生物工程实验指导-课件 06-细胞生物学实验

细胞生物学实验实验一

普通显微镜及其使用(装片观察)实验二

细胞膜的渗透性实验三

线粒体和液泡系的超活染色与观察实验四

叶绿体的分离与荧光观察实验五

线粒体的分离与观察实验六DNA的Feulgen染色方法实验七

植物染色体标本制备与观察实验八

植物原生质体的制备实验九

动物染色体标本制备与观察实验十

核仁组成区的银染色法实验一

普通显微镜及其使用(装片观察)1实验目的(1)掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法和保护要点。(2)参观并了解其他各类显微镜。2实验原理普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。3实验材料及设备(1)介绍普通光学显微镜的构造机械部分:镜座、镜臂、镜柱、镜筒、物镜转换器、载物台、准焦螺旋、标本推进器。光学部分:目镜、物镜、反光镜、聚光器。(2)油镜的原理及使用方法原理:油镜头的晶片细小,进入镜中的光线亦少。光线经聚光器,通过载玻片进入油镜时,由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样,光线因折射而损失,使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上与玻璃折光系数相同的香柏油,光线可以直接进入镜头,不发生折射,视野明亮,便于观察。使用方法:在载玻片上有菌影的地方滴1~2滴香柏油,然后将载玻片放置在载物台中央。从侧面观察,慢慢降低油镜,使其浸入香柏油中,镜头几乎接触标本。用左眼在接目镜观察,同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒,直至能模糊看到物象。再转动微调螺旋,直至图像清晰为止。(3)如何维护显微镜机械部分的维护:定期检查机械部件是否松动或损坏,及时进行调整和维修。光学部分的维护:使用后,用擦镜纸轻轻擦拭镜头,避免使用粗糙的纸张或布料,以免划伤镜头。(4)观察几种细菌标本片(5)观察相差显微镜和荧光显微镜※注意事项:观察过程中:镜头一旦离开油,就无法看清图像,需重新按实验步骤操作。油镜使用后的清洁:油镜使用过后,应立即用擦镜纸擦拭镜头。若油渍已干,可用蘸有香柏油的二甲苯擦拭镜头,再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。4思考题①油镜的原理是什么?②光线强弱如何调节?与哪些部件有关?实验二

细胞膜的渗透性1实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。将红细胞放入数种等渗溶液中,由于红细胞对各种溶质的通透性不同,有的溶质可以渗入,有的不能渗入。渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压,所以促使水分进入细胞,引起溶血。由于溶质渗入的速度各不相同,因此溶血时间也不相同。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料羊血。3.2仪器设备烧杯(50mL)、试管(1~10cm)、移液管(10mL)、试管架。3.3试剂0.17mol/L氯化钠、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸铵、0.17mol/L硝酸钠、0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸钠、葡萄糖、甘油、乙醇、丙酮。4实验步骤(1)羊血细胞悬液的制备取一个50mL烧杯,加入1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠溶液,混合均匀,形成一种不透明的红色液体,即稀释的羊血细胞悬液。(2)低渗溶液取一支试管,加入10mL蒸馏水,再加入1mL稀释的羊血细胞悬液,注意观察溶液颜色的变化:若溶液由不透明的红色逐渐变澄清,说明红细胞发生破裂,造成100%红细胞溶血,使光线比较容易透过溶液。(3)羊红细胞的渗透性①取一支试管,加入0.17mol/L氯化钠溶液10mL,再加入1mL稀释的羊血细胞悬液,轻轻摇动,观察溶液颜色有无变化,判断有无溶血现象,并分析原因。②取一支试管,加入0.17mol/L氯化铵溶液10mL,再加入1mL稀释的羊血细胞悬液,轻轻摇动,观察溶液颜色有无变化,判断有无溶血现象,并分析原因。③分别在另外8种等渗溶液中进行同样实验,步骤同②。5结果与分析对实验结果进行比较和分析。实验三

线粒体和液泡系的超活染色与观察活体染色是一种能够使生活有机体的细胞或组织特异性着色,但对活样本没有毒害作用的染色方法。其目的是显示生活细胞内的某些结构,同时不影响细胞的生命活动,避免产生任何物理或化学变化,从而防止细胞死亡。活体染色技术可用于研究细胞在生活状态下的形态结构、生理状态以及病理状态。通常将活体染色分为体内活体染色和体外活体染色两类。体外活体染色又称超活染色,是指从活的动植物中分离出部分细胞或组织小块,用染料溶液进行浸染。染料被选择性地固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊部分,主要是依靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子,酸性染料的胶粒表面带阴离子,而动植物细胞被染色的部分本身也带阴离子或阳离子,这样,它们彼此之间就会产生吸引作用,从而相互结合。但并非所有染料都适用于活体染色。理论上应选择对细胞无毒性或毒性极小的染料,并且使用时需要配成稀淡的溶液。一般来说,碱性染料最为适用,这可能是因为它们具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性,易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(JanusGreenB)和中性红(NeutralRed)是两种重要的碱性活体染料。1实验目的(1)观察动、植物活细胞内线粒体和液泡系的形态、数量与分布。(2)学习细胞器的超活染色技术。线粒体是细胞内重要的细胞器,是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量,主要是通过线粒体的呼吸作用提供的。詹纳斯绿B是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中,染料被还原,成为无色状态。中性红为弱碱性染料,对液泡系(高尔基体)的染色具有专一性。它能够将活细胞中的液泡系染成红色,而细胞核与细胞质则完全不着色,这种专一性染色效果可能是由于液泡中某些蛋白质与染料的相互作用。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料人口腔上皮细胞,小麦种子或黄豆幼根根尖。3.2仪器设备显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘、载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。3.3试剂(1)Ringer溶液氯化钠0.85g(变温动物用0.65g),氯化钾0.25g,氯化钙0.03g,蒸馏水100mL。(2)10%和1/3000中性红溶液称取0.5g中性红溶于50mLRinger溶液中,稍加热(30~40℃)以加速溶解。用滤纸过滤,装入棕色瓶中,置于暗处保存,以防止氧化沉淀,避免失去染色能力。临用前,取已配制的1%中性红溶液1mL,加入29mLRinger溶液混匀,装入棕色瓶备用。(3)1%和1/5000詹纳斯绿B溶液称取50mg詹纳斯绿B,溶于5mLRinger溶液中,稍加微热(30~40℃),使其溶解。用滤纸过滤后,即为1%原液。取1%原液1mL,加入49mLRinger溶液,即成1/5000工作液。装入瓶中备用,最好现用现配,以保持其充分氧化能力。4实验步骤(1)准备载玻片:将清洁的载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上。(2)滴加染液:在载玻片上滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。(3)刮取细胞:用牙签在口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞。(4)混合细胞与染液:将刮下的黏液状物放入载玻片上的染液滴中。(5)染色:染色10~15min(注意不可使染液干燥,必要时可再滴加染液)。(6)制片与观察:盖上盖玻片,用显微镜进行观察。4.1人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察(1)取材:取豆芽的根尖。(2)切片与染色:用刀片纵切根尖,放入中性红染液滴中,染色5~10min。(3)清洗与制片:吸去染液,滴一滴Ringer液。(4)压片与观察:盖上盖玻片,用镊子轻轻下压盖玻片,使根尖压扁,便于观察。4.2植物细胞液泡系的超活染色与观察5结果与分析在低倍镜下,选择形态平展的口腔上皮细胞。然后,换高倍镜或油镜进行详细观察。可见扁平状上皮细胞的细胞核周围胞质中,分布着被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状结构,这些结构即为线粒体(图6-1)。5.1人口腔上皮细胞线粒体的观察结果5结果与分析在高倍镜下,先观察根尖部分的生长点细胞,可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡,这些是初生的幼小液泡(图6-2)。然后,从生长点向伸长区观察,在一些已分化长大的细胞内,液泡的染色较浅,体积增大,数目变少。在成熟区细胞中,一般只有一个淡红色的巨大液泡,占据细胞的绝大部分,将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。5.2植物细胞液泡系的观察结果5结果与分析①打印人口腔上皮细胞线粒体的形态与分布图片。②打印豆芽根尖细胞液泡系的形态与分布图片。6思考题①结合实验结果描述动物活细胞线粒体的形态、数量与分布。②结合实验结果描述植物细胞液泡系的形态、数量与分布。③详细说明细胞器的超活染色技术。5.3实验报告要求实验四

叶绿体的分离与荧光观察1实验目的(1)通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。(2)观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法。将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后,在3000r/min的条件下离心5min,即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行。如果在室温下,要迅速分离和观察。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时,将受到许多因素的影响,如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间,必要时立即拍照。另外,在制作荧光显微标本时,最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油,以避免背景荧光的干扰。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料新鲜菠菜。3.2仪器设备普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、烧杯2个(500mL)、量筒1个(250mL)、滴管20支、刻度离心管20支(10mL)、试管架5个、纱布若干、无荧光载玻片和盖玻片各4片。3.3试剂0.35mol/L氯化钠溶液,0.01%吖啶橙(AcridineOrange,AO)染液。4实验步骤(1)选取新鲜的嫩菠菜叶,洗净擦干后去除叶脉,称30g放入150mL0.35mol/LNaCl溶液中,装入组织捣碎机。(2)利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀浆3~5min。(3)将匀浆用6层纱布过滤至500mL烧杯中。(4)取滤液4mL,在1000r/min下离心2min。弃去沉淀,保留上清液。(5)将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液,沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。(6)将沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。(7)取叶绿体悬液一滴,滴于载玻片上,加盖玻片后,即可在普通光镜和荧光显微镜下进行观察。①在普通光镜下观察叶绿体的形态和分布。②在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。③在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光:取叶绿体悬液一滴,滴在无荧光载玻片上,再滴加一滴0.01%吖啶橙染液,加盖玻片后,即可在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光。4.1叶绿体的分离与观察4实验步骤用剃须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面,置于载玻片上。滴加1~2滴0.35mol/L氯化钠溶液,轻轻盖上盖玻片后轻压。将制备好的切片置于显微镜下进行观察。①在普通光镜下观察切片,记录细胞的形态和结构。②在荧光显微镜下观察切片的直接荧光。③在荧光显微镜下观察切片的间接荧光:向手切片上滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液,染色1min,洗去余液,加盖玻片后,在荧光显微镜下观察间接荧光。4.2菠菜叶手切片观察5实验结果(1)在普通光镜下,可以看到叶绿体为绿色橄榄形。在高倍镜下,可以看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒,即基粒。(2)以Olympus荧光显微镜为例,在使用B激发滤片(蓝色)、B双色镜和O530阻断滤片(橙色)的条件下,叶绿体发出火红色荧光。(3)加入吖啶橙染液染色后,叶绿体可发出橘红色荧光,而其中混有的细胞核则发绿色荧光。5.1叶绿体的分离和观察结果(1)在普通光镜下可以看到三种细胞:①表皮细胞:边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。②保卫细胞:构成气孔的成对存在的肾形细胞(图6-3)。③叶肉细胞:排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形,在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。(2)在荧光显微镜下观察,叶绿体发出火红色荧光,但其荧光强度比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光,两保卫细胞内的火红色叶绿体环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量比叶肉细胞少(图6-4)。(3)用吖啶橙染液染色后,叶绿体则发出橘红色荧光,细胞核发出绿色荧光,气孔仍为绿色(图6-5)。5.2菠菜叶手切片观察结果5实验结果6思考题①通过查阅文献,说明细胞器分离的方法有哪几种。②通过实验观察,说明叶绿体的直接荧光和间接荧光。③分离细胞组分时,为什么要加入0.35mol/L氯化钠溶液?实验五

线粒体的分离与观察1实验目的(1)初步掌握用差速离心法分离大鼠肝细胞线粒体的方法。(2)学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。线粒体是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的能源物质———脂肪、糖、部分氨基酸,在此进行最终的氧化分解,并通过氧化磷酸化偶联反应生成ATP,为细胞生理活动提供能量。目前,对线粒体结构与功能的研究通常在离体的线粒体上进行。制备线粒体时,可将组织匀浆液悬浮在特定悬浮介质中,通过差速离心法进行分离。在一定的离心场中(设定离心机的转速),不同大小的颗粒沉降速度由其密度、半径及悬浮介质黏度决定。在均匀的悬浮介质中离心一段时间后,组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。通过逐步增加离心力和延长离心时间,可使颗粒按大小、密度分批沉降至离心管底部,从而实现分级收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核,其次是线粒体,其他更轻的细胞器及大分子可依次分离。悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液,它比较接近细胞质的分散相,在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性。在pH为7.2的条件下,亚细胞组分不容易重新聚集,有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持在4℃,避免酶失活。线粒体的鉴定采用詹纳斯绿超活染色法。2实验原理3实验材料3.1样品小鼠30只(每名学生1只)。3.2器材冷冻高速离心机、解剖刀剪、小烧杯(100mL)、冰浴、漏斗(75mm)、尼龙网、玻璃匀浆器、pH计、高压灭菌锅等。3.3试剂及其配制方法试剂:氯化钠、詹纳斯绿B、盐酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、蔗糖、甲醇、冰醋酸、双蒸水、甘油、吉姆萨粉、KH2PO4、Na2HPO4。溶液配制方法:①0.9%灭菌的生理盐水:将0.9g氯化钠溶于100mL双蒸水中,灭菌处理。②1%詹纳斯绿B染液:将1g詹纳斯B溶解于100mL0.9%灭菌生理盐水中。③0.25mol/L蔗糖+0.01mo1/LTris-HCl缓冲液(pH=7.4):将0.1mol/LTris10mL和0.1mol/L盐酸8.4mL混合,加入双蒸水至总体积100mL,然后加蔗糖至0.25mol/L。④0.34mol/L蔗糖+0.01mol/LTris-HCl缓冲液(pH=7.4):参照步骤③,调整蔗糖的浓度至0.34mol/L。⑤固定液:按9∶1的比例混合甲醇和冰醋酸。⑥吉姆萨染液(原液):吉姆萨粉0.5g,甘油33mL,纯甲醇33mL。先将吉姆萨粉置于研钵内,加少量甘油研磨至无颗粒,再加入剩余甘油混匀,置于56℃左右保温2h,使其充分溶解,最后加入甲醇混匀,制成吉姆萨原液,存放于棕色瓶中。⑦吉姆萨染液(应用液):使用时,吸出1mL原液,用9mL1/15mol/L磷酸盐缓冲液进行10倍稀释。⑧1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.8):将1/15mol/LKH2PO450mL和1/15mol/LNa2HPO450mL混合。4实验步骤(1)制备小鼠肝细胞匀浆实验前小鼠空腹12h,拉颈处死,剖腹取肝,迅速用生理盐水洗净血水,用滤纸吸干。称取肝组织2g,剪碎,用预冷至0~4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0~4℃条件下,按每克肝加9mL冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化,蔗糖溶液应分数次添加。匀浆液用200目铜筛过滤备用。(2)离心先将9mL0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管,然后沿管壁小心地加入9mL肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻高速离心机按图5-1顺序进行差速离心。(3)分离物鉴定①取细胞核沉淀1滴涂片,将涂片浸入甲醇-冰醋酸液固定15min,充分吹干后,滴加1滴吉姆萨染液(应用液)染色10min。用自来水冲洗,吹干后进行镜检。②取线粒体沉淀1滴涂片,滴加1%詹纳斯绿B染液染色20min,覆上盖玻片后进行镜检。※注意事项:①注意尽可能先充分剪碎肝组织,缩短匀浆时间。整个分离过程不宜过长,以保持组分的生理活性。最好在0~4℃或冰浴中进行。②将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入,同时及时离心,以防匀浆液中的颗粒自然下沉过快,影响后面的离心分层效果。③吉姆萨染液的应用液应在实验时临时配制,以确保最佳效果。不可使用过期的应用液。5结果与分析实验结果显示细胞核呈紫红色,上面附着少量胞质及浅蓝色碎片。线粒体呈蓝绿色,且线粒体形态多样,可能为短棒状、哑铃状或线状。通过对实验结果的分析,我们可以更好地理解线粒体分离过程,并评估线粒体的纯度和活性。6思考题①在进行线粒体提取分离过程中,为什么需要在0~4℃的条件下进行?②将线粒体沉淀制成涂片,用吉姆萨染液染色,检查是否混杂细胞核和胞质碎片,估计分离所得线粒体的纯度。要获得高活性的线粒体,在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题?根据你的实际体会,写出操作注意事项及改进方法。③分离介质0.25mol/L及0.34mol/L缓冲蔗糖溶液,哪一种在下层?有什么作用?实验六DNA的Feulgen染色

方法1实验目的学习DNA的Feulgen染色方法,观察染色结果,并了解其反应原理。DNA经过弱酸(1mo/L盐酸)水解后,其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键被打开,使得脱氧核糖的一端形成游离的醛基。这些醛基在原位与Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)反应,形成紫红色的化合物,从而使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是由于反应产物的分子内含有醌基,醌基是一个发色团,因此具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理,以抽提细胞中的DNA,得到阴性反应,从而证明Feulgen反应的专一性。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料洋葱、植物根尖、叶片表皮等。3.2仪器设备显微镜、恒温水浴锅、镊子、解剖针、刀片、温箱、天平(精确度0.1g)、载玻片、盖玻片、吸水纸、吸管、小烧杯(50mL)、量筒。3.3试剂及其配制方法①卡诺氏固定液、1%亮绿水溶液。②1mol/L盐酸溶液:准确量取86.2mL浓盐酸(密度为1.18g/cm3),慢慢加到913.8mL蒸馏水中。③Schiff试剂:精确称取1g碱性品红,在200mL蒸馏水中煮沸5min,然后冷却至50℃。过滤滤液,并将滤液转入棕色的试剂瓶中,加入20mL盐酸(1mol/L),继续冷却至25℃。加入1g偏亚硫酸氢钠,振荡使其充分溶解。将试剂瓶置于黑暗低温处或冰箱内(4℃左右)保存18~24h。得到的无色透明或浅黄色溶液即为Schiff试剂溶液。若溶液中仍有不同程度的红色未褪去,可加入活性炭强烈振荡,然后在低温下静置过夜,过滤后备用。密封瓶口,在5℃以下冰箱内避光保存,可以保存半年。④漂洗液:在200mL蒸馏水中,加入10mL1mol/L盐酸和10mL10%偏亚硫酸氢钠水溶液(或1g固体)。此液应在临用前配制。4实验步骤(1)材料固定取1支小烧杯,倒入10mL卡诺氏固定液。取洋葱鳞茎,用镊子夹取一块表皮,置于小烧杯中固定15min。(2)水解将固定好的洋葱表皮分装到若干个烧杯中,用蒸馏水冲洗三次,换用1mol/L盐酸溶液洗一次。加入5mL预热至60℃的1mol/L盐酸,放入恒温水浴锅中,在(60±0.5)℃恒温水浴锅中水解10min。然后用常温的1mol/L盐酸溶液洗一次,再用蒸馏水反复冲洗三次。(3)染色吸干水分,加入Schiff试剂,在避光条件下染色30min,然后用漂洗液漂洗三次,再用蒸馏水冲洗后备用。(4)压片观察取处理好的洋葱表皮置于载玻片上,加一滴1%亮绿水溶液对染10s,用滤纸吸去亮绿液,加一滴蒸馏水。置于显微镜下观察,染成紫红色的圆形或椭圆形结构即为细胞核DNA。视野中不但可以观察到DNA存在的部位及其分布情况,而且从紫红颜色的深浅,能判断出DNA的相对含量。※注意事项:①水解过程中,必须使用1mol/L稀盐酸进行冲洗,这一步骤至关重要,因为它可以去除切片上残留的试剂痕迹。如果使用蒸馏水冲洗,试剂本身进行可能发生水解,释放出的碱性品红可能使切片内所有嗜碱性物质染色,从而引起严重的错误判断。若切片较厚,可以延长水解时间,并且每次都需要更换洗涤剂②水解是实验成功的关键之一。温度应保持在(60±0.5)℃之间。如果温度过高或水解时间过长,可能导致水解过度,破坏糖与醛基之间的键,导致醛基流失到水解液中。相反,如果水解不足,不能暴露出潜在的醛基,也会影响颜色反应的出现。③1%亮绿水溶液复染时间不宜过长,以免染色过深,影响对DNA的观察。5结果与分析Feulgen染色后洋葱表皮的形态可以通过显微镜观察(图6-6和图6-7)。细胞核被Schiff试剂染成紫红色,而细胞质被亮绿水溶液染成绿色,使得在显微镜下观察时非常清晰。6思考题①结合实验原理,分析实验中的注意事项及实验成功的影响因素。②说明什么是Feulgen反应?③水解过程中为什么必须使用1mol/L稀盐酸冲洗?④说明Feulgen反应的基本原理和实验中应注意的事项。⑤打印显微镜下观察到的实验结果图。实验七

植物染色体标本制备与观察1实验目的学习植物染色体标本的制备技术;了解Feulgen反应的基本原理;学习Feulgen反应的操作方法和压片法;初步掌握细胞分裂各期的主要特点。核酸是生物体内最关键的组成成分之一,主要分为两大类:脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。这两类核酸在细胞内的分布和化学性质均有所不同。DNA主要存在于细胞核内的染色质中,或在有丝分裂过程中形成染色体内。而RNA则主要存在于细胞质和核仁中。但在染色质和染色体中也含有少量的RNA,核仁中同样含有少量的DNA。此外,在线粒体、叶绿体等细胞器中,除了RNA之外,也含有一定量的DNA。Feulgen反应的原理是利用DNA在经过弱酸(1mol/L盐酸)水解后,其上的嘌呤碱基和脱氧核糖之间的连接键被打开,从而在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。这些醛基在原位与Schiff试剂发生反应,生成含有醌基的化合物。由于醌基是一个发色团,因此能够使含有DNA的区域呈现紫红色。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料大麦、黑麦或小麦种子。3.2仪器设备培养皿、滤纸、恒温水浴锅、显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、刀片、吸水纸、量筒、滴管、小烧杯。3.3试剂0.1%秋水仙素、卡诺氏固定液、95%酒精、70%酒精、蒸馏水、5%三氯醋酸、1mol/L盐酸、Schiff试剂、亚硫酸水溶液、1%亮绿水溶液、蚕豆根尖。4实验步骤(1)将植物种子放在潮湿的滤纸上,在20℃条件下发芽,待胚根长至1~2cm时,切取0.5cm长的根尖部分。(2)预处理:将切下的根尖浸入0.1%秋水仙素液中,在室温下处理3~4h。(3)固定、水解及染色:使用卡诺氏固定液固定10~30min。依次通过95%酒精10min、70%酒精10min,然后用蒸馏水冲洗3~5min。对照组使用5%三氯醋酸,在90℃处理15min。使用1mol/L盐酸水溶解,然后用蒸馏水冲洗3~5min。再次使用1mol/L盐酸,在60℃下处理8min。使用Schiff试剂染色40~60min,再使用亚硫酸水溶液漂洗3次,每次5min,接着用自来水冲洗3次,每次5min。将染色后的根尖漂洗干净,选择染色效果好的材料。使用蒸馏水进行压片。在显微镜下进行观察。4.1植物染色体标本的制备将根尖放在载玻片上,用刀片切取根尖(约0.3cm),纵切根尖,加一滴水。用解剖针将根尖纵向分成若干小条,保留1~2小条,加盖玻片,用铅笔端轻轻敲击盖玻片,使细胞分离,压平呈云雾状。4.2压片法4实验步骤首先在低倍镜下,区分根尖的分生组织区及伸长组织区的细胞。然后在高倍镜下,观察细胞核的形态。注意观察样本中是否存在处于有丝分裂的细胞,如有,识别细胞分裂期的几个阶段,并描述其特征。※注意事项:①固定剂的选择:一般选用卡诺氏固定液。其他固定剂如Flemming固定剂及Champy固定剂也可用,但不能使用Bouin固定剂。②水解时间:水解时间一定要合适,不宜过长或不足,否则会影响实验结果。如果用卡诺氏固定液固定的材料,水解时间一般在8~15min。水解时间的长短要随不同的材料及不同的固定剂而定。③Schiff试剂的质量:实验时,要注意试剂颜色是否正常,有无SO2的气味。④洗涤剂的重要性:漂洗时,所用的亚硫酸水溶液,最好在每次实验前临时配制,以便保持较浓的SO2。⑤实验对照组:一定要做对照,以便说明实验结果的真实性。⑥操作过程中,用镊子夹取根尖的生长区部位,切勿夹取根冠部位。⑦压片过程中尽量使根尖分生组织细胞保持原来的分布状态。4.3蚕豆(或洋葱)根尖压片的观察5思考题①简述Feulgen反应的原理。②想要得到一张优质的Feulgen反应染色制片,制片过程中应注意哪些问题?③绘制细胞分裂图。实验八

植物原生质体的制备1实验目的(1)学习植物原生质体的分离制备技术,并观察原生质体的形态。(2)学习植物原生质体的融合技术,观察不同方法融合细胞的形态及变化。原生质体(protoplast)这一概念最早由德国植物学家约翰内斯·冯·汉斯坦于1880年提出。确切地说,食用菌原生质体是指细胞壁完全去除后,剩余的由细胞膜包裹的裸露细胞结构整体。植物的花瓣细胞经过纤维素酶和离析酶处理后,纤维素和果胶成分被破坏,导致原生质体脱离细胞壁进入培养液中。植物花瓣细胞中的大液泡含有大量色素,且不同细胞的色素不同,因此可以在不染色的情况下,通过颜色辨认不同细胞的原生质体,以及同种和异种细胞融合的情况。聚乙二醇(PEG)是一种高分子化合物,由于含有醚键而具有负极性,能够与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子足够长时,可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之黏连。PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥,因而促进黏连。在洗涤过程中,连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱,这将引起电荷的紊乱和再分布,从而引起原生质体融合。高Ca2+、高pH清洗则增加了质膜的流动性,因而大大提高了融合频率。洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料苗龄60d以上的烟草植株。3.2仪器设备显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管4支、直式漏斗(90mm)、300目尼龙网、离心管(10mL)、载玻片、盖玻片。3.3试剂洗涤液:0.6mol/L甘露醇,pH=5.6。4实验步骤(1)酶液的制备将纤维素酶(EAS-867)溶于0.5~0.7mol/L甘露醇内,加入10mmol/L氯化钙溶液作为稳定剂。酶溶解后,经4000r/min离心机沉淀原生质体,20min后取上清液。经针筒型过滤器,再经0.45μm微孔滤膜过滤后,在无菌箱内把酶液分装在三角烧瓶内,贮存在冰箱里备用。(2)材料准备选取生长在温室,苗龄60d以上的烟草植株,取其中上部全展叶,在日光下照射2h使其萎蔫。也可用温室生长的蚕豆叶进行相同处理,或用大田收获的胡萝卜,放在0℃以上低温环境中备用。萎蔫后的叶片浸泡在3%的漂白精片溶液中15~20min,之后用无菌水冲洗干净,再用无菌吸水纸吸干表面水分。(3)酶解用尖头镊子撕去叶片下表皮,剪成小块。胡萝卜则用刀片削去表皮和中柱,取用皮层部,切成小块。将1g以上材料放入盛有10mL酶溶液的培养皿中,加盖。在28~30℃下保温1.5~3h。(4)洗涤叶片或其他组织经酶解后会出现圆形的游离原生质体,原生质体悬浮液内含有未消化的组织、碎片、细胞和破裂的原生质体。用滤纸或尼龙布滤去粗杂质,再把原生质体悬浮液移到离心管,用手摇离心机转动2min,吸去上清液,再加入0.5mL甘露醇洗涤2~3次,最后得到较为纯净的原生质体,可以供进一步培养或用于其他实验。实验九

动物染色体标本制备与观察1实验目的(1)初步掌握动物骨髓染色体标本制备的基本过程,了解操作步骤和实验原理。(2)了解常用实验动物染色体的数目及特点。凡处于活跃增殖状态的细胞,或者经过各种处理后可进入分裂状态的细胞,均可用于染色体分析。在正常的动物体内,骨髓是处于不断分裂的组织之一。给动物注射一定剂量的秋水仙素,即可使许多处于分裂状态的细胞停滞于中期。然后采用常规空气干燥法制备染色体,即可得到大量可供分析的染色体标本。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料小鼠、无尾两栖类动物(蛙属或蟾蜍属)。3.2仪器设备水平离心机、显微镜、刻度离心管(10mL)、注射器(1mL)、载玻片、烧杯(400mL)、量筒(100mL)、试管架、镊子、剪刀、解剖刀、吸管、恒温水溶箱。3.3试剂①2%柠檬酸钠溶液:称取2g柠檬酸钠(柠檬酸三钠)溶解于100mL蒸馏水中。②1%柠檬酸钠溶液。③0.05mg/mL秋水仙素溶液。④吉姆萨原液(pH=6.8):吉姆萨粉1g,甘油(丙三醇)31mL,甲醇45mL。将染粉倒入研钵,加入几滴甘油,在研钵内研磨至无颗粒为止,此时再将全部剩余甘油倒入,放入60~65℃保温箱,保温2h后,加入甲醇搅拌均匀,保存于棕色瓶中备用。⑤0.067mol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.8):称取Na2HPO4·12H2O11.81g(或Na2HPO4·2H2O5.92g)和KH2PO4适量,溶解于蒸馏水中,定容至1000mL,调节pH至6.8。⑥1∶10吉姆萨磷酸盐缓冲液(pH=6.8)。⑦甲醇。⑧冰醋酸。⑨0.4%KCl溶液。4实验步骤小鼠骨髓细胞染色体的制备方法:①动物按4μg/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素,3~4h后杀死动物。②取出动物后肢的胫骨和股骨,剪去两端。③将0.6~1mL2%柠檬酸钠用1mL注射器接上5号针头注入骨髓腔,将骨髓细胞先冲入小碟内,取下注射针头,反复吸打骨髓细胞,使细胞团块分散,转入10mL离心管。④根据骨髓样本量,加入0.4%氯化钾溶液8~10mL,立即将离心管置于(37±0.5)℃恒温水浴箱中进行低渗处理10min。⑤以1000r/min离心8min。⑥弃上清液,沿离心管壁缓慢加入新配置的甲醇与冰醋酸(体积比为3∶1)固定液5mL,加固定液时需注意,避免冲动细胞团块。⑦加完固定液后,立即用吸管将细胞轻轻打匀,静置固定20min。如此反复固定2~3次,每次20min。⑧固定的细胞经离心后,吸去上层固定液,根据管底的细胞量,加入少量新配置的固定液,将细胞团块轻轻吸打成悬浊液。⑨在干净、湿、冷的载玻片上滴2~3滴上层细胞悬液,在酒精灯上文火烘干。⑩将玻片标本平放于支架上,细胞面朝上,每片滴加1∶10吉姆萨磷酸盐缓冲液3~4mL,染色10min。⑪在自来水管下细流冲洗数秒,去掉吉姆萨磷酸盐缓冲液,用小块纱布擦干玻片底