宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识

宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识一、前言感染性疾病，尤其是急危重症感染，仍是当前威胁人类健康的主要杀手之一，其病情进展迅速，病原体复杂多样，传统病原学诊断方法往往因耗时长、敏感性低或特异性不足等原因，难以满足临床快速精准诊断的需求，导致初始经验性治疗不当，影响患者预后。宏基因组下一代测序技术（metagenomicnext-generationsequencing,mNGS）作为一种无需预设、直接对临床样本中所有微生物核酸进行高通量测序的技术，为急危重症感染的快速诊断带来了新的希望。近年来，随着测序技术的进步、成本的降低以及生物信息学分析能力的提升，mNGS在临床感染性疾病诊断中的应用日益广泛，但其在急危重症领域的规范化应用仍面临诸多挑战，如样本类型选择、质量控制、数据分析、结果解读、临床价值评估及成本效益分析等。为推动mNGS技术在急危重症感染诊断中的科学、规范、合理应用，充分发挥其临床价值，由多学科专家组成共识编写组，在系统梳理国内外相关研究进展、临床实践经验及现有指南的基础上，结合我国医疗实际情况，经过反复讨论和修订，形成本共识，旨在为临床医师、检验技师及相关科研人员提供参考。二、宏基因组技术的优势与局限性（一）主要优势mNGS技术的突出优势在于其无需预设病原体，能够对临床样本中的所有核酸（DNA和/或RNA）进行无偏倚检测，理论上可覆盖细菌、真菌、病毒、寄生虫等各类病原体，尤其对于那些传统培养困难、生长缓慢或目前未知的病原体具有独特的检测能力。该技术能够缩短诊断时间，部分流程优化后的mNGS可在数小时内完成从样本到初步结果的报告，为急危重症患者的早期精准治疗争取宝贵时间。此外，mNGS还能提供病原体的基因组信息，有助于深入了解其耐药机制、毒力因子及进化溯源。（二）主要局限性尽管mNGS展现出巨大潜力，但其临床应用仍存在若干局限性。首先，样本中宿主核酸的高背景干扰、病原体核酸含量低以及核酸提取效率等因素可能影响检测敏感性。其次，环境、试剂及操作过程中的外源性核酸污染易导致假阳性结果，对结果解读构成挑战。再者，mNGS检测成本相对较高，数据分析复杂且耗时，对实验室硬件设备和专业技术人员要求较高。此外，对于某些特殊病原体（如寄生虫卵、部分病毒颗粒）的检测敏感性仍有待提高，且难以区分病原体的活性状态及定植与感染。三、在急危重症感染中的应用价值与场景（一）应用价值在急危重症感染患者中，快速明确病原体是改善预后的关键。mNGS能够显著提高病原体的检出率，尤其是在传统检测方法失败或延迟的情况下，可为临床提供重要的病原学依据，从而指导抗生素的精准调整，减少广谱抗生素的滥用，降低耐药风险，并可能缩短住院时间，改善患者预后。（二）适用场景基于当前证据和临床实践经验，mNGS在以下急危重症感染场景中具有较高的应用价值，可考虑作为优先或补充检测手段：1.免疫功能低下（如造血干细胞移植、实体器官移植、长期使用免疫抑制剂、中性粒细胞缺乏等）患者出现的严重感染，经传统病原学检查未能明确病原体，或经验性治疗效果不佳者。2.疑似中枢神经系统感染（如脑膜炎、脑炎），尤其是表现为急性重症，传统脑脊液检查（涂片、培养、常规PCR）阴性或难以解释病情者。3.疑似血流感染，特别是持续性或复发性发热，多次血培养阴性，或怀疑特殊病原体感染者。4.严重肺炎，尤其是呼吸机相关性肺炎或医院获得性肺炎，经验性治疗无效，或传统呼吸道标本检测未能明确致病原者。5.复杂性腹腔感染、尿路感染等，经规范治疗效果不佳，或怀疑有罕见病原体感染。6.疑似特殊病原体感染（如结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、真菌、病毒、寄生虫等）或新发、突发传染病疫情中的重症患者。7.临床高度怀疑感染，但反复常规检查无法明确病因，导致诊断困难、治疗陷入困境的危重症患者。（三）不推荐或谨慎使用场景对于临床症状轻微、病情稳定，通过常规检查易于明确病原体的感染；或样本质量极差、严重溶血/脂血/污染的样本；以及作为常规筛查手段，mNGS均不推荐或需谨慎使用。四、关键技术环节与质量控制mNGS检测流程复杂，涉及样本采集与处理、核酸提取、文库构建、高通量测序、生物信息学分析及结果解读等多个环节，每个环节的质量控制均至关重要，直接影响检测结果的准确性和可靠性。（一）样本采集与预处理样本采集应遵循无菌操作原则，选择合适的样本类型（如血液、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、组织等），使用无核酸酶污染的采集容器，并尽快送至实验室。对于不同类型的样本，需采用适当的预处理方法（如离心、过滤、消化等）以富集病原体、去除宿主及杂质干扰。样本运输和保存条件也需严格控制，避免核酸降解。（二）核酸提取应选择高效、稳定的核酸提取方法，确保能够有效提取样本中的病原体核酸，同时去除抑制物。对于RNA病毒检测，需注意在RNA提取过程中加入RNA酶抑制剂，并进行DNA酶处理。提取的核酸浓度和纯度需进行质控。（三）文库构建与测序文库构建过程中应严格控制污染，建议设置阴性对照（如无核酸水、宿主基因组DNA）和阳性对照（如已知浓度的标准品）。测序平台的选择应综合考虑读长、通量、准确性和成本。测序深度需根据样本类型和临床需求进行合理设置，以保证足够的病原体序列覆盖。（四）生物信息学分析生物信息学分析pipeline应经过验证和优化，包括原始数据质控、去除宿主序列、微生物序列比对、物种注释、丰度计算、耐药基因及毒力基因预测等步骤。需建立标准化的数据分析流程，并对分析软件及参数进行版本控制。（五）质量控制体系实验室应建立完善的室内质量控制（IQC）和室间质量评价（EQA）体系。定期对仪器设备进行维护和校准，对试剂进行性能验证。通过设立阴性对照、阳性对照、重复样本等方式监控整个实验流程的可靠性。五、结果解读与报告规范mNGS结果的准确解读是其临床应用的核心环节，需要结合患者的临床表现、流行病学史、其他实验室检查结果以及样本类型等多方面信息进行综合判断。（一）结果解读原则1.结合临床：mNGS结果必须置于具体的临床情境中解读。高丰度的病原体序列、与临床症状体征及影像学表现高度吻合的病原体，其临床意义更大。2.区分定植与感染：对于来自呼吸道、皮肤、消化道等部位的样本，需谨慎区分定植菌与致病菌。连续监测病原体序列的动态变化可能有助于判断其临床意义。3.考虑背景污染：需识别常见的试剂、环境或操作过程中的污染菌，并结合阴性对照结果进行排除。4.关注序列数与覆盖度：一般而言，病原体的序列数越多、基因组覆盖度越高，其作为致病菌的可能性越大，但需警惕高丰度定植菌的干扰。5.参考数据库：所用参考数据库的完整性和准确性对结果注释至关重要，应选用权威、更新及时的数据库。6.耐药基因与毒力基因：对于检出的耐药基因和毒力基因，需结合病原体种类和临床治疗反应综合判断其意义，目前尚不能仅凭基因检测结果直接指导临床用药。（二）报告规范mNGS检测报告应清晰、规范、易懂，至少包含以下信息：样本信息（类型、采集时间、送检时间）、检测流程概要、质控结果、检出微生物列表（建议包含物种名称、序列数、相对丰度、覆盖度等）、关键耐药/毒力基因信息（如检出）、结果解读与临床建议、局限性说明等。报告中应明确区分确定的致病病原体、潜在的致病病原体和背景/污染微生物。六、临床应用路径与多学科协作mNGS技术的临床应用绝非简单的技术检测，而是一个需要临床、检验、微生物、生物信息等多学科专业人员紧密协作的过程。（一）临床应用路径建议建立mNGS的临床应用路径：由临床医师根据患者病情和初步评估，判断是否符合mNGS检测指征；若符合，则与实验室沟通，共同确定样本类型、检测内容（DNA/RNA）及检测优先级；样本送检后，实验室严格按照标准操作流程进行检测和数据分析；结果出来后，应由多学科团队共同解读，结合临床信息给出最终诊断意见和治疗建议，并对患者治疗反应进行随访，评估mNGS的应用效果。（二）多学科协作（MDT）建立以感染科医师、临床微生物学家、病理科医师、临床药师、检验技师（含分子生物学和生物信息学专业人员）及相关学科（如重症医学科、神经科、呼吸科等）医师组成的多学科协作团队至关重要。MDT团队应参与mNGS检测的决策、结果解读、临床干预及疗效评估的全过程，以确保mNGS技术得到最优化、最合理的应用。七、挑战与展望尽管mNGS在急危重症感染诊断中展现出巨大潜力，但仍面临诸多挑战：如何进一步提高检测速度以满足急危重症的“时间就是生命”需求；如何有效降低背景污染和宿主核酸干扰，提高检测敏感性和特异性；如何降低检测成本，提高可及性；如何标准化检测流程和结果解读；如何将mNGS与其他检测技术（如PCR、质谱、抗原抗体检测等）有效整合；以及如何规范其在临床实践中的应用，避免过度使用或误用等。未来，随着技术的不断革新，如第三代/第四代测序技术的发展、单细胞测序、宏转录组学、代谢组学等多组学整合应用，以及人工智能在数据分析和结果解读中的深度参与，mNGS的检测性能将不断提升，成本持续下降。同时，通过大规模临床研究积累证据，制定更完善的临床应用指南和共识，加强实验室能力建设和人才培养，mNGS必将在急危重症感染的精准诊断和治疗中发挥越来越重要的作用，最终改善患者预后，挽救更多生命。八、共识意见1.mNGS技术为急危重症感染的病原学诊断提供了一种全新的、无偏倚的检测手段，具有重要的临床应用价值。2.mNGS在急危重症感染中的应用应严格把握适应证，优先用于传统检测方法失败、病情危重且诊断困难的患者。3.样本采集、核酸提取、测序、数据分析及结果解读等各个环节的质量控制是保证mNGS检测准确性的关键。4.mNGS结果解读必须结合患者临床资料、流行病学史及其他实验室检查结果，由多学科团队共同完成。5.目前mNGS是传统病原学诊断方法的重要补充，而非替代，临床应根据实际