衡南土枇杷乙酸乙酯部位化学成分研究

引言衡南地区所产的“土枇杷”，实际上是粗糠树（EhretiamacrophyllaWall.）的果实。该植物隶属于紫草科（Boraginaceae）厚壳树属（Ehretia）；为落叶乔木，通常树高可达20米左右，该物种果实呈显著黄色外观，形态特征表现为近似球状结构，其果实直径区间约为10-15cm。随着内果皮发育进程的推进，成熟阶段会自然裂解形成两个独立分核单元，每个分核单元内部分化形成两枚胚性种子。果实成熟期通常集中于7-8月自然生长周期[1]。从地理分布格局分析，粗糠树（Euscaphisjaponica）在中华大地主要呈现片状分布特征，其核心分布区域涵盖西南、华东、华南三大地理单元及陕西省域。该物种对生境条件具有特定适应性，典型栖息环境包括海拔150-2300m区间的山地次生林带，以及具备深厚腐殖质层、持续保持土壤湿润状态且光照条件适中的山麓缓坡区域。粗糠树果实是一种药食两用的水果，俗称土枇杷，野枇杷，土枣子等[2]。依据《中国中药资源志要》记录，粗糠树（EhretiamacrophyllaWall）的枝、叶及果实具备清热解毒、消食健胃的成效。在土枇杷的产地湖南衡阳地区，鲜果实直接用于煮粥作为食疗；果实也被制成干果，煮水泡茶，具有润喉止咳、缓解咽喉炎及咳嗽症状的作用[3]。现有研究文献明确揭示，土枇杷中富含多酚类及黄酮类次生代谢产物。基于该植物化学成分的生物活性潜力，科研团队以果实为研究对象，系统构建了以总多酚含量、总黄酮含量及抗氧化效能为核心指标的活性物质分离纯化体系。通过现代色谱分离技术（如硅胶柱层析、制备型高效液相色谱等）与活性导向筛选策略相结合，成功从果实提取物中分离获得具有明确生物活性的单体化合物。当前，相关研究已揭示，在同属植物中存在纯天然活性成分，这些成分展现出显著的抗炎效能。然而，既往研究多集中于厚壳植物叶片，对于土枇杷中活性成分的挖掘及其性能评估尚显不足。在此背景下，陆建超与何陵玲两位学者分别从不同加工手段对土枇杷实抗氧化活性的影响角度出发，深入探讨了果实提取物中乙酸乙酯组分的分离纯化、抗氧化、抗细胞增殖及抗炎特性，从而为土枇杷实的深度加工技术开辟了新的研究路径。酚酸类物质作为一类结构相对简单的芳香族有机酸，其分子骨架包含苯环型酚基单元，同时共存羧酸基团（-COOH）与酚羟基（-OH）两类特征官能团。该类化合物在植物次生代谢产物中广泛分布，典型富集部位涵盖植物根茎、树皮、叶片及果实组织[4]。基于分子母核结构特征，酚酸类物质可划分为两大核心类型：其一为以苯甲酸为母核的C₆-C₁型酚酸，其二为以肉桂酸（3-苯基丙烯酸）为母核的C₆-C₃型酚酸。前者的结构特征表现为苯环通过单碳链连接羧酸基团，后者则通过三碳链形成苯丙烷骨架结构。这种结构差异直接导致两类酚酸在生物合成途径、理化性质及生物活性方面存在显著差异[5]。多酚类的化合物主要是由苯丙烷代谢合成，从生物合成的角度来看，多酚类化合物主要经由苯丙烷代谢途径合成。除了由O-甲基转移酶催化的甲基化反应外，次生代谢产物（如苯丙烷类化合物以及各类衍生的酚类化合物）的酰基化和糖基化是常见的化学修饰方式[6]。植物多酚的生理活性通常涵盖心脑血管疾病防治及消炎功效、抗氧化能力、抗肿瘤及抗癌变作用，以及抗病毒活性。多酚类化合物在国内外的研讨中同样的体现出了抗炎活性；例如能够抑制血小板的聚集与黏附，对脂质代谢中的酶具有抑制作用，并且还能够引起血管舒张。因此，它们能够预防中风、抵抗血栓性疾病、治疗糖尿病以及动脉粥样硬化等病症[7]。如白雪莲[8]构建了一种经常使用的体外炎症模型，是运用了脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞模型，并在研讨中发现了原花青素B2、金丝桃苷以及槲皮素是苹果渣多酚中的主要抗炎活性成分。酚类化合物的提取一般会用到萃取法、色谱法等多种分离技术，像硅胶色谱法、聚酰胺色谱法、凝胶色谱法等，以此来研究天然产物中的有效成分。在本次实验研究中，硅胶色谱分离技术被系统性应用于衡南土枇杷果实中酚类活性成分的分离纯化过程。该技术原理基于待分离混合物中各组分对含硅羟基（Si-OH）功能基团的硅胶基质吸附剂呈现差异化的吸附特性。当流动相（洗脱溶剂）持续流经色谱柱时，各组分在吸附-解吸附-再吸附-再解吸附的动态平衡中形成选择性迁移，从而实现混合物的有效分离。在实践操作中，常采用三元溶剂体系（如三氯甲烷-乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯及三氯甲烷-甲醇）构建梯度洗脱程序。通过调节溶剂极性比例（按极性递增顺序）可显著提升分离效能，具体表现为：低极性溶剂优先洗脱非极性组分，高极性溶剂则针对性洗脱极性较强的目标成分。该策略通过控制溶剂极性梯度变化，实现对复杂混合物中不同极性组分的精准分离。刘俊果[10]研究者采用硅胶柱层析技术，针对利普司他汀粗提物实施分离纯化操作。其具体操作参数为：依次使用1倍柱体积（1BV）5%丙酮-正庚烷混合溶剂、1BV10%丙酮-正庚烷、7BV15%丙酮-正庚烷及2BV30%丙酮-正庚烷构建四步梯度洗脱程序。该策略通过系统优化溶剂极性梯度，最终使利普司他汀的纯度提升至80.499%，验证了硅胶色谱技术在天然产物分离纯化中的有效性。在天然产物研究领域，从植物资源中提取并纯化目标化合物后，需进一步解析其分子结构特征。鉴于天然产物的结构多样性，其可能展现出独特的生物活性，该特性已成为新药研发的关键评价维度。当前，结构解析的主流技术涵盖核磁共振波谱（NuclearMagneticResonance，NMR）、质谱（MassSpectrometry，MS）、红外光谱（InfraredSpectroscopy，IR）及紫外光谱（UltravioletSpectroscopy，UV）四大谱学手段。本研究重点运用NMR技术对分离获得的化合物进行结构表征。该技术通过检测原子核在磁场中的能级跃迁，可获取丰富的分子结构信息，已成为解析有机化合物构型的经典方法。其优势在于：既可对纯化组分进行单分子结构解析，亦可针对复杂混合物开展非靶向结构鉴定[10]。在NMR技术应用实例中，尹文龙[11]通过二维核磁共振技术（2D-NMR）对格列美脲进行结构确证，实验数据与其分子化学结构完全吻合。曹妍团队[12]则创新性地采用¹H-NMR非靶向代谢组学方法，系统解析了熊胆粉等胆类中药的化学成分谱系。研究通过¹H信号归属解析了胆酸类成分的分子构型，并利用图谱分段积分峰面积开展主成分分析（PCA），证实¹H-NMR技术具备对复杂成分群进行高通量、无偏倚分析的能力。国外对于土枇杷的研究主要对于化学成分的剖析以及生物活性的钻研，国内近年来也取得了一些进展。乙酸乙酯是一种常见使用的有机溶剂，具备良好的溶解性与挥发性，能有效提取土枇杷中的多种化学成分。此外，对该部位进行分离纯化，有望得到具有高活性的单体化合物，为新药研发提供先导化合物。本研究通过反复硅胶柱层析法、SephadexLH-20凝胶柱色谱法、薄层色谱法、半制备液相色谱法方法对衡南土枇杷乙酸乙酯部位进行化学成分研究，利用核磁共振（NMR）技术得到单体化合物对单体化合物的结构进行鉴定，深入了解其化学组成和结构特征，为揭示土枇杷的药用物质基础提供重要依据。实验仪器与材料实验仪器表1.1实验仪器型号/规格仪器名称厂家UPLC-QTRAP-MS超高效液相色谱仪赛默飞Goodluck-100薄层色谱仪上海科哲生物科技有限公司RE-52AA旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂HPLC-DAD高效液相色谱仪赛默飞80-2离心机江苏金坛市中大仪器厂80~100目、200-300目柱层析硅胶青岛海洋化工有限公司HSGF254薄层层析硅胶板青岛海洋化工有限公司Bruker600MHz核磁共振仪美国布鲁克公司SB-1200水浴锅EYELACO.,LTD.实验材料表1.2实验材料名称批号厂家土枇杷20230801衡南县三塘镇大广村甲醇202307133湖南汇虹试剂有限公司乙酸乙酯20230620国药集团化学试剂有限公司氯仿202310283湖南汇虹试剂有限公司石油醚（60~90℃）20230825国药集团化学试剂有限公司正丁醇20240117国药集团化学试剂有限公司二氯甲烷20240223国药集团化学试剂有限公司实验方法与结果2.1土枇杷化学成分提取与分离称取20.0kg经干燥处理的土枇杷，采用粉碎机进行机械粉碎，过40目标准筛后获得均匀粉末状原料，随后用70%乙醇进行2次回流提取，每次提取回流2h，提取结束后，将滤液合并，将过滤提取液转移至旋转蒸发仪，在50℃、-0.09MPa条件下减压浓缩至无醇味，获得乙醇总浸膏，随后向浸膏中加入适量水使其悬浮，依次用等体积的石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，将不同溶剂萃取液分别合并，减压浓缩后得到乙酸乙酯萃取部位浸膏，避光保存。选取合适的硅胶柱，处理干净并保持干燥，首先将柱子底部用棉花塞紧，铺设一层适合柱子大小的棉花在底部并向其中加入二氯甲烷溶液，用以浸润棉花并检查出液口是否漏液，然后将活化好的硅胶缓慢加入柱内，打开柱子活塞，促使活化的硅胶开始自然沉降。柱壁上粘连的硅胶用二氯甲烷将其冲洗干净，随后用更多的二氯甲烷，打开柱子下端活塞，用小型气泵加压并反复冲洗硅胶，直到硅胶上层面不在下沉为止，保持其硅胶柱高度不变并停止加压，最后等液面与硅胶柱上层面约1-2cm时，即刻关闭活塞。3.16kg乙酸乙酯部位的浸膏进行拌样，用药勺将其均匀铺撒在硅胶柱硅胶表面，随后轻轻敲击样品层所在的柱身，促使样品上表层平整，再者加入2-3cm厚的硅胶平铺在样品表面，再加入3-5cm厚的石英砂，防治倾倒溶剂时由于溶剂重力而砸坏样品层。然后，先后用石油醚：乙酸乙酯（50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，0:1）和二氯甲烷：甲醇（50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，0:1）进行梯度洗脱，点板合并样品，最终得到13个组分Fr.1-Fr.13。取Fr.7（9.03g）过正相硅胶柱层析，用石油醚：乙酸乙酯（50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，0:1）梯度洗脱，点板合并样品得到10个组分Fr.7.1-Fr.7.8。取Fr.7.5（2.15g）再过硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯（20/1→0/1）进行梯度洗脱，点板合并样品后得到13个组分，命名为Fr.7.5.1-Fr.7.5.13。取Fr.7.5.6（321.1mg）继续过硅胶柱，用石油醚：乙酸乙酯（5/1→0/1）进行梯度洗脱，得到化合物TPP-1-19-1（25.8mg）、TPP-1-19-2（14.9mg）和TPP-1-19-3（5.2mg）。具体工艺流程见图2.1。图2.1土枇杷化学成分提取与分离工艺流程图2.2结构鉴定化合物1：该化合物呈现为白色晶体；在1HNMR（600MHz，CD3OD）谱中，低场区能够观察到3个芳香氢信号H7.46（1H,m,H-6），7.45（1H,m,H-2），6.82（1H,d,J=7.8Hz,H-5），推测存在1个ABX苯环片段。在13CNMR（150MHz,CD3OD）谱中，可识别出7个碳信号；C168.4（C-7）为羧基碳信号，C149.5（C-4），144.0（C-3），121.9（C-1），121.2（C-6），115.7（C-2），113.8（C-5）为1个芳香基碳信号。以上NMR数据与文献中[13]中关于原儿茶酸报道的波谱数据进行对比，二者基本一致，故鉴定化合物为原儿茶酸（TPP-1-19-1）。化学结构式见图2.2，核磁共振谱图见图2.3和2.4；核磁共振数据见表2.1。图2.2原儿茶酸化学结构式图2.3TPP-1-19-1在CD3OD中的1HNMR（600MHz）光谱图图2.4TPP-1-19-1在CD3OD中的13CNMR（150MHz）光谱图表2.1TPP-1-19-1、TPP-1-19-2和TPP-1-19-3的1H和13CNMR光谱数据（CD3OD,JinHz）NO.TPP-1-19-1TPP-1-19-2TPP-1-19-3H(JinHz)CH(JinHz)CH(JinHz)C1121.9121.4127.227.45,m115.77.87,d(9.0)131.67.45,d(8.6)131.13144.06.81,d(9.0)114.66.80,d(8.6)116.84149.5162.0161.256.82,d(7.8)113.86.81,d(9.0)114.66.80,d(8.6)116.867.45,m121.27.87,d(9.0)131.67.45,d(8.6)131.67168.4168.77.60,d(15.9)146.686.28,d(15.9)115.79171.1化合物2：该化合物为白色晶体；在1HNMR（600MHz,CD3OD）谱中，低场区存在4个芳香氢信号H7.87（2H,d,J=9.0Hz,H-2,6）,6.81（2H,d,J=9.0Hz,H-3,5），推测存在1个AA'BB'苯环片段。在13CNMR（150MHz,CD3OD）谱中，存在7个碳信号；C168.7（C-7）为羧基碳信号，C162.0（C-4），131.6（C-2,6），121.4（C-1），114.6（C-3,5）为1个芳香基碳信号。以上NMR数据与文献中对羟基苯甲酸[14]报道的波谱数据基本一致，故鉴定化合物为对羟基苯甲酸（TPP-1-19-2），化学结构式见图2.5，核磁共振谱图见图2.6和2.7；核磁共振数据见表2.1。图2.5对羟基苯甲酸化学结构式图2.6TPP-1-19-2在CD3OD中的1HNMR（600MHz）光谱图图2.7TPP-1-19-2在CD3OD中的13CNMR（150MHz）光谱图化合物3：该化合物为浅黄色固体；在1HNMR（600MHz,CD3OD）谱中，低场区存在2个烯烃基氢信号H7.60（1H,d,J=15.9Hz,H-7），6.28（1H,d,J=15.9Hz,H-8），由此推测存在一个反式烯烃基；同时，还存在4个芳香氢信号H7.45（2H,d,J=8.6Hz,H-2,6），6.80（2H,d,J=8.6Hz,H-3,5），推测存在1个AA'BB'苯环片段。在13CNMR（150MHz,CD3OD）谱中，可识别出9个碳信号；其中C171.1（C-9）为羧基碳信号，C161.2（C-4），146.6（C-7）131.1（C-2,6），127.2（C-1），116.8（C-3,5），115.7（C-8）为1个芳香基碳和1个烯烃基碳信号。将这些NMR数据与文献中对羟基肉桂酸[15]报道的波谱数据对比，基本一致，故鉴定化合物为对羟基肉桂酸（TPP-1-19-3），化学结构式见图2.8，核磁共振谱图见图2.9和2.10；核磁共振数据见表2.1。图2.8对羟基肉桂酸化学结构式图2.9TPP-1-19-3在CD3OD中的1HNMR（600MHz）光谱图图2.10TPP-1-19-3在CD3OD中的13CNMR（150MHz）光谱图讨论本研究围绕衡南土枇杷乙酸乙酯部位展开化学成分研究，成功分离鉴定出原儿茶酸、对羟基苯甲酸和对羟基肉桂酸这3种酚酸类化合物，为深入了解土枇杷药用价值奠定了基础，同时也为后续研究指明了方向。从化合物活性角度来看，这3种酚酸类化合物在抗氧化、抗炎等方面表现突出。原儿茶酸凭借分子结构中的羟基化酚基团，展现出显著抗氧化活性，能有效清除体内自由基，减轻氧化损伤，在抗氧化应激相关疾病防治方面极具潜力[16-18]。对羟基苯甲酸不仅具备抗菌、抗氧化性能，还在肠道炎症缓解上效果显著，通过调控NF-κB、MAPK等信号通路，降低促炎细胞因子表达，增强肠道屏障功能，有望成为新型肠道炎症治疗药物的先导化合物[19-20]。对羟基肉桂酸广泛存在于植物中，参与植物防御反应，其抗炎机制多样，在医药、食品等领域的应用研究极具前景[21-23]。本实验综合运用多种分离技术与结构鉴定方法，体现出良好的协同性。反复硅胶柱层析法结合不同比例洗脱剂，能初步分离复杂混合物，SephadexLH-20凝胶柱色谱法进一步纯化，分离过程中主要借助薄层色谱法观察分离情况，半制备液相色谱法获取高纯度单体化合物，利用核磁共振技术进行鉴定结构，各方法相互配合，高效完成研究任务。但在实际操作中，硅胶柱层析法存在分离效率不高、耗时较长的问题，未来可尝试引入高速逆流色谱等新型技术，提升分离效率与纯度。此次研究仍存在一定局限性。研究仅针对土枇杷乙酸乙酯部位，对其他部位如石油醚部位、正丁醇部位化学成分研究较少，后续可扩大研究范围，挖掘更多活性成分。同时，目前仅完成化合物的分离鉴定与活性探讨，缺乏对其药理作用及其安全性研究，后续需开展细胞实验与动物实验，为土枇杷在医药领域的开发应用提供更充分依据。4结论本研究采用系统化分离纯化策略，综合运用反复柱色谱分离技术（RepeatedColumnChromatography，RCC）、半制备型高效液相色谱（Semi-PreparativeHighPerformanceLiquidChromatography，SP-HPLC）及核磁共振波谱分析（NuclearMagneticResonanceSpectroscopy,NMR）等现代分离鉴定手段，自衡南地区特色植物土枇杷cu（Eriobotryabenthamiae）中成功分离获得三种酚酸类天然产物。通过1H-13C二维核磁共振（2D-NMR）联用技术进行结构解析，结合质子核磁共振氢谱（1HNMR）及碳核磁共振碳谱（13CNMR）特征信号归属，最终确定该三种化合物分别为：3,4-二羟基苯甲酸（即原儿茶酸，ProtocatechuicAcid）、4-羟基苯甲酸（对羟基苯甲酸，p-HydroxybenzoicAcid）及3-（4-羟基苯基）-2-丙烯酸（对羟基肉桂酸，p-Hydroxy-cinnamicAcid）。据相关报道，经分离所得的化合物在抗氧化及抗炎方面展现出良好的生物学活性，深化了对衡南土枇杷化学成分的理解，丰富了衡南土枇杷中的化合物色种类，为后续针对衡南土枇杷的研究提供了科学依据。在分离纯化产物的分析与表征中，运用高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、薄层色谱（TLC）等方法开展纯度分析，借助核磁共振（NMR）、质谱（MS）、红外光谱（IR）等技术进行结构鉴定。这些手段为确定产物的纯度和结构提供了准确的分析方法，也为深入研究土枇杷乙酸乙酯部位的化学成分和生物活性奠定了坚实基础。

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