3.1重组DNA技术的基本工具+课件+2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章基因工程(目的基因)运载体重组运载体不抗虫的植物细胞抗虫蛋白抗虫性状抗虫基因苏云金芽孢杆菌基因工程是指按照人们的愿望，通过①转基因等技术，②赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在③DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作④重组DNA技术。变异类型----基因重组定向改变生物性状打破种间界限1944艾弗里肺炎链球菌转化实验遗传物质是DNA，DNA可在不同物种间转移1958证明DNA半保留复制

确立中心法则阐明遗传信息的流动1953沃森克里克DNA双螺旋结构

提出遗传物质自我复制的假说1963尼伦伯格马太破译第一个密码子1970在细菌中发现第一个限制酶20C70Y多种限制酶、DNA连接酶、逆转录酶发现1967细菌拟核之外DNA之外的质粒有复制能力，可在细菌间转移1973质粒可作基因工程载体，实现种间基因交流1973质粒可作基因工程载体，实现种间基因交流1972伯格体外DNA改造，构建体外重组DNA分子1983农杆菌转化法，转基因烟草1985穆里斯发明PCR1990人类基因组计划启动基因工程的建立历程知识准备1

DNA的组成①组成元素:

②DNA中文全称:

③基本单位:磷酸二酯键5’3’3’5’CHONP脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷酸

=磷酸+脱氧核糖+含氮碱基脱氧核糖磷酸含氮碱基A或G或C或T12345腺嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸知识准备2

DNA的空间结构①DNA是由两条单链组成的，这两条链按___________方式盘旋成__________结构。反向平行双螺旋②__________和_________交替连接，排列在外侧，构成____________；_____________排列在内侧。脱氧核糖磷酸基本骨架碱基对③两条链上的碱基通过________连接成碱基对，且遵循____________________。氢键碱基互补配对原则1.基因是什么？2.基因的功能是什么？基因通常是有遗传效应的DNA片段基因通过控制蛋白质的合成，直接或间接控制生物的性状转录(RNA聚合酶)翻译酶代谢过程性状性状结构蛋白基因DNA知识准备3

基因工程的理论基础知识准备3

基因工程的理论基础3.基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状减数分裂Ⅰ后期，非同源染色体上非等位基因的自由组合。减数分裂Ⅰ前期，同源染色体上非姐妹染色单体间的互换；AABAAAaaaaaBBBBbbbbb4.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？①DNA的单体都是4种脱氧核苷酸②DNA都有规则的双螺旋结构5.为什么甲生物的基因可在B生物细胞内表达？①基因是控制性状的结构与功能单位②遗传信息传递都遵循中心法则③生物界共用一套遗传密码知识准备3

基因工程的理论基础第1节重组DNA技术的基本工具DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。

转基因番木瓜非转基因番木瓜在培育转基因番木瓜时，首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”；然后，将重组DNA分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”：准确切割DNA分子的“分子手术刀”、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。分子运输车分子手术刀分子缝合针运切连重组DNA技术所需三种基本工具1、限制性内切核酸酶----“分子手术刀”

切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今分离的限制酶有数千种。

能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开原核生物易受外源DNA入侵，限制酶能切割外源DNA，使之失效5’3’3’5’磷酸二酯键是一类酶，不是一种酶P71你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichiacoli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRⅠ。B

stE

Ⅱ

种名Stearothermophilus属名Baccillus株系ET在此类细菌中第二个被发现如：流感嗜血杆菌中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindⅠ

HindⅡ

HindⅢ限制酶的由来

大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如，EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶的识别序列均为6个核苷酸。也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。中轴线特点1：都可以找到一条中轴线；特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。特点3：正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致中轴线中轴线DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式----黏性末端和平末端。EcoRⅠ(在G与A之间切割)SamⅠ(在G与C之间切割)5’5’5’5’3’3’3’3’黏性末端平末端当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。黏性末端相同1.请结合限制酶的作用特点，回答问题：(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？理由是：_______________________这说明酶在发挥作用时，具有________性。限制酶只能识别特定的DNA碱基序列并从特定的切口切开DNA专一(2)请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少个游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？2个2个2个2个不能2.写出下列限制酶切割形成的黏性末端(1)BamHⅠ________

EcoRⅠ_______

HindⅢ________

BglⅡ

________

GATCAATTAGCTGATC(2)你从中发现什么现象？_____________________________________不同限制酶切割出的黏性末端一般不同不同限制酶也可切割出相同的黏性末端P74拓展应用1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备该酶的识别序列该限制酶所识别序列的碱基被甲基化了，使限制酶不能将其切开。CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3DNA水解酶与限制酶的区别DNA水解酶：

打断任意处的磷酸二酯键

形成脱氮核苷酸限制酶：

识别特定碱基序列，特定切口打断磷酸二酯键

形成DNA片段2、DNA连接酶----“分子缝合针”将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。催化DNA片段间磷酸二酯键的形成碱基对间的氢键自动形成GAATTCCTTAATGAATTCCTTAATAATTCCTTAAGGCTTAAGAATTCGEcoRⅠEcoRⅠAATTCGCTTAAGAATTCCTTAAGGCTTAAGAATTCGDNA连接酶在基因工程操作中，DNA连接酶主要有两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coliDNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键…A–C–G…T–G–C–T–T–A–A

A–A–T–T–C–G–T…G–C–A……A–C–G…T–G–C–T–T–A–A

A–A–T–T–C–G–T…G–C–A…E.coliDNA接酶E.coliDNA接酶GGGGGGCCCCCCT4DNA连接酶E.coliDNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。…A–C–G…T–G–C–T–T–A–A

A–A–T–T–C–G–T…G–C–A……A–C–G…T–G–C–T–T–A–A

A–A–T–T–C–G–T…G–C–A…E.coliDNA接酶E.coliDNA接酶GGGGGGCCCCCCT4DNA连接酶T4DNA连接酶DNA连接酶的种类种类来源作用

差别只连接____________缝合___________和____________E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。黏性末端黏性末端平末端大肠杆菌T4噬菌体GCTTAAAATTCG3’5’5’5’3’3’3’5’DNA聚合酶DNA聚合酶解旋酶DNA连接酶核苷酸P52DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？DNA连接酶：

基因工程

连接的是DNA片段DNA聚合酶：

DNA复制逐个连接脱氧核苷酸共同点：

都是蛋白质催化磷酸二酯键形成DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？DNA连接酶DNA聚合酶相同作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要DNA的每条母链作模板在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条子链基因工程DNA复制名称作用部位作用结果限制酶

DNA连接酶DNA聚合酶DNA水解酶解旋酶逆转录磷酸二酯键将DNA切成两个片段比较与DNA相关的几种酶磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸氢键将双链DNA分子局部解旋为单链磷酸二酯键以RNA为模板，形成DNA单链反馈练习1.根据所学知识，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶(1)切断a处的酶为_______

(2)连接a处的酶为_______(3)切断b处的酶为_______①③④②2.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是______________(用图中序号表示)①④②③3、基因进入受体细胞的载体----“分子运输车”(1)作用：(2)种类将目的基因导入受体细胞，使其在受体细胞内进行大量复制和表达质粒动植物病毒噬菌体通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。大肠杆菌拟核质粒氨苄青霉素抗性基因目的基因插入位点复制原点

(1)质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中。四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因质粒BamHⅠBamHⅠBclⅠHindⅢEcoRⅠEcoRⅠ目的基因DNA连接酶质粒重组质粒导入

(2)携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。增殖★载体需具备的条件★载体需具备的条件和载体的选择抗生素抗性基因(3)复制原点目的基因插入位点复制原点双向复制半保留复制母链子链★载体需具备的条件和载体的选择

(4)在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。1.标记基因的筛选原理载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞目的基因这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。抗链霉素基因思考：为获得重组质粒，可选用哪些限制酶？组合切割质粒切割外源DNA是否可行并说明理由1EcoRⅠEcoRⅠ2SmaⅠSmaⅠ3BamHⅠBamHⅠ4HindⅢHindⅢ5BamHⅠ、HindⅢBamHⅠ、HindⅢAATTGATCAGCT×两个抗性基因均完整×破坏了目的基因×切不出目的基因，2个抗性基因×切不出目的基因√例：某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是插入点细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况细菌在含四环素的培养基上的生长状况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长A.①是c；②是b；③是aB.①是a和b；②是a；③是bC.①是a和b；②是b；③是aD.①是c；②是a；③是babc同种限制酶切目的基因和载体，重新连接的类型？目的基因质粒DNA连接酶自连目的基因自连质粒自连片段间连接2个目的基因环化2个质粒环化质粒和目的基因反向环化质粒和目的基因同向环化选择限制酶的原则1、不破坏目的基因2、保留部分标记基因、复制原点等，破坏部分标记基因3、确保表达载体和目的基因出现相同贴性末端4、为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，使用不同的限制酶抗链霉素基因在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。这些基因工程载体，相当于一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”。目的基因重组质粒受体细胞重组噬菌体受体细胞请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRⅠ的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。讨论

1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？

2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？

3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？【思考·讨论】重组DNA分子GAATTC①②③④⑤限制酶、DNA连接酶剪切位点或连接位点错误有遗传效应的DNA片段，一般100对碱基以上【实践·探究】DNA的粗提取与鉴定【基本思路】DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。

【实验原理】

①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质

②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。③在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。DNA溶解度NaCl浓度0.14mol/L2mol/L0材料用具1.材料：新鲜洋葱（香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。目的要求

1.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。溶解并提取DNA(使蛋白质变性、抑制DNA酶、稳定DNA)析出DNA析出DNA鉴定DNA(现配现用)方法步骤

1.研磨称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。2.在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将洋葱研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量不用滤纸，DNA会吸附到滤纸上而大量损失防DNA变性3.在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2〜3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。①抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解②低温利于减少DNA断裂③低温抑制DNA运动，更易析出蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出4.取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化水浴加热对照组加入2mol/L氯化钠溶液不加入丝状物加入4mL二苯胺试剂水浴加热实验组加入2mol/L氯化钠溶液加入丝状物加入4mL二苯胺试剂水浴加热蓝色结果分析与评价如何提高DNA含量和纯度？1、用鸡血等作材料，易提取2、提取液中加入蛋白酶3、用不同浓度NaCl反复溶解和提取P741.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是

A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是

A.大肠杆菌的质粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用来识别特定基因的DNA探针2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？

(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？XbaⅠ产生相同的黏性末端防止切断目的基因防止质粒民目的基因反向环化(1)基因工程可以实现遗