高中生物选择性必修三 3 2 1 基因工程的基本操作程序1(导学案)

第2节基因工程的基本操作程序(第1课时)

学习目标

1.运用系统思想解释基因工程的基本步骤和原理(生命观念)

2.结合逐料和示意图阐明PCR的原理，说出PCR所需的条件及其反应过程(科学思维)

3.结合模式图说出基因表达载体的组成，并理解构建目的(生命观念、科学思维)

课前自主探究

一、目的基因的筛选与获取

1.目的基因

Q)概念：用于改变或获得等的基因。

(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是。

2.筛选合适的目的基因

Q)较为有效的方法：从相关的和的基因中进行

筛选。

(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的,

也对Bt基因的表达产物一有了较为深入的了解。

(3)认识基因结构和功能的技术方法：技术、数据库、工具。

3.利用PCR获取和扩增目的基因

(DPCR的含义：PCR是的缩写，它是一项根据的原理,

在体外提供的各种组分与反应条件，对进行大量复制的

技术。

(2)原理：_____________

(3)条件:

参与的组分在DNA复制中的作用

解旋酶（体外用代替）打开DNA双链

DNA母链提供____________的模板

合成DNA子链的原料

催化合成DNA子链

使能够从引物的端开始连

引物

接_________________

维持反应体系pH稳定

（4）过程：PCR过程包中舌三步（填图）

温度上升到72七左右，在_

作用下介成子侨

笫一个循环合成

两个DZA分子

'芾要扩增的

3：1：1：1!1：1：1：1：1：1：1「3

DNAJ字歹IJL5'③延伸

PCR扩增仪

温度下降到50P左ti

温度上升到。。（时复性，_____________

以h.双链DZA与邛I链DNA经与介

UUUUUUUUH

3

3，nnnnnnnfinnn_,

②复性

①变性

---

PCR过程中不需字斛以渝「串要可高温度才能打外氢锭,但立匕时

妁温戊么、令祓正修玫二岫锭..同声J次怔D/VA力"拄•史性角•变为

单拉，并未分斛成单注.

（5）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成形式扩熠（约为

其中〃为数）。

提醒：

①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）,既可作为合成DNA子链的

原料，又可为DMA的合成提供能量。

②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一

般为RNA片段。

③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg?

二、基因表达载体的构建一核心

1.构建基因表达载体的目的

(1)使目的基因在受体细胞中，并且可以给下一代。

(2)使目的基因能够和发挥作用。

2.基因表达载体的组成［填图］

—标记叫：鉴别受体圳胞巾是杏豺.

3.构建过程［填图］

限制酶切割位点复制原点美用和WA复制的起蛉点，为

后动子终止子＜复制原点:仅彼环,则於怵科彳航复制.

复制原点目的基因

限制称切刈位点

限制陶

加外工子之间

G_____G>

理组

DNA分子

关君出两两相连，则D'Ail持前在桂D/VA月段会力现三种情况:

8的基㈤与B的基国的正林、8的基㈤与依拉的连展、京拄

与京虻的建建,跖第法力首如度拉

易错易混辨析:

L目的基因就是指编码蛋白质的基因（）

2.从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。（）

3.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列（）

4.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物（）

5.后q酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。（）

6.基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。（）

课堂合作探究

探究一PCR技术相关分析

【情境探究】根据PCR技术的过程，思考回答下列问题：

当温度上升至七以上时，双链DNA解聚

为单链

$IIIII口口I口

|加热至900以上

3'-■।।।11-5'S'।।।11।।।।113

温度下降至5。t左右时，两种引物通过被

牌互补配而与两条单链DNA结合

5-JJJJJ1-V"5,5|11^ILLLU.^

引物「,弓I物II

当温度上升至72七左右时.耐高温的DNA

聚合醐从引物开始进行互补链的合成（从

5'端向3'端延伸）

•二:「「「rrnriTiVimuiLLij.y

5引物।3引物片

（1）利用PCR技术扩增目的基因需要提供哪些条件？

（2）什么是引物？PCR过程中为什么需要引物？

(3)PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补？说明理由。

(4如果在某基因组定位了一个目的基因X,但是其核昔酸序列未知现已知X邻近区域的上、

下游的部分DNA序列，此时如何设计引物？

(5)若PCR过程中加入模板DNA片段a个，经过n次复制后，产生的DNA片段中含有

模板DNA片段a的DNA个数为多少？试分析原因。

(6)某同学认为PCR过程不同的DNA片段变性时温度是不同的，你认为他的说法正确吗？说

明你的理由。

(7)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关健。复性温度过高会破坏引物与模板的

碱基配对，可能导致PCR得不到任何扩增产物。复性温度过低又会造成引物不能与DNA模

板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在

GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。

(8)一个目的基因(DNA)分子在第3次扩增时，需要几种引物？需要几个引物？

(9)PCR技术扩增目的基因实际上是在体外模拟DNA复制过程。请从酶的角度分析PCR技术

扩熠DNA与DNA体内复制的不同点。

(10)在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？

【归纳总结】

1.PCR技术和DNA复制的比较

gDNA复制:

体绛＜PCR扩增仪中)场所细胞内(上要是细胞核内)

DNA在高温下变性解旋解旋程催化

方式

耐高温的DNA聚合厢解旋瓶、DNA聚合秘

髭:潞下进行'T温度;条件卜细胞内温和条件

DNA片段至成:对象卜DNA分子

♦

均需要模板(DNA双链)、原料

(四种脱银核背酸)、熊崎

2.PCR中与引物有关的易错点

(1)设计引物的依据通常是目的基因两端的核音酸序列。

(2)用于PCR的引物长度通常为20-30个核昔酸。若引物长度过短，则引物与模板链结管的

特异性较差。

(3)两种引物需符合以下要求，否则引物失效，得不到扩增产物。

③每种引物内部不能发生局部碱基互补配对，否则会导致目身折叠；

②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，否则会导致引物自连。

(4)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5端加上限制酶的酶切位点，且

常在两种引物设计上加入不同的酶切位点，主要目的是保证目的基因与载体的正向连接。

3.PCR过程模型

31

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注意：

(1)复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也

存在DNA解开的两条链的结合。

(2)PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引

物，比所需的DNA片段要长，从第二次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种

引物。

4.PCR中的数量关系

复制次数123n

DNA分子数2482n

含引物的DNA分子数2482n

含其中一种引物的DNA

分子数21-122-123-12n.i

同时含两种引物的DNA

分子数21・222-223-22n-2

共消耗引物的分子数22-223-224-22n+1-2

探究二.基因表达载体的构建

【情境探究】请据图思考回答下列问题：

(1)为什么必须构建基因表达载体？

(2)假设图中利用同一种限制酶切割质粒和外源DNA片段，分别产生几个黏性末端？

(3)构建基因表达载体时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体，请分析原因。

(4)作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？

(5)构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？

(6)启动子是起始密码子吗？终止子是终止密码子吗？请说明理由。(科学思维)

L真核细胞的基因结构

(1)结构：①编码区：内含子、外显子；旗E编码区：启动子、终止子。基因结构如下图所示：

■I示夕卜显子示内含亍

(2)表达只有编码区能转录生成RNA,内含子转录生成的部分要剪切掉即转录生成的mRNA

只有外显子的对应部分。因此，以mRNA为模板，逆转录产生的目的基因中没有内含子、启

动子和终止子。

2.基因表达载体构建过程

叔体(质他)

外源DNA

相同末端的限制的切割

两个切口.茯得

LDNA连接酶r

•个切口，目的班因

两个粘性末端

基因表达载体(由组质粒)

如果用同一种限制的切割，若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况:

目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的跳、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。

3.基因表达载体的组成

提醒启动子工起始密码子终止子工终止密码子

①启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位

于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。

②起始密码子和终止密码子均位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止

4.限制酶的选择方法

根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标

记基因来确定限制酶的种类。

PstISmaIPsiI

III

t抗病基因I

SmaIEcoRI

甲乙

(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstI；不能选择酶切位点位

于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Smal。

(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制醐(非同尾酶)切割目

的基因所在片段和质粒(双醐切)，如图甲可选择用PstI和EcoRI两种限制酶(但要确保质

粒上也有这两种酶的切割位点)。

(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以

用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaI切割。

课前自主探究答案

一、目的基因的筛选与获取

1.(1)受体细胞性状预期表达产物(2)Bt抗虫蛋白基因

2.(1)已知结构功能清晰(2)序列信息Bt抗虫蛋白(3)测序序列序列比对

3.(1)聚合酶链式反应DNA半保留复制参与DNA复制目的基因的核音酸序列

(2)DNA半保留复制

(3)条件:

参与的组分在DNA复制中的作用

解旋酶(体外用高调代替)打开DNA双链

DNA母链提供DNA复制的模板

4种脱氧核苦酸合成DNA子链的原料

耐高温的DNA聚合酶催化合成DNA子链

使DNA聚合酶能够从引物的支端开始连接脱邕

引物

缓冲液维持反应体系pH稳定

(4)变性、复性和延伸

温雹上升列72F左人.仔耐高温的

(5)指数2〃扩增循环次DZAWC博作川卜介应广锹—

网个“zA分r

DNAir效J3延

二、基因表达载体的构建

PCR扩增仪

滥度EW^|5(>VA-

“宣匕升*Joop^tnGHIU”.仙”川

-).I.U?4l>NA

1.(1)稳定存在遗传(2)表达*东为蛆蚀

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彳令现坏“ML=*w・w*u认超生粒力文为

♦U..并未分姆K单件.

启「位置：目的西内的上游

动「幽建金酶沙和结合的部位,

二I功能:{OPJ

驱动基因的黄迓

表达我体目的基因:人们所需要的基因

［位置：目的基因的下游

毙止于I功能：终止转录

标记基因:用于目的基因的检测与筛选

3.

限制前切割位点

在取目的某出

D或幽/收加

b4(DNA分f

%为上两两相JL.则伪VAjlNWil桂。段金七现三计情况:

i吟基®与8的基圆的逐4.8的未国与京社的建玲、京在

与长拄的正派,用先送七寸但东在

易错易混辨析：xVVVxx

课堂合作探究

探究一(1)利用PCR技术扩增目的基因需要提供哪些条件？

提示：(1)需要模板、酶、原料、引物以及适宜的温度和pH等条件。即以DNA两条链

为模板，在耐高温的DNA聚合酶的作用下，4种脱氧核苦酸(A、T、C、G)作为合成子链的

原料，从引物的3'端开始连接脱氧核甘酸。反应过程中，缓冲溶液维持反应的pH,并保证变

性、复性和延伸需要的适宜温度。

(2)什么是引物？PCR过程中为什么需要引物？

提示：(2)引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链

的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应

(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5'端到3'端合成子链。

(3)PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补？说明理由。

提示：(3)不能。因为两种引物分别与两个DNA单链的3端互补结合，而DNA的两条

单链的3端碱基序列往往不同加果2种引物的碱基序列互补那么会影响引物与DNA单链的

结合。

(4)如果在某基因组定位了一个目的基因X,但是其核昔酸序列未知，现已知X邻近区域

的上、下游的部分DNA序列，此时如何设计引物？

提示：（4）虽然目的基因X的核昔酸序列未知，但X临近区域的上、下游的部分DNA

序列已知，因此可根据X临近区域的上、下游已知序列设计引物。

（5）若PCR过程中加入模板DNA片段a个，经过n次复制后，产生的DNA片段中

含有模板DNA片段a的DNA个数为多少？试分析原因。

提示：（5）2a个。因为DNA是半保留复制，一开始的模板链最终分布在子代DNA分子中。

（6）某同学认为PCR过程不同的DNA片段变性时温度是不同的，你认为他的说法正确

吗？说明你的理由。

提示：（6）正确。变性目的是通过升高温度破坏氢键，将DNA分子双链变成单链，不同

片段的DNA分子中氢键的数量不同导致稳定性不同，因此所需的温度不同。

（7）PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的

碱基配对，可能导致PCR得不到任何