DB53T 1073-2021 甘蔗杂交育种独立亲本系统的创制及培育技术规程

ICS65.020CCSB0553云南省地方标准云南省市场监督管理局发布DB53/T1073—2021I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。本文件起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。本文件主要起草人：吴才文、胡鑫、刘家勇、赵俊、杨昆、夏红明、赵培方、昝逢刚、刘新龙、苏火生、董立华、经艳芬、田春艳、覃伟、陆鑫、吴转娣、姚丽、桃联安、赵丽萍、赵勇、陈学宽。DB53/T1073—20211甘蔗杂交育种独立亲本系统的创制及培育技术规程本文件规定了甘蔗杂交育种独立亲本系统创制中涉及的优良性状界定、独立亲本系统创制及独立亲本系统培育等技术要求。本文件适用于甘蔗杂交育种新独立亲本系统的创制与培育。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB53/T734甘蔗实生苗培育技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1甘蔗属原种originalancestorofSaccharumL.甘蔗属内未经过人工杂交及驯化，保持原有种性的栽培原种及野生种简称甘蔗属原种。本规程甘蔗属栽培原种包括热带种（S.oficinarum）、中国种（S.sinense）和印度种（S.barberi）3个种，甘蔗属野生种包括割手密（S.spontaneum）和大茎野生种（S.robustum）2个种。3.2新原种neworiginalancestorofSaccharumL.不包含在世界公认的POJ2878和Co290亲本系统中的甘蔗属栽培原种9个无性系（B.Hitan、B.Cheribon、Chunnee、Crystalina、Lahaina、Loethers、FiJi、K.Boothan、W.Transparent）和野生种2个无性系（S.spont/Co、S.spont/G），其余所有原种个体均称为新原种。3.3异质率heterogeneityrate新独立亲本系统与现有POJ2878和Co290系统比较，采用系谱法计算使用的新原种的数量占系统中甘蔗属原种数的百分率。3.4杂交伴侣partner不同无性系个体之间进行的杂交，杂交的双方互为杂交伴侣。3.5性状互补charactercomplementation指亲本一方的优点应在很大程度上弥补另一亲本的缺点，便于创制出具有双亲优良性状的子代，如高产与高糖、中大茎与多茎、大茎与多茎、抗病与抗虫等。DB53/T1073—202124优良性状界定早熟、高产、高糖、中大茎、大茎、有效茎中等以上，抗病、抗虫和抗逆等达中抗以上，具体要求见表1。表1优良性状增加0.5个百分点及5独立亲本系统创制5.1新原种的选择选择至少具有一个优良性状的新原种。5.2杂交伴侣的选配5.2.1母本与父本栽培原种间杂交，以优良性状多的为母本，优良性状较少的为父本。甘蔗属内栽培原种与野生种杂交，以栽培原种为母本，以性状互补性好的野生种为父本。5.2.2亲本血缘比例提供生产亲本，野生血缘比例不超过25%。如提供生产利用的亲本为F2代种时，其4个原种中最多有1个为野生种；若提供生产利用的亲本为F3代种时，其8个原种中最多有2个为野生种。5.3对等杂交杂交伴侣各自所含原种数量及其遗传代数完全相等的杂交，方法如下：a)原种与原种间杂交产生的高贵化F1代种；b)高贵化F1代相互杂交（F1×F1），获得更高贵化的F2代种；c)以此类推，获得F3代或更高代种的杂交方式。5.4独立亲本系统确定DB53/T1073—20213对等杂交培育产生的新独立亲本系统所含新原种与传统的POJ2878和Co290系统没有或极少重复，异质率达80%及以上，遗传性稳定、优良性状多的F2及以上代数的亲本系统。6独立亲本系统培育6.1母本杀雄50℃水浴3min～5min杀雄，不应自交。6.2隔离遮蔽或罩住杂交伴侣整个花穗（1.5m～2.0m高），不应串粉。6.3杂交在隔离罩中将父本花穗置于母本上方，母本花穗顶部置于父本花穗下半部约1/3处～1/2处，每日轻摇父本2次～3次授粉。6.4实生苗培育参照DB53/T734执行。6.5后代选择对各级杂交获得的种子培育实生苗，经田间试验评价，在含有亲本主要特性的前提下，选择优良性状多的个体。6.6真实性鉴定采用简单序列重复（Simplesequencerepeat,SSR）分子标记技术，进行真实性鉴定，方法参见附录A。6.7利用已经通过真实性鉴定，达到遗传性稳定、工农艺性状和抗性性状要求指标的材料，F2代就可用于选配杂交组合，提供甘蔗育种单位培育新品种利用。DB53/T1073—20214（资料性）甘蔗杂交后代SSR真实性鉴定方法A.1仪器、耗材A.1.1仪器主要仪器包含电子天平、酸度计、可调微量移液器、恒温水浴锅、高速台式冷冻离心机、蛋白/核酸分析仪、PCR扩增仪、涡旋混匀器、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、研钵等。A.1.2试剂主要试剂包括十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇、异戊醇、乙二胺四乙酸二钠、琼脂糖、β-巯基乙醇 (β-Mercaptoethanol）、丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、DNA分子量标准、dNTP混合液、Ex-TaqDNA聚合酶、10×Ex-Buffer、SSR引物等。A.2真实性鉴定方法A.2.1参试样本采集每份亲本和杂种后代材料取400mg幼嫩叶片组织，放入2mL离心管中，样品直接提取DNA或保存于-80℃冰箱备用。A.2.2CTAB法提取样本DNACTAB提取样本DNA方法如下：a)将甘蔗叶片剪成1cm左右碎片，放入预冷的研钵中。加入液氮速冷，研磨成粉末，将冻粉转移至2mL离心管中；b)向装有冻粉的离心管中加入等体积(w/v)2×CTAB提取缓冲液抽提缓冲液，65℃水浴20min，间隔4min颠倒混匀。c)将样品于12000rpm下离心5min，吸取上清液转入新的2mL离心管中；d)加入等体积的氯仿-异戊醇，轻缓颠倒离心管，充分混匀，12000rpm离心10min；e)吸取上清液转入新的离心管中，加入2/3倍体积的预冷异丙醇,轻缓颠倒混匀后置-20℃冰箱20min；f)取样品管，此时可见有絮状DNA沉淀，12000rpm离心10min，弃上清液。DNA沉淀用75%乙醇漂洗2次，12000rpm离心1min后弃上清液，于室温下干燥5min；g)加入60µL1×TE缓冲液溶解DNA，可取2µLDNA溶液用1%琼脂糖电泳检测。提取的DNA溶液置于-20℃冰箱保存备用。A.2.3建立SSR-PCR反应体系和电泳检测按下列方法建立SSR-PCR反应体系和电泳检测：a)利用现代甘蔗商业品种、中国种、印度种、割手密、大茎野生种等DNA做为模板，对选择的70对SSR引物进行多态性分析，选择多态性高、稳定性好的4对引物，详见表A.1。DB53/T1073—20215表A.1SSR真实性鉴定引物的序列信息123mSSCIR74GCGCAAGCCACACTGAGAACGCAACGCAAAACAACG4mSSCIR3b)PCR反应体系和条件:.PCR扩增反应体系（总体积20µL）中各组分的终浓度和体积参照表A.2进行配制，可以依据试验条件不同做相应调整；表A.2SSR-PCR反应体系.PCR的反应程序参照表A.3，其中退火温度依据不同引物的Tm值作相应调整，PCR程序结束后扩增产物于4℃保存。表A.3SSR-PCR反应条件A.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DB53/T1073—20216按以下方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：a)制备8％非变性聚丙烯酰胺（PAGE）溶液（见附件B），缓慢混合均匀后倒入制胶板，插入样品梳子后静置30min左右；b)向电泳槽中加1×TBE缓冲液，液面超过样品孔1cm左右，拔出样品梳子，向样品孔中加入2μL的SSR扩增产物。电泳条件110V恒定电压电泳时间2h；c)PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后采用银染方法进行染色。先用ddH2O漂洗两次，每次2min，用0.1％硝酸银溶液染色10min，再用ddH2O漂洗2min，然后将胶转移到显影液中显色10min，直至条带清晰，最后用ddH2O漂洗两次。A.3检测结果分析与鉴定A.3.1针对每一对SSR引物，将其扩增出来所有条带根据分子量的大小依次编号为1、2、3、4。A.3.2然后对每个泳道依据条带编号进行标志，图中有清晰条带的记为1，同一位置无带的记为0，统计条带的结果建立原始数据矩阵。A.3.3利用Excel将数据矩阵中1转换为黑色方块，将0转换为白色方块，统计杂交后代的带型与父母本带型差异性，结合4对引物的结果作为判定甘蔗后代真实性的重要依据。A.3.4依SMC334BS引物鉴定热带种（母本）与割手密（父本）的杂交后代为例，详见图A.1。A.3.5按照表格统计各参试材料的DNA带型，其中条带1、2、3、4和5是母本特有DNA条带，8、9、10和11为父本特有条带，6为父母本共有条带，7为后代新增条带。A.3.