3.2基因工程的基本操作程序1课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2第3章基因工程COURSEWARERESEARCHINSTITUTE课件研究所第2节：基因工程的基本操作程序-1目的基因的筛选和获取选择性必修3上节课我们已经学习了基因工程的基本工具，那么获得发光矮牵牛的具体基本操作程序是什么样的呢？我们一起来学习。发光基因普通矮牵牛发光矮牵牛发光矮牵牛情境导入情境导入——发光矮牵牛培养发光矮牵牛的步骤目的基因的筛选与获取1将目的基因导入受体细胞3基因表达载体的构建2目的基因的检测与鉴定4一、目的基因的筛选和获取第一步如何获得发光基因？任务一、阅读课本找出1.目的基因的概念、实例。2.筛选目的基因的方法。3.获取目的基因的方法。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码

的基因。1）概念：3）实例：目的基因1一、目的基因的筛选和获取2)作用：蛋白质培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，即Bt基因。在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。一、目的基因的筛选和获取苏云金芽孢杆菌产生Bt基因伴胞晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)表达破坏鳞翅目昆虫的消化系统导入杀死棉铃虫棉花细胞抗虫棉培育目的基因——Bt基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。目的基因的筛选2一、目的基因的筛选和获取基因海洋相关的已经结构和功能清晰的基因目的基因如何筛选筛选Bt基因的筛选一、目的基因的筛选和获取苏云金杆菌制成杀虫剂掌握目的基因的功能掌握目的基因的结构防治棉花害虫发现杀虫作用与Bt基因有关掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。1）人工合成目的基因获取目的基因的方法3前提：基因比较小、核苷酸序列已知。方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成。2）通过构建基因文库来获取目的基因3）常用PCR特异性的快速扩增目的基因DNA合成仪一、目的基因的筛选和获取一、目的基因的筛选和获取——利用PCR获取和扩增目的基因概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。发光生物提取?发光基因快速获得大量发光基因一、目的基因的筛选和获取——利用PCR获取和扩增目的基因原理：DNA半保留复制复旋合成子链解旋（1）条件体内DNA复制模板：原料：能量：酶：（2）延伸方向子链的延伸方向：原因：DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。（3）复制特点：②半保留复制①边解旋边复制

（4）复制原则：碱基互补配对原则一、目的基因的筛选和获取——利用PCR获取和扩增目的基因DNA的两条母链4种游离的脱氧核苷酸ATP解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶5'端→3'端一、目的基因的筛选和获取——利用PCR获取和扩增目的基因结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？PCR条件一定量的模板DNA引物4种脱氧核苷酸（实际加入dNTP:能量、原料）缓冲液耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）Mg2+作为DNA复制的模板使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料提供相对稳定的pH环境催化合成DNA子链真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活一、目的基因的筛选和获取——利用PCR获取和扩增目的基因PCR实际加入的是dNTP，dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简式如下：一、目的基因的筛选和获取——利用PCR获取和扩增目的基因ATCGP

~

P

~

P脱氧核糖含氮碱基脱氧核苷酸作用：dNTP分子中含有高能磷酸键，当DNA聚合酶催化dNTP加入到DNA链时，dNTP会脱去一个焦磷酸，形成四种脱氧核苷酸，释放出能量，为DNA合成反应提供动力，驱动DNA聚合酶进行DNA链的延伸反应，保证PCR反应的顺利进行。1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。扩增一段目的基因一般需要两个引物，分别与两条母链通过碱基互补配对。用于PCR的引物通常为20～30个核苷酸。在细胞内DNA复制引物为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。一、目的基因的筛选和获取——利用PCR获取和扩增目的基因-3′5′-3′--5′子链延伸-5′3′-5′--3′子链延伸2）引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能。）引物是决定PCR特异性的关键。PCR扩增过程一、目的基因的筛选和获取——利用PCR获取和扩增目的基因待扩增的DNA片段（模板）5’5’引物耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链变性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。复性温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。延伸Taq酶引物1原料模板DNA目的基因3＇5＇5＇3＇引物2955072℃PCR过程(三轮扩增)955072℃3＇5＇5＇3＇第一轮:高温变性3＇5＇5＇3＇955072℃第一轮:低温复性3＇5＇5＇3＇955072℃第一轮:中温延伸3＇5＇5＇3＇955072℃第二轮:高温变性3＇5＇5＇3＇955072℃第二轮:低温复性3＇5＇5＇3＇955072℃第二轮:中温延伸3＇5＇5＇3＇955072℃第三轮:高温变性3＇5＇5＇3＇955072℃第三轮:低温复性3＇5＇5＇3＇955072℃第三轮:中温延伸DNA解旋为单链高温(95℃)变性低温(50℃)复性中温(72℃)延伸引物结合到互补DNA链Taq酶从引物起始进行子链的合成⑤PCR的过程PCR过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。一、目的基因的筛选和获取——利用PCR获取和扩增目的基因比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式DNA在

下变性解旋全部解旋后在复制场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶温度细胞内

条件在

下进行结果合成整个DNA分子引物联系①模板:均需要

作为模板；②原料:均为

；

③酶:均需DNA聚合酶核心归纳：比较PCR扩增技术和体内DNA复制的异同高温解旋酶催化边解旋边复制解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等耐高温的DNA聚合酶温和较高温度扩增特定的DNA片段或基因一小段单链RNA一小段单链DNADNA的两条链四种脱