微尘飞扬的作用。4.1.1无菌室的准备4实验步骤4.1接种前的准备工作(4)无菌室空气污染情况的检验为了检验无菌室灭菌的效果,以及在操作过程中空气污染的程度,需要定期在无菌室内进行空气中杂菌的检验。检验一般可在两个时间点进行:一是在灭菌后,使用前;二是在操作完毕后。取牛肉膏蛋白胨琼脂和马铃薯蔗糖琼脂两种培养基的平板各3个,在无菌室使用前(或使用后),揭开并放置在无菌室台上,半小时后重新盖好。另取一份不打开,作为对照,一并放入30℃下培养。48h后检查有无杂菌生长,以及杂菌数量的多少。根据检验结果确定应采取的措施。通常要求平板培养基在开盖5min后,菌落数量不超过3个;斜面培养基在开塞30min后,不出现菌落则视为合格。无菌室灭菌后、使用前检验时,应无杂菌。如果检查时长出的杂菌多为霉菌,表明室内湿度过大,应先通风干燥,再用5%石炭酸全面喷洒,最后用甲醛熏蒸;如果检查时长出的杂菌以细菌为主,可采用乳酸和甲醛交替熏蒸,效果较好。(5)无菌室操作规则①将所用的实验材料和用品一次性全部放入无菌室,同时将放入的培养基用牛皮纸遮盖。应尽量避免在操作过程中出入无菌室或传递物品。操作前先打开紫外灯照射半小时,关闭紫外灯后,再开始工作。②进入缓冲间后,应该换好工作服、鞋、帽、戴上口罩,将手用消毒液清洁后,再进入工作间。③

操作时,严格按无菌操作方法进行,废物应丢入废物桶内。④工作结束后,应将台面收拾干净,取出培养物品及废物桶。随后,使用5%石炭酸进行喷雾消毒,再打开紫外灯照射30min。4.1.1无菌室的准备4实验步骤4.1接种前的准备工作(1)接种环(针):微生物学中最常用的接种工具为接种环。接种环通常由一段铂金丝安装在防锈的金属杆上制成。市售商品多以镍铬丝自制,简便适用。接种环前端要求圆而闭合,否则液体不会在环内形成菌膜。根据不同用途,接种环的顶端可以改换为其他形式,如接种针等。接种环的灭菌采用火焰灼烧法。接种环主要用于从斜面菌种接到斜面培养基或液体培养基中。(2)移液管:无菌操作接种用的移液管常为1mL或10mL刻度吸管。吸管在使用前用牛皮纸包好,干热灭菌1~2h。(3)移液器:移液器又称移液枪,是一种用于精确转移液体的器具。其规格范围通常在0.1~5mL,与移液管相比,移液器具有操作便捷,准确度高和重复性好的特点。一般接种用的移液器吸头经121℃高压蒸汽灭菌15~20mm后即可使用。若需严格无菌操作,需要选用可高压灭菌型移液器。部分移液器下半部能够高温灭菌,只需将下半部轻轻旋开,即可卸下进行灭菌。因此,在进行生物安全实验或无菌要求比较高的操作时,应选用整支可灭菌移液器。整支灭菌只适用于极少数实验,且灭菌方法需要按规定的步骤操作,如果长时间灭菌会影响移液器的精度和使用寿命。(4)涂布棒(玻璃刮铲):涂布棒是稀释涂布平板法进行菌种分离或微生物计数时的常用工具。玻璃刮铲接触平板的一侧,要求平直光滑,既能进行均匀涂布,又不会刮伤平板培养基表面。4.1.2接种工具的准备4实验步骤4.2接种方法(1)斜面接种技术斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种,移植至另一新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下:①标记:接种前在试管上贴标签,注明菌名、接种日期、接种人姓名等。标签应贴在距试管口2~3cm的位置。也可用记号笔注明上述内容。②消毒:点燃酒精灯。用70%酒精棉球对手进行消毒。③接种:使用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。接种操作必须严格按照无菌操作法进行,技术要点如下:a.手持试管:将菌种和待接斜面的试管用大拇指和其他四指握在左手中,使中指位于两试管之间。斜面面向操作者,并保持水平位置。b.拔棉塞:用右手的无名指、小指和手掌边,依次取下菌种试管和待接种试管的棉塞。试管口缓缓通过火焰灭菌,但切勿烧得过烫(图5-1)。4实验步骤4.2接种方法c.接种环冷却:将灼烧过的接种环伸入菌种管,先使环接触没有长菌的培养基部分,使其冷却。d.取菌:待接种环冷却后,轻轻蘸取少量菌体或孢子,然后将接种环移出菌种管。注意不要使接种环碰到管壁,取出后不可使接种环通过火焰。e.接种:在火焰旁无菌区域迅速将蘸有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”字形密集划线,切勿划破培养基。也可用接种针仅在斜面培养基的中央划一条直线进行接种,此方法可观察不同菌种的菌落形态和生长特点。f.塞棉塞:取出接种环,在酒精灯外焰灼烧试管口,并在火焰旁将棉塞旋转塞入。塞棉塞时,不可将试管口主动迎向棉塞,以免移动过程中带入杂菌。将接种环灼烧灭菌后放下,再次旋紧棉塞。(2)液体接种技术①用斜面菌种接种液体培养基时,分下面两种情况:如果接种量小,可用接种环取少量菌体移入培养基容器(试管或三角瓶等)中。将接种环浸入液体表面轻轻振荡或在器壁上轻轻摩擦,使菌苔散开。抽出接种环,塞好棉塞,振荡培养液,使菌体均匀分布在液体中。如果接种量大,可先向斜面菌种管中注入定量无菌水,用接种环将菌苔刮下搅拌开,再把菌悬液倒入培养基中。倒液前需将试管口在火焰上灭菌。②用液体培养物接种液体培养基时,可根据具体情况采用以下不同方法:用无菌吸管、移液管或移液器吸取菌液进行接种;直接把液体培养物转移入液体培养基中;利用压力差将液体培养物接入液体培养基中,例如发酵罐接入种子菌液。4实验步骤4.2接种方法(3)穿刺接种技术穿刺接种技术是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体,并将其穿刺到固体或半固体深层培养基中的接种方法。这种方法常用于保藏菌种,同时也是检查细菌运动能力的一种方法,适用于细菌和酵母菌的接种培养。具体操作如下:①标记。②点燃酒精灯。③穿刺接种。其方法如下:a.手持试管。b.旋松棉塞。c.右手拿接种针,在火焰上将针端灼烧灭菌。接着把在穿刺中可能伸入试管的其他部位,也灼烧灭菌。d.用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培养基部分冷却,再用接种针的针尖沾到少量菌种。e.接种有两种手持操作法:一种是水平法,类似于斜面接种法;另一种是垂直法(图5-2)。穿刺时无论选择何种手持方法,接种针都必须保持挺直,自培养基中心垂直地刺入培养基。穿刺时要做到手稳、动作轻巧迅速,将接种针穿刺到接近试管底部,然后沿原穿刺线将针拔出。最后,塞上棉塞,再将接种针上残留的菌体彻底灼烧灭菌。4实验步骤4.2接种方法④将接种过的试管垂直放置于试管架中,置于37℃或28℃恒温培养箱中培养。24h后观察结果。注意:若细菌具有运动能力,细菌会沿着接种线向外运动并弥散,形成粗而分散的穿刺线;反之,则呈现细而密集的穿刺线。(4)平板接种平板接种是将菌种接种至培养皿的一种方法,其目的是观察菌落形态、分离纯化菌种、进行活菌计数,以及在平板上进行各种试验。平板接种可分为以下几种方法:①划线法a.分段划线法平板分段划线及培养后菌落分布(图5-3)。本法多用于含菌量较多的标本。操作步骤如下:用接种环蘸取少许样品,先在平板培养基表面边缘划线(划线时接种环与培养基表面呈45°角)。然后将接种环置于火焰上灭菌,待冷却(可用接种环接触琼脂表面检测,不融化,即冷却)。转动平皿约60°,从第一区划线末端引出,进行第二区划线,且在开始划线时与第一区的划线相交接数次,以后划线不必再相接。待第二区划完,重复灭菌操作,再划线,依次划至最后一区。灭菌接种环。这样每一区划线内的细菌数逐渐减少,以获得单个菌落。划线接种完毕,盖好平皿盖,倒置(平板底部向上)于37℃温箱中培养。4实验步骤4.2接种方法b.连续划线法此法多用于含菌数量较少的样品或培养物。操作步骤如下:先将样品或培养物涂布于平板表面的边缘区域,然后用接种环从涂布处开始,连续“之”字形划线。②点种法一般用于观察霉菌菌落形态。在无菌条件下,用接种环或接种钩挑取少量菌种,轻轻点在平板的表面即可。③涂布平板法用无菌吸管或移液器吸取0.1mL或0.2mL菌液,小心地滴在平板培养基中央位置。用无菌涂布器平放在平板培养基表面,将菌悬液沿同心圆方向轻轻地向外扩展,使之分布均匀。室温下静置5~10min,使菌液浸入培养基。5结果与分析记录本组实验菌种名称(中英文学名)、培养基(写清培养基类型、配方及灭菌条件)、接种方法,培养条件(培养设备名称、温度、时间),分析接种培养结果。6思考题①无菌操作前应做哪些准备工作?②接种时如何防止杂菌污染?实验三

细菌、放线菌的形态观察1实验目的(1)了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性,掌握革兰氏染色技术。(2)初步认识细菌的形态特征,巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。(3)学习放线菌菌落特征、个体形态及繁殖方式的观察方法。细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明,在普通的光学显微镜下不易识别,因此必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色,使染色后的菌体与背景形成明显的色差,从而更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便,适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。通常使用碱性染料对细菌进行简单染色,这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中,细菌细胞通常带负电荷,而碱性染料在电离时,其分子的染色部分带正电荷,因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合,从而使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比,在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有亚甲蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时,细菌所带正电荷增加,此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。染色前必须固定细菌,其目的主要有两个:一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上;二是增加其对染料的亲和力。常用的固定方法包括加热固定和化学固定。在固定过程中,应尽量维持细胞原有的形态。2实验原理2实验原理革兰氏染色法是由丹麦病理学家ChristainGram在1884年创立的。这种方法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法之一。革兰氏染色法的基本步骤是:先用初染剂结晶紫进行初染,再用碘液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脱色,最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后,细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌;如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色),则该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法之所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性,是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上,当用结晶紫初染后,像简单染色法一样,所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂,它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物,从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时,两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,壁厚、类脂质含量低。用乙醇(或丙酮)脱色时,细胞壁脱水,使肽聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。经脱色和复染后,细胞仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同,其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高。在脱色处理时,类脂质被乙醇(或丙酮)溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来。用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色。放线菌的菌落早期呈绒状,与细菌菌落的月牙状相似;后期形成孢子,菌落呈粉状、干燥,有各种颜色,呈同心圆放射状。放线菌的菌落在培养基上着生牢固,与基质结合紧密,难以用接种针挑取。放线菌是由不同长短的纤细菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分:潜入培养基中的营养菌丝(或称基内菌丝)和生长在培养基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分化成各种孢子丝,呈螺旋形、波浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝、孢子丝的形状及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。为避免菌丝体形态破坏,通常采用插片法和印片法,并结合菌丝体简单染色进行观察。在插片法中,将灭菌盖玻片插入接种有放线菌的平板,使放线菌沿盖玻片和培养基交界处生长并附着在盖玻片上。取出盖玻片后,可直接在显微镜下观察自然生长状态下的形态特征,而且有利于对不同生长期的放线菌形态进行观察。在显微镜下直接观察时,气生菌丝在上层、营养菌丝在下层,气生菌丝色暗,营养菌丝较透明。孢子丝依种类的不同,有直的、波曲的、各种螺旋形的或轮生的。3实验材料及设备3.1菌种大肠杆菌(Escherichiacoli)24h平板培养物1个、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)24h平板培养物1个、灰色链霉菌(Str.griseus)培养物1个、天蓝色链霉菌(Str.coelicolor)培养物1个、细黄链霉菌(Str.microflavus)培养物1个。3.2培养基高氏一号平板培养基10个。3.3染色剂结晶紫染液1瓶、卢戈氏碘液1瓶、95%乙醇1瓶、番红染色液1瓶。3.4仪器设备普通光学显微镜2台、酒精灯2个、废液缸1个、洗瓶1个、载玻片10片、接种环2个、60mm培养皿4个、香柏油1瓶、擦镜纸1本、吸水纸1盒、无菌水1瓶、灭菌盖玻片10片、去油剂1瓶。4实验步骤4.1细菌革兰氏染色步骤(1)涂片取两块洁净无油的载玻片,在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸馏水)于玻片中央,用接种环以无菌操作,分别从金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔放于水滴中,混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片,可用接种环挑取2~3环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水或蒸馏水和取菌时不宜过多,且涂抹要均匀,不宜过厚。(2)干燥室温自然干燥。也可以将涂面朝上,在酒精灯上方稍微加热,使其干燥。但切勿离火焰太近,因温度太高会破坏菌体形态。(3)固定如果用加热干燥,固定与干燥可以合为一步,方法同干燥。4实验步骤4.1细菌革兰氏染色步骤(4)初染滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上,染色1min,倾去染色液,用细水冲洗至洗出液为无色,将载玻片上的水甩净。(5)媒染用卢戈氏碘液媒染约1min。(6)脱色用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95%的乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗,终止脱色,将载玻片上的水甩净。革兰氏染色结果是否正确,乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。如果脱色不足,革兰氏阴性菌可能被误染成阳性菌;反之,如果脱色过度,革兰氏阳性菌可能被误染成阴性菌。脱色时间一般20~30s。(7)复染在涂片上滴加番红液复染2~3min,水洗,然后用吸水纸吸干。(8)镜检干燥后,先用低倍镜,再用高倍镜观察,最后用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌(G+),被染成红色的为革兰氏阴性菌(G-)。(9)实验结束后处理清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油,然后再用擦镜纸蘸取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹,最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗,晾干后装盒备用。4实验步骤4.1细菌革兰氏染色步骤※注意事项:①选用幼龄的细菌。革兰氏阳性菌培养12h~16h,大肠杆菌培养24h。若培养时间过长(菌龄过老),因菌体死亡或自溶,革兰氏阳性菌可能呈现假阴性反应。②革兰氏染色成败关键在于酒精脱色。如果脱色过度,革兰氏阳性菌可能被脱色,从而被误染成阴性菌;反之,如果脱色时间过短,革兰氏阴性菌可能被误染成革兰氏阳性菌。此外,脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量等因素的影响,因此难以进行严格规定。③染色过程中切勿使染色液干涸。用水冲洗后,应吸去玻片上的残水,以免染色液被稀释而影响染色效果。4.2放线菌形态观察(插片法)(1)插片将灭菌的盖玻片以45°角斜插入高氏一号平板培养基中(图5-4),插入深度约为培养基的1/2或1/3。(2)接种与培养用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线,然后将平板放置于28℃下培养3~7d。(3)观察培养完成后,菌丝体生长在培养基及盖玻片上。小心用镊子将盖玻片抽出,轻轻擦去生长较差一面的菌丝体。将生长良好的菌丝体面向上,将盖玻片压放于载玻片上。然后直接在显微镜下进行染色观察。5结果与分析(1)绘出革兰氏染色后的细菌形态图,注明菌种名称,染色结果并对实验结果进行分析。(2)观察并绘制放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝及孢子形态。6思考题①革兰氏染色时,初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?②不经过复染这一步,能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌?③你认为制备细菌染色标本时,应该注意哪些环节?④为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?⑤如果涂片未经热固定,将会出现什么问题?如果加热温度过高或时间太长,又会怎么样?⑥在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的营养菌丝和气生菌丝?实验四

酵母菌、霉菌的形态观察1实验目的观察酿酒酵母的菌落形态、菌体形态及出芽繁殖过程;学习酵母菌死活细胞的鉴定方法;学习霉菌的形态观察方法。酵母菌是单细胞的真核微生物,细胞核和细胞质有明显的分化,个体比细菌大得多。酵母菌的形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。酵母菌的无性繁殖方式有芽殖、裂殖和产生掷孢子等;酵母菌的有性繁殖则形成子囊和子囊孢子。在一系列的芽殖过程中,如果长大的子细胞与母细胞并不分离,就会形成藕节状的假菌丝。酵母菌的子囊孢子生成与否及其形状,是酵母菌分类上的重要依据。一部分酵母菌只有在最适条件下,才能观察到形成的子囊孢子。不同种属的酵母菌,形成子囊孢子的条件不同。葡萄糖-醋酸盐培养基特别有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。本实验以生长在此培养基上的酿酒酵母为材料,进行子囊孢子的观察。2实验原理2实验原理本实验通过亚甲蓝染色制成水浸片和水-碘水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。亚甲蓝是一种无毒性染料,其氧化型是蓝色的,而还原型是无色的。用它对酵母的活细胞进行染色时,由于细胞内新陈代谢的作用,细胞内具有较强的还原能力,能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此,酵母的活细胞无色,而死细胞或代谢缓慢的老细胞,由于缺乏还原能力或还原能力极弱,会被亚甲蓝染成蓝色或淡蓝色。所以,亚甲蓝水浸片不仅可以观察酵母的形态,还可以进行细胞活性鉴定。但亚甲蓝的浓度、作用时间等对实验均有影响,应加以注意。霉菌菌丝较粗大,细胞易收缩变形,孢子也很容易飞散。因此,制标本时常使用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片具有以下特点:细胞不变形;具有杀菌防腐作用,且不易干燥,能保持较长时间;溶液本身呈蓝色,有一定染色效果。霉菌形态比细菌、酵母菌复杂,个体比较大,具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。霉菌营养体的基本形态单位是菌丝,包括有隔菌丝和无隔菌丝。营养菌丝分布在营养基质的内部,气生菌丝伸展到空气中。除基本结构外,有些霉菌还有一些特化形态,例如假根、匍匐菌丝、吸器等。霉菌的繁殖菌丝体不仅包括无性繁殖体,例如分生孢子,孢子囊等,包裹其内或附着其上的各类无性孢子;还包括有性繁殖结构,例如子囊果,其内形成有性孢子。在观察时要注意细胞的大小,菌丝构造和繁殖方式。霉菌自然生长状态下的形态,常用载玻片培养法进行观察。此法是将霉菌孢子接种于载玻片上的适宜培养基上,培养后用显微镜观察。此外,为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态,还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。此法利用玻璃纸的半透膜特性和透光性,将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上,然后将长菌的玻璃纸剪取一小片,贴放在载玻片上,用显微镜进行观察。3实验材料及设备3.1菌种酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)试管斜面菌种1个、黑根霉(Rhizopusnigricans)平板菌种1个、总状毛霉(Mucorracemosus)平板菌种1个、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)平板菌种1个、黑曲霉(Aspergillusniger)平板菌种1个。3.2培养基(1)YEPD液体培养基酵母粉10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,蒸馏水1000mL,培养基pH=5.8~6.2。(2)McLary培养基(酵母产子囊孢子培养基)葡萄糖1g,醋酸钠8.2g,氯化钾1.8g,酵母膏2.5g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,溶解后分装试管,115℃湿热灭菌15min。(3)察氏培养基硝酸钠3g,磷酸氢二钾1g,硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g,氯化钾0.5g,硫酸亚铁0.01g,蔗糖30g,琼脂20g,蒸馏水1000mL。3实验材料及设备3.3染色剂孔雀绿染液、0.1%亚甲蓝液

、乳酸石炭酸棉蓝染色液。3.4仪器设备接种环2支、接种针2支、酒精灯2个、载玻片1盒、盖玻片1盒、无菌吸头10个(1000μL)、无菌镊子4个、恒温培养箱1台、解剖针4个、解剖刀1包、灭菌培养皿(内有U形棒1个、载玻片1片、盖玻片2片、滤纸1片),玻璃纸5张、滤纸1盒、普通光学显微镜2台、擦镜纸1本、吸水纸1盒。4实验步骤4.1酵母形态观察(1)水浸片法观察酵母细胞取一洁净载玻片,在载玻片上滴一滴无菌水,用接种环挑取少许啤酒酵母菌苔置于无菌水中,用接种环轻轻划动,使其分散成云雾状薄层;另取一盖玻片,小心覆盖菌液。在显微镜下观察酵母细胞的形状、大小及出芽方式。(2)酵母菌死活细胞的检查在载玻片上加一滴0.1%的亚甲蓝液,用接种环挑取少许酵母菌苔置于亚甲蓝液滴中,用接种环划动,使其分散均匀,加盖玻片,在显微镜下观察。死细胞呈蓝色,活细胞无色。(3)子囊孢子的观察将啤酒酵母接种于YEPD液体培养基中,于28~30℃恒温箱中培养24h,连续转接培养3次,再接种到McLary斜面培养基上,25℃培养2周左右。用接种环挑取少许生长在McLary斜面培养基上的啤酒酵母于载玻片上,制成涂片,干燥、固定、染色后,观察子囊孢子形状和特点,以及每个子囊内的孢子数等。孔雀绿染色法:加数滴孔雀绿染液于固定涂片处,1min后水洗,加95%乙醇30s,水洗,最后用0.5%番红复染30s,水洗去染色液,最后用吸水纸吸干。制片干燥后,镜检,子囊孢子呈绿色,子囊为粉红色。4实验步骤4.2霉菌形态的观察于洁净载玻片上,滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液,用解剖针从霉菌菌落的边缘处取少量带有孢子的菌丝置于染色液中,再细心地将菌丝挑散开,然后小心地盖上盖玻片,注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察,必要时再换高倍镜。①青霉形态观察:观察青霉的菌丝及其分隔情况、分生孢子着生情况,辨认分生孢子梗、小梗及分生孢子。②毛霉形态观察:观察毛霉孢子的形状、颜色、大小、孢子囊、囊轴的形状,有无假根和葡萄菌丝。③曲霉形态观察:观察黑曲霉的分生孢子梗、足细胞、分生孢子的形状、颜色、大小、顶囊的形状、小梗排列、隔膜④根霉形态观察:观察根霉的假根、匍匐枝、孢子囊柄、孢子囊以及孢囊孢子。4.2.1水浸片观察法4实验步骤4.2霉菌形态的观察(1)将略小于培养皿底内径的滤纸放入皿内,再放上U形玻璃棒,其上放一洁净的载玻片,然后将二个盖玻片分别斜立在载玻片的两端,盖上皿盖,把数套(根据需要而定)如此装置的培养皿叠起,包扎好,用1.05kg/cm2,121.3℃灭菌20min或干热灭菌,备用。(2)将6~7mL灭菌的马铃薯葡萄糖培养基倒入直径为9cm的灭菌平皿中,待凝固后,用无菌解剖刀切成0.5~1cm2的琼脂块,用刀尖铲起琼脂块放在已灭菌的培养皿内的载玻片上,每片上放置2块。(3)用灭菌的尖细接种针或装有柄的缝衣针,取(肉眼方能看见的)一点霉菌孢子,轻轻点在琼脂块的边缘上,用无菌镊子夹着立在载玻片旁的盖玻片盖在琼脂块上,再盖上皿盖。(4)在培养皿的滤纸上,加入无菌的20%甘油数毫升,直至滤纸湿润即可,如图5-5所示。然后将培养皿置于28℃的恒温培养箱中培养一段时间。培养完成后,取出载玻片并置于显微镜下进行观察。4.2.2载玻片培养法5结果与分析(1)把观察到的酵母及子囊孢子绘图,并注明各部分名称。(2)把观察到的各种霉菌绘图,并注明各部分结构名称。列表(表5-1)比较根霉、毛霉、青霉和曲霉在形态结构上的异同。6思考题①在酵母菌死活细胞的观察中,使用亚甲蓝液有何作用?②酵母菌与细菌细胞形态、结构上有何区别?如何区别长在同一平板上酵母菌和细菌?③霉菌水浸片观察为什么要用乳酸石炭酸棉蓝染色液?实验五

微生物的分离和计数1实验目的了解微生物分离和计数的原理,掌握稀释涂布平板法和平板划线法分离微生物的方法。从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合待分离微生物生长的条件,如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂,造成只利于该微生物生长,而抑制其他微生物生长的环境,从而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落,通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此,可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是,从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此,纯培养的确定除观察其菌落特征外,还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。土壤是微生物生活的大本营,其所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所,是发掘微生物资源的重要基地,可以从其中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。2实验原理3实验材料及设备3.1培养基高氏一号合成平板培养基12个,牛肉膏蛋白胨平板培养基12个,孟加拉红平板培养基12个,培养基配方见实验一。3.2溶液青霉素或链霉素母液(抑制细菌),制霉菌素母液(抑制真菌),10%苯酚液(抑制细菌和霉菌),盛9mL无菌水的试管,盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。3.3样品土样3.4仪器设备高压蒸汽灭菌锅、旋涡混合器、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台无菌涂布器、无菌吸头10个(1000μL)、酒精灯2个、记号笔2支、打火机、试管架1个、一次性无菌涂布棒10支。4实验步骤4.1准备工作将培养基、接种工具和其他用品全部在超净工作台上摆好。进行紫外线灭菌30min,关闭紫外灯。20~30min后打开照明灯,进行操作。接种前用酒精棉球将双手进行消毒。4.2稀释涂布平板法(1)采样选择合适的采样地点,去除表层5cm的土壤,取5~15cm深处的土壤。使用无菌器具规范采样几十克,装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好,记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。(2)制备土壤稀释液称取土样10g,放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,振摇约20min,使土样与水充分混合,将细胞分散。用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液加入盛有9mL无菌水的大试管中,充分混匀。然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL加入另一盛有9mL无菌水的试管中,混合均匀,以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液(图5-6)。4实验步骤4.2稀释涂布平板法(3)涂布将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀释度。然后用无菌吸管分别从含有10-4、10-5和10-6稀释度的土壤稀释液中各吸取0.1或0.2mL,小心地滴在对应平板培养基表面的中央位置。用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面,将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展,使之分布均匀。室温下静置5~10min,使菌液浸入培养基。(4)培养将高氏一号平板培养基和孟加拉红平板培养基倒置于28℃培养箱中培养3~7d,牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养2~3d。(5)挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上,分别置于28℃和37℃培养箱培养。若发现有杂菌,需再一次进行分离、纯化,直到获得纯培养。4.3稀释倾注法(混菌法)其他步骤与涂布法相同,只是稀释后吸取菌液滴加到无菌培养皿内。将已灭菌的固体培养基融化,待冷却至45~50℃左右,分别倾入已盛有10-5、10-6、10-7土壤稀释液的无菌培养皿内。注意:温度过高易将菌烫死,皿盖上冷凝水太多,也会影响分离效果;低于45℃培养基易凝固,平板易出现凝块、高低不平。倾倒培养基时注意无菌操作,要在火焰旁进行。左手拿培养皿,右手拿锥形瓶底部,左手同时用小指、无名指和手掌将棉塞拔开,灼烧瓶口,用左手大拇指将培养皿盖打开一条缝,至瓶口正好伸入,倾入培养基12~15mL。将培养皿在桌面上轻轻前后左右转动,使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀。混匀后静置于桌上。4实验步骤4.4平板划线法(1)划线在近火焰处,左手拿皿底,右手拿接种环,挑取上述10-1的土壤稀释液一环在平板上划线。划线的方法很多,但无论采用哪种方法,其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释,使之形成单个菌落。用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环,先在平板培养基的一边作第一次平行划线3~4条,再转动培养皿约70°角,并将接种环上剩余物烧掉,待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线,再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后,盖上培养皿盖,倒置于培养箱中培养。

注意划线要以手腕的力量轻轻划,不要划破培养基。线条要平行密集,充分利用平板表面积(图5-7)。(2)挑菌落同稀释涂布平板法,一直到分离的微生物认为纯化为止。5结果与分析(1)分别记录并描述稀释涂布平板法、平板划线法分离的微生物生长情况和培养特征。检查所采用的稀释涂布平板法和平板划线法是否成功地得到了单菌落。如果没有成功,请分析可能的原因,并重新进行实验。(2)计算每克土壤中含有的细菌数、放线菌数和真菌数。6思考题①如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养?请写出实验的主要步骤。②试设计一个实验,从果园土壤中分离酵母菌。实验六

物理、化学因素对微生物生长的影响1实验目的(1)观测氧气、温度、紫外线、pH、化学药品对微生物生长的影响。(2)掌握理化因素对微生物生长的影响的研究方法。(3)了解不同微生物对不良环境的抵抗力。各种细菌对氧的要求不同。根据它们对氧的需求或耐受程度,可将细菌分为四个类型:专性好氧菌:必须在有氧的情况下生存,例如枯草芽孢杆菌;专性厌氧菌:要求在完全无氧的条件下生长繁殖,分子氧对它们有害,例如破伤风梭菌、丙酮丁醇梭菌等;兼性厌氧菌:无论在有氧或无氧的条件下均能生长,一般在有氧情况下生长快,例如酵母菌、肠道杆菌等;微好氧菌:适宜在氧浓度较低的环境中生长,例如链球菌属中的个别种。温度是影响微生物生长与存活的重要因素之一。当微生物处于最适生长温度时,会促进生长;不适宜的温度可能导致细菌的形态和代谢的改变,甚至使微生物的蛋白质凝固变性而导致死亡。不同的微生物对温度的抵抗力不同。例如,大肠杆菌在60℃下10min内致死,而枯草芽孢杆菌在100℃下6~17min才会致死。这是因为芽孢不仅含水量低,有厚而致密的壁,而且还含有特殊的物质———吡啶二羧酸,所以芽孢杆菌的抗热能力比大肠杆菌强。2实验原理2实验原理紫外线主要作用于细胞内的DNA,轻则使微生物发生突变,重则造成微生物死亡。紫外线照射的剂量与所用紫外灯的功率(瓦数)、照射距离和照射时间有关。紫外线透过物质的能力弱,一层黑纸足以挡住紫外线的通过。抑制或杀死微生物的化学因素种类极多,用途广泛,性质各异。其中,表面消毒剂和化学药品最为常见。表面消毒剂在极低浓度时,常常表现为对微生物细胞的刺激作用;随着浓度的逐渐增加,就相继出现抑菌和杀菌作用,对一切活细胞都表现活性。化学药品主要包括一些抗代谢物,例如抗生素。在微生物实验中,pH的变化也对微生物生长有很大影响。常用的化学消毒剂包括重金属及其盐类、酚、醇、醛等有机化合物,以及碘、表面活性剂等。它们的杀菌或抑菌作用主要通过使菌体蛋白质变性,或者与酶的-SH基结合,使酶失去活性。研究化学因素对微生物生长的影响(如化学药品、消毒剂的杀菌作用、植物活性成分的抑菌作用等),通常将微生物接种在含一定剂量上述物质的培养基中,通过测定微生物的生长抑制情况评估其效应。3实验材料及设备3.1菌种大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、丙酮-丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、酿酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)各1支24h斜面培养物。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母18~20h新鲜培养液各1支。3.2化学药品土霉素1支、新洁尔灭1瓶、复方新诺明1盒、汞溴红(红药水)1瓶、结晶紫液(紫药水)1瓶。3.3仪器设备恒温培养箱1台、恒温水浴锅1台、超净工作台1台、紫外可见分光光度计1台、游标卡尺1个、无菌培养皿10套、无菌圆滤纸片10片、镊子2支、无菌水1瓶、无菌滴管10支、紫外灯1个、黑纸2张、试管10支、接种针2个、无菌涂布器10支、无菌吸头10个。4实验步骤4.1氧气对微生物生长的影响(1)制备试管培养基制作100mL牛肉膏蛋白胨半固体培养基,分装在10支试管中,灭菌备用。(2)接种与培养取上述试管7支,用穿刺接种法分别接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和丙酮-丁醇梭菌,每种菌接种2支试管培养基,剩余1支作为空白对照。将试管放在37℃恒温箱中培养48h。注意:穿刺接种到上述培养基中时,必须穿刺到管底。(3)观察结果取出实验样品,观察各菌株在培养基中生长的部位。将各菌株生长情况填在表5-2中。4实验步骤4.2温度对微生物生长的影响(1)配制培养基配制牛肉膏蛋白胨液体培养基(标记为A)和YEPD液体培养基(标记为B),每管装5mL,灭菌备用。(2)选择实验温度取16支A培养液试管和8支B培养液试管,分别标明20℃、28℃、37℃和45℃四种温度,每种温度下A培养基4管,B培养基2管。(3)接种与培养向A试管中分别接入培养18~20h的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌液各0.1mL,混匀;同样,向B试管中接入培养18~20h的酿酒酵母菌液各0.1mL,混匀;每个处理设2个重复,并进行标记。将试管置于标记的温度下振荡培养24h。(4)观察结果根据菌液的混浊度判断大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌生长繁殖的最适温度。将观察结果填在表5-3中。4实验步骤4.3微生物对高温的抵抗力(1)配制培养基配制牛肉膏蛋白胨液体试管培养基,取8支试管培养基,按顺序从1到8编号。(2)接种在4支试管(例如1、3、5、7号)中各接入培养48h的大肠杆菌菌悬液0.1mL,其余4支试管(2、4、6、8号)中各接入培养48h的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1mL,混匀。(3)高温水浴将8支已接种的培养液试管同时放入100℃水浴中。10min后取出1至4号试管,再过10min后取出5至8号试管。各试管取出后立即用冷水冷却。(4)培养将各管置于36℃培养箱中培养24h。(5)观察结果依据菌株生长状况记录结果。以“-”表示不生长,“+”表示生长,并以“+”“++”和“+++”表示不同生长量。将各菌株生长情况填在表5-4中。4实验步骤4.4紫外线对微生物的影响(1)培养基标记取牛肉膏蛋白胨平板培养基3个,分别标明大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等实验菌的名称。(2)接种分别用无菌吸管取培养18~20h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌菌