荧光分光光度法测定药液维生素B的含量专家讲座

荧光分光光度法测定药液维生素B2含量试验目标学习荧光分光光度法测定药液中维生素B2分析原理。掌握荧光分光光度计操作技术和测定药液中维生素B2方法。第1页试验原理荧光分析法

常温下，处于基态分子吸收一定紫外可见光辐射能成为激发态分子，激发态分子经过无辐射跃迁至第一激发态最低振动能级，再以辐射跃迁形式回到基态，发出比吸收光波长长光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度IF与物质浓度c有以下关系：当试验条件一定时，荧光强度与荧光物质浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析理论依据。第2页a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法含有更高灵敏度。b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来判定物质。c.所需试样量少、操作方法简便。荧光分析法特点第3页激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射荧光强度与照射光波长关系曲线。激发光谱曲线最高处，处于激发态分子最多，荧光强度最大。发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射荧光强度与发射光波长关系曲线。固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长选择是本试验关键。荧光光谱激发光谱发射光谱第4页荧光分析仪器

惯用荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示统计器五部分组成，以下列图所表示：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差异有两点：a.荧光分析仪器采取垂直测量方式，以消除透射光影响；b.荧光分析仪器有两个单色器，能够取得单色性很好激发光并消除其它杂散光干扰。液槽显示器单色器检测器I0IIf光源单色器第5页a.光源：在荧光计中惯用卤钨灯作光源；荧光分度计常采取高压汞灯或氙弧灯做光源。b.单色器：荧光计单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光光度计采取两个光栅单色器，可取得激发光谱和荧光光谱。c.检测器：荧光计采取光电管作检测器；荧光分光光度计采取光电倍增管作检测器。仪器部件第6页

维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭针状结晶，其结构式为：维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。药液维生素B2含量测定第7页

维生素B2溶液在430～440nm蓝光照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525nm。VB2荧光在pH=6～7时最强，在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素荧光比核黄素荧光强多，故测VB2荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

光黄素第8页试验预习预习荧光分光光度法测定维生素B2分析原理。了解荧光光度计操作步骤和测定维生素B2方法。第9页F96型荧光光度计（上海棱光分析仪器有限企业）5mL吸量管1只，2mL吸量管1只，50mL容量瓶7只10.0μg·mL-1VB2标准溶液（置阴暗处保留），冰乙酸（AR），药用VB2试样仪器与试剂第10页1.打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启开工作站并初始化仪器。2.仪器初始化完成后，在工作界面上选择测量项目，设置适当仪器参数：激发波长=440nm（本仪器只有356nm），发射波长=540nm。3.样品测定。4.退出主程序，关闭计算机，先关主机，最终关氙灯。基本操作第11页1.标准系列溶液配制及标准溶液荧光强度测定：在六个洁净50mL容量瓶中，分别吸收0.50、1.00、1.50，2.00、2.50和3.00mLVB2标准溶液，各加入2.00mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液荧光强度。2.未知试样测定:

移取0.1mL试样,用少许水溶解后转入50mL容量瓶中，加2.00mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同条件，测量其荧光强度。试验步骤第12