分子生物学技术选讲

分子生物学技术选讲蛋白质组研究方法双向电泳:第一向：等点聚集电泳第二向：SDS质谱（MS）等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移，最后各自某著名企业到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pI蛋白质的双向电泳鉴定特定生物分子是否存在的技术Southern印迹Northern印迹Western印迹Farwestern印迹Southwestern印迹Eastern印迹各种印迹技术印迹类型转移到膜上的分子探针获得的信息SouthernDNA

放射性标记的互补RNA或DNA基因结构等NorthernRNA放射性标记的互补RNA或DNA特定RNA的大小、分布和含量Western蛋白质一级抗体和与酶偶联的二级抗体特定蛋白质的大小、分布和含量Farwestern蛋白质放射性标记的蛋白质蛋白质与蛋白质的相互作用；与特定蛋白质相互作用的蛋白质的大小、分布Southwestern蛋白质能够与特定蛋白质结合的放射性标记的DNA或RNA特定DNA或RNA结合蛋白质的大小、分布和含量Eastern受到各种化学修饰的蛋白质取决于检测的化学修饰的类型蛋白质的后加工确定一个基因是不是断裂基因的方法R环技术研究基因功能的方法基因敲除：同源重组和转座子插入基因敲减：干扰RNA显性负性突变：通过基因转移将突变的蛋白质大量引入到在特定细胞内表达，以阻断正常蛋白质的功能，从而推断野生蛋白质的功能。蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法酵母双杂交免疫共沉淀亲和层析共价交联荧光共振能量转移生物发光共振能量转移酵母双杂交系统是一项专门用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的技术，它首先由FieldsS和SongOK于1989年提出。这项新技术在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与特定靶蛋白呈特异性作用的候选蛋白的研究中已经得到了广泛的应用。其可行性和有效性已被证实，并被推广到了诸如信号传导、细胞控、肿瘤基因表达等多个研究领域，受到越来越多的重视。酵母双杂交系统的原理酵母双杂交系统技术使用蛋白质的两种具有特别功能的结构域：一种是与DNA结合的结合结构域（简称BD），另一种是激活DNA转录的激活结构域（简称AD）。研究表明，这两种结构域并不需要一定在同一个蛋白质上才起作用。事实上，一个含有BD的蛋白质在与另一个含有AD的蛋白质结合以后就可以激活转录，该原理构成了酵母双杂交技术的基础。在双杂交系统中，两种融合蛋白被表达：一种是目标蛋白—X，它有时被形象地称为诱饵蛋白。X在它的N-端与BD融合在一起；另一种是潜在的能够与X结合的目标蛋白—Y。Y与AD融合在一起。如果X与Y相互作用，那么XY的结合就形成一种完整的活性转录激活物。如此形成的转录激活物能够驱动一个容的报告基因的表达。于是，报告基因的表达量可以用来作为测定X与Y相互作用的尺度。酵母双杂交系统的原理图解酵母双杂交系统的建立选择载体将“诱饵”蛋白X的基因和目标蛋白Y的基因分别插入到BD载体和AD载体之中，以形成BD-X和AD-Y融合蛋白转染：使用特定的手段将重组后的BD-X载体和AD-Y载体转染到特定的营养缺陷型酵母宿主细胞；（4）筛选：利用双营养缺陷型的恢复筛选出同时含有BD载体和AD载体的细胞；（5）活性检测。

免疫共沉淀

如果蛋白X与蛋白Y之间存在相互作用，那么，当将蛋白质X的抗体加到细胞裂解物之后，X-抗体复合物会导致Y一齐发生免疫沉淀。

亲和层析如果蛋白X与蛋白Y之间有相互作用，那么，在将细胞裂解液流过固定有X的树脂以后，Y将通过与X之间的特异性相互作用而被亲和吸附在树脂上，其他无关的蛋白质会直接流出树脂。共价交联如果蛋白X与蛋白Y之间有相互作用，那么，在细胞或细胞裂解液中加入交联试剂以后，它们之间会形成稳定的共价复合物。然后，再使用免疫沉淀的方法将它们共沉淀下来。最后，将交联打开，使Y得以释放。荧光共振能量转移（FRET）

如果两种蛋白之间有相互作用，那么，在将它们各自引入激发的荧光供体基团和荧光受体基团以后，两个荧光基团之间会发生能量转移。FRET在两个荧光基因之间的距离<10nm时就可以发生，这可以通过荧光受体发出的荧光波长的变化来测定。

生物发光共振能量转移（BRET）原理类似于FRET，不同的是要借助重组DNA技术将两种蛋白质分别与不同的荧光蛋白融合在一起，然后再测定它们之间的能量转移。蛋白质和核酸相互作用的研究方法电泳泳动变化分析DNA亲和层析染色质免疫沉淀（ChIP）染色质免疫沉淀ChIP的基本原理是在活细胞状态下使用甲醛固定蛋白质-DNA复合物，并通过超声或酶处理将染色质随机切成一定长度范围内的小片段。然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集靶蛋白结合的DNA片段。最后通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。染色质免疫沉淀基因芯片与蛋白质芯片基因芯片是随着“人类基因组计划”和其它模式生物基因组计划的进展而发展起来一门新技术，也叫DNA芯片、DNA微阵列或寡核苷酸阵列，它采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固定在支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，对生物样品进行快速、并行和高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。基因芯片以其无可比拟的信息量、高通量、快速和准确地分析基因的本领，在基因组功能研究、临床诊断及新药开发等方面显示出巨大的威力，已成为人类研究和维护生命的一大利器，因此，被誉为是基因功能研究领域最伟大的发明之一。一般说来应用基因芯片分5步进行：（1）生物学问题的提出和芯片设计与制备；（2）样品制备；（3）生物杂交反应；（4）结果探测；（5）数据处理和建模。使用基因芯片对正常细胞和癌细胞进行基因表达分析比较

检测DNA序列多态性的各种方法

限制片段长度多态性（RFLP）扩增片段长度多态性（AFLP）裂解酶片段长度多态性（CFLP）随机扩增多态性DNA（RAPD）单链构象多态性（SSCP）变性梯度凝胶电泳（DGGE）；恒定变性胶电泳（CDGE）；度凝胶电泳（TGGE）限制片段长度多态性（RFLP）由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化。扩增片段长度多态性（AFLP）首先利用可产生粘端的RE酶切目的基因组序列；然后，将这些长度不同的酶切片段与含有相同粘性末端的人工接头连接，形成模板；再在模板末段添加具有选择性核苷酸（1～3个）的不同引物，进行PCR扩增（只有两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增）；最后将扩增片段在高分辨率的测序胶上电泳，分析比较野生型和突变型基因组DNA在扩增片段的长度与数量的差异。裂解酶片段长度多态性（CFLP）DNA变性后产生的单链DNA片段自我折叠成带有发夹结构的构象。当DNA发生突变的时候，会或多或少地影响其空间构象，从而使DNA对特定的核酸内切酶的敏感性发生变化。这种方法所使用的核酸内切酶识别和切割的位点在单链和双链之间的连接处。随机扩增多态性DNA（RAPD）使用一系列长度为~10个碱基的随机引物，对目的基因组DNA进行PCR扩增。引物结合位点上的序列改变以及两扩增位点之间DNA碱基的突变均可导致扩增片段数目和长度的差异。扩增产物通过凝胶电泳分离后，经EB染色或放射自显影来检测扩增产物片段的多态性，这些扩增片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。单链构象多态性（SSCP）单链DNA片段呈复杂的三维折叠构象，它是互不碱基自我配对的结果。然而，当有一个碱基发生改变时，会影响到碱基之间的配对，从而使构象发生改变。空间构象有差异的单链DNA分子在PAGE中受排阻力不同，通过非变性PAGE，可以非常灵敏地将构象上有差异的分子分离开，