高考生物复习（九）PCR和基因编辑技术（附解析）

微专题九PCR和基因编辑技术

一、PCR技术

典型示范

（2024・山东期末）拟南芥中RGL1能作为E3泛素连接酶（AtRZFl）的抑制因子在

响应植物干旱胁迫中发挥着重要作用。研究发现，AtRZFl功能丧失突变体比野生

型拟南芥具有更高的耐旱性。研究人员采用融合PCR技术（原理如图所示）将RGL1

酶基因和4RZ/H基因连接起来构建融合基因以研究两种基因的相互作用。下列说

法正确的是（）

RGL1

''引物1力3引第

第一4I

阶段,_________

第一/融合基因

阶段）=

引物1引物4

CZD

A.RGL1晦在植物干旱胁迫响应中起到正调控作用

B.图中第一阶段经过1次PCR循环即可获得双链等长的DNA

C.图中第二阶段构建融合基因时能够起到“搭桥融合”作用的引物有4种

D.融合PCR技术操作过程中的每个阶段都需经历两次降温和一次升温

【审题关键】信息①：融合PCR技术是一个新名词，要认真识图，明白原理;

信息②：由于DNA聚合牌都是从5,端到3,端复制子链，因此引物应结合到

模板的3,端；

信息③：由第一阶段知，人为增加了引物2和引物3的S端的一段序列；

信息④：由第二阶段知，人为增加的引物2和引物3的一段序列是可以碱基

互补配对的。

【解析】据题意，E3泛素连接酶（AtRZFl）功能丧失突变体比野生型拟南芥具

有更高的耐旱性，说明AtRZF1在干旱胁迫响应中起抑制作用，而RGL1酶作为AtR

ZF1的抑制因子，所以RGL1酶在植物干旱胁迫响应中起到正调控作用，A正确:

由图可知，引物2和引物3的一端都添加了一段序列，所以经过1次PCR循环得

禽考史物

到的是含有引物2、引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次

犷增(循环)，才能获得双链等长的DNA,B错误；由图可知，融合PCR中是通过

在引物2和引物3的一端添加能碱基互补配对的序列，从而在第二阶段利用这两

段互补序列形成具有重叠链的PCR弓I物，所以能够起到“搭桥融合”作用的引物有

2种，即引物2和引物3,C错误；PCR技术操作过程中，每轮循环是需要一次降

温和两次升温，D错误。

【答案】A

方法归纲

1.PCR的原理

(l)DNA半保留复制。

(2)DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。

2.PCR的条件

(1)模板：DNA母链。

(2)原料：4种脱氧核甘酸。

(3)®：耐高温的DNA聚合酶。

(4)能量。

(5)2种引物。

(6)含Mg2+的缓冲溶液。

3.PCR的过程

当温度超过90t时，双链DNA解聚为单链

3

5

I加热至90工以上

3।।।।।।।।।।55।।।11।।।।।3

温度卜降至50t左右时，两种引物通过碱

Wjj用互补配对与四条单链DNA结合

Sp.nnj#"15flM1下

引物i'引物n

当温度上升至72t左右时,耐高温的DNA

W讣一聚合做从引物开始进行互补链的合成(从

出9f5,端向3,端延伸)

55

33nmijj.Liiy

引物n

4.PCR产物测定方法：琼脂糖凝胶电泳。

5.PCR的应用

禽考史物

(I)目的基因的扩增。

(2)基因检测。

(3)测定DNA序列，进行亲子鉴定、遗传病的诊断、传染病毒的诊断。

6.常规PCR基础上改进的PCR分类

(1)逆转录PCR(RT-PCR)：提取总RNA,以mRNA为模板，利用寡脱氧胸

腺昔酸或随机引物在逆转录酷的作用下合成cDNA,再以cDNA为模板进行常规

的PCR扩增。

(2)实时PCR(real-limePCR),是一种定量测定样品中特定DNA片段的聚合

的链式反应。反应中一般使用带有荧光标记的PCR引物，从而能够通过荧光监测

每次PCR循环后扩增所得的产物的量。

(3)重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用

具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3,突起处代表与模板链不能互补的突

变位点)，分别进行PCR,获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应

中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。

拟突变位点

----------.3’

5'

第

一

阶

段引物।和引物3|使蚓引物3和

rPCK/4进行PC呢

----------5--'

第混合、变性后,杂交

二5,

阶|首先使用DNA聚合前延伸.

段!然后使川，物I和4进行PCR

突变后的甚因

(4)融合PCR技术采用具有G补末端引物，形成具有重叠链的PCR产物，冉

通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。与重

叠延伸PCR技术也有相似之处。

跟踪演练

1.(2024•山东期中)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其

原理是：在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某模板链互补的荧光探

针，荧光探针两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光猝灭基团，探针完整时,

发射基团发射的荧光信号被猝灭基团吸收,荧光监测系统接收不钊荧光信号.当

禽考史物

耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收

到荧光信号。即每扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图所示）。下列相关叙述正

确的是（）

^荧光探针

引物2QQ

3，A-、2c--------5，

5---------------------y

骸」■引物i

35

53

A.扩增过程中引物先于探针结合到模板DNA上

B.在PCR系统中需加入解旋酶

C荧光信号积累越多，说明PCR循环次数越多

D.若扩增〃次，则其需要消耗2"个探针

【解析】C基因扩增过程中需要特定的引物，该引物的作用是定位基因，与

模板链结合并为子链的延伸提供起点，扩增过程中引物和探针应同时结合到模板D

NA上，A错误；在PCR反应系统中无需加入解旋幅，可通过高温解旋DNA,B

错误；据题干信息“印每扩增一次，就有一个荧光分子生成“可知，灵光信号积累

越多，说明PCR循环次数越多，C正确；据题干信息“在PCR反应体系中每加入

一对引物的同时加入一个与某模板链互补的荧光探针”，即每个DNA分子需要1

个探针，扩增〃次，可得到2"个DNA分子，则共需要消耗2”—1个探针，D错误。

2.（2024・山东一模）IKK激酶由IKKa、IKKp和IKK7三种亚基组成，该酶参与

动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷（SCID）患儿的IKKp基

因编码区第1183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大

引物PCR定点诱变技术获得突变基因，并培育出SCID模型小鼠。图1为定点诱

变获得突变基因的过程。问答下列问题：

禽考史物

PCK,

IK印基因

PCR?―L5'

…大引物a

旃彩…“大引物b

SacI

方’

HindIII

注：定点诱变获得突变基因的过程，需要以下谕引物:

引物A：5/-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3,

、突变碱基

引物B：5/-TAAGCTTCGAACATCCTA-3,

^//indin识别序列

引物C：5f-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3f

I识别序列

图1

WTHEHO

IKKp；一.一叶B7kl)a

IKKa;----，♦-、.■

IKKyS3

对照蛋可

__________________________

胸腺淋巴细胞中IKK

激酶的：种亚基含ht

图2

(1)在定点诱变获取突变基因时，PCR中使用的引物有,PCR2

中使用的引物有。PCR和PCRz不能在同一个反应体系中进行，原

因是______________________________________________________________________

(2)PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95。(：数分钟进行预变性

处理，其目的是。由于大引物较长，含C与G的碱基较多,

为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应采取的措施是

(3)培育模型鼠的过程中，需用限制酶SacI、Hind川对突变基因和载体进行

双酶切，双酶切的优点是o研究人员经鉴定、筛选获得一

只转基因杂合鼠HE,让HE与野生鼠杂交得B，R雌雄鼠随机交配得F2。对F2

禽考史物

中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠H0、杂合鼠HE三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK

激IW的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图2。据此结果推测SCID患者免疫缺陷

产生的机制是_____________________________________________________________

【答案】（1）弓|物A、引物C引物B、大引物b

引物之间能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程（2）增加大分

子模板DNA彻底变性的概率适当提高复性温度

（3）防止质粒和目的基因的自身环化及反向连接IKKp基因突变导致IKK。含

量减少，IKK激酶活力降低，不利于免疫细胞的分化

【解析】（1）在PCR反应体系中，除需要加入引物和/K%基因外，还需要加

入Taq酶（耐高温的DNA聚合酹）、4种脱氧核昔酸（原料）、缓冲液（维持pH）、Mg2+（激

活DNA聚合酶）等；在图1获取突变基因过程中，分析题图可知，在PCR1中，需

要两种引物，将来在切取/KK6基因时，需要在基因的左侧用限制酶dIH来切

割，在基因的右侧用限制酶SacI来切割，因此在该基因的左端应有限制酶H加d

HI识别的序列，在基因的右端应有限制酶SacI识别的序列，因此在PCR】中结合

到基因右端的引物序列从5到3'端的开始部位应含有限制酶SacI识别的序列,所

以要用到引物C,从题图中看，另一个引物从5'到3'端的序列中开始部位应含有

突变碱基C,所以要用到引物A。从图中看，在PCR2中，有一个引物结合到了基

因的左端，在它从5,到3,的序列的开始部位应含有限制酶HI识别的序列，所

以要用到引物B,而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因

的右端，且从5'到3'端的序列中开始部位应含有SacI识别的序列，从图中看，它

是大引物的b链。由于PCR和PCR2过程使用的引物之间能结合，因而会干扰引

物和模板链的结合，影响PCR过程，因此PCR和PCR?不能在同一个反应体系中

进行，需要分开进行。（2）PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95℃

数分钟进行预变性处理，这样可以增加大分子模板DNA彻底变性的概率，为后续

的PCR过程创造条件。由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标

基因的获得，在PCR?复性过程中应适当提高复性温度，便于引物与模板链的结合。

（3）培育模型鼠的过程中，需用限制酶SacI、HindHI对突变基因和载体进行双酶

切，双酶切能保证质粒加目的基因的正确连操，避务自身环化及反向连提c研究

禽考史物

人员经篓定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE,让HE与野生鼠杂交得F1,R雌雄

鼠随机交配得F?。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠H0、杂合鼠HE三种小

鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果显示H0小鼠

体内不含IKKp或含量很少，因而可推测/K型基因突变导致IKKp含量减少，IKK

激酶活力降低，不利于免疫细胞的分化，进而导致SCID患者表现为免疫扶陷。

3.（2024•四川期末）某科研小组采用PCR技术构建了红色荧光蛋白基因（杰小01

和。一淀粉酶基因他照，）的治小溟一〃〃沙融合基因，其过程如图所示，其中引物②

和引物③中部分序列（黑色区域）可互补配对。下列说法错误的是（）

dsr?d2堪I月amy基因

5't

3尸引物①引物②干。」物③用物④亍

15'

杂交摊

=)3'

□5,

（lsre（i2-am）ifA合基因

A.利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA双链

B.不能在同一反应体系中进行dsredl基因和amy基因的扩增

C.dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链

D.杂交链延伸得到dsredl-amy融合基因的过程不需要加引物

【解析】C利用PCR技术扩增基因时，高温变性使DNA双链解旋，不需

要解旋酶来打开DNA双链，A正确；引物之间的结合会干扰引物和模板链的结

合，从而影响PCR过程，因此不能在同一个反应体系中进行dsrecil基因和amy

基因的犷增，B正确:力”42基因和m少基因混合可以得到两种类型的杂交链，C

错误；杂交链延伸得到&red2—融合基因的过程中，不需要加入引物，两条

母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，D正确。

二、基因组编辑技术

典型示范

（2024•浙江模拟预测）CRISPR/Cas9型因编辑系统是由Cas9蛋白和向导RNA

构成的复合体，可利用向导RNA识别并结合特定DNA序列，引导Cas9蛋白对

目标DNA进行编辑，其过程如卜图所不。利用该系统对某种野生食用真菌进行r

禽考史物

DNA编辑，培育出转基因真菌。CRISPR/Cas9系统的相关基因能否成功转入受体

⑴将真菌细胞置于一定浓度的PEG溶液中，一段时间后再与重组DNA混合

可以提高转化效率，其中PEG的作用是。在转基因真菌

的培育中，一般以原生质体为主，极少尝试菌丝体和抱子，说明遗传转化体系中―

的选择是制约转化效率的另一重要因素。

(2)野生型核基因组中含有〃wg、基因，这两类基因表达可产生乳清核甘

一5,一磷酸脱峻酹，参与催化尿n密咤的合成，通过CRISPR/Cas9编辑系统中的向

导RNA与基因中的序列进行,将Cas9蛋白带到靶基

因附近并对基因进行剪切。当目标基因序列被破坏后，菌体表现为尿喀咤营养缺

陷，只能在含有和5一氟乳清酸的培养基上正常生长，利用这种选

择作用可以初步区分出野生型真菌及完成了转化的转基因品系。研究发现CRISPR

/Cas9编辑系统中的向导RNA序列长度应当适中否则极易脱靶即难以精准找到目

标DNA序列，脱靶最可能的原因是__________________________________________

(3)Cas9蛋白和向导RNA基因在真菌细胞中表达水平低，可通过在基因一端

添加合适的来构建高表达基因编辑系统，还可以通过基因优化，使其

转录产物中含有真菌细胞高频使用，以此来提高翻译效率。

【审题关键】信息①：据“可利用向导RNA识别并结合特定DNA序列”，知

向导RNA应该是通过碱基互补配对结合特定DNA序列；

信息②：据⑵中“CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA序列长度应当适中否

则极易脱靶即难以精准找到目标DNA序列”，可知脱靶应该与RNA序列的长度有

关，若长度过短，特异性差，容易与其他基因的某些区域结合；

禽考史物

信息③：据“引导Cas9蛋白对目标DNA进行编辑"，知Cas9蛋白应该相当

于是一种限制酶。

【答案】(1)增加细胞膜的通透性受体细胞(2)pyrg^ura3互补配对(或特

异性识别并结合)尿喀唉其他基因序列中也有与向导RNA互补配对的序列，

造成向导RNA错误结合到有关基因区域(3)启动子密码子

方法归纳

1.基因组编辑的含义：对基因进行定点修改，以改变目的基因的序列和功能,

进行基因治疗和物种改良。

2.应用最广泛的技术：CRISPR/Cas9o

3.CR【SPR/Cas9组分及功能

作为，向导”，部分序列通过碱基互补配对，

短链RNA（sgRNA、向导RNA）与目的基因中希望被编辑的DNA序列结

合

与短链RNA结合，切割与向导RNA结合

细菌的核酸酶Cas9

的DNA,使DNA双链断裂

4.CRISPR/Cas9技术的主要应用

(1)基因敲除。

(2)特异突变引入。

(3)定点转基因。

5.CRISPR/Cas9技术的风险

(1)基因组编辑技术本身存在着识别准确性等方面的问题。

(2)对人类基因进行‘改造”时要严格遵守法律法规，不能违反人类的伦理道德。

跟踪演练

4.(2024•河南月考)我国科研人员通过基因治疗，成功治愈了全球苜例口一地中

海贫血症患者。研究人员运用高精准变形式碱基编辑器(tBE),对患者自体造血干

细胞中的单个碱基进行编辑，以重新激活丫一珠蛋白的表达，最终使患者血红蛋白

水平恢复正常，过程如图1所示。相较于图2中基于CRISPR技术的p—地贫基因

编辑疗法，该方法见效更快、疗效更好，且不引发患者基因组突变或片段缺失。

禽考史物

请回答下列问题:

胞喘嚏脱锐酹

n(la*9

RKNA

碱加错配修宓

DNA复制

⑴基因治疗中通常用到AAV（腺病毒）等,AAV的作用为

（2）据图2分析CRISPR技术中gRNA起________（填“导向”或“切割”）的作用。

相比CRISPR技术（切断双链），tBE不需要破坏DNA双链就能对致病的碱基突

变进行校正，由此可知tBE具有_________________________________________________

_____________________________________（写出］点即可）的优点。

（3）为了检测目的基因是否翻译成丫一珠蛋白，可采用的技术为

―。采用自体造血干细胞编辑移植的优点为（写出1

点即可）。

（4）欲验证图1中基因治疗方法对廿一地中海贫血症患者的疗效，请写出大致

实验思路。（注：使用的测量工具无需说明，P—地中海贫血症志愿者、健康志愿

者多人）__________________________________________________________________________

_______0

【答案】（I）作为载体将目的基因导入（受体）细胞（2）导向高安全性、高特

异性；针对单碱基进行编辑，正常不发生错编或误编的情况；见效更快、疗效更

好，且不引发患者基因组突变和片段缺失（3）抗原一抗体杂交不发生免疫排斥

反应（4）将生理状态、性别、年龄等相同的。一地中海贫血症志愿者随机均分为

甲、乙两组，分别测量二者的血红蛋白水平后，对甲组采用碱基编码疗法进行治

疗，乙组不采用，在相同且适宜条件下生活一段时间后，分别再次测量二者的血

红蛋白水平，并与健康志愿者的血红蛋白水平进行比较

5.（2024•福建期末）CRISPR/Ca$9是一种高效的基因编辑技术,原理如图I所示

禽考史物

由一条单链向导SgRNA引导Cas9蛋白识别并切割目标DNA双链的特定序列，

以敲除目标基因或插入新的基因。我国科学家领衔的团队利用CRISPR/Cas9等技

术，将的人突变亨廷顿舞蹈症致病基因(“7T基因)部分片段，插入猪基因组内，

获得/人一猪“镶嵌’777T基因，利用胚胎工程技术成功地构建了亨廷顿舞蹈症的

动物模型。

猪的〃7TJ£因

甲1口-1