补肾强督治偻方对强直性脊柱炎动物模型IL-23-Th17轴的调节机制研究

补肾强督治偻方对强直性脊柱炎动物模型IL-23/Th17轴的调节机制研究一、引言1.1研究背景与意义强直性脊柱炎（AnkylosingSpondylitis，AS）是一种主要侵犯中轴关节的慢性炎症性疾病，严重威胁人类健康。据流行病学调查显示，AS在全球范围内均有发病，其发病率因地区、种族不同而存在差异，在我国的发病率约为0.3%。AS好发于青壮年，通常在18-22岁左右发病，男女比例约为2:1，80%的病人首次出现症状在30岁内。由于发病隐匿，早期症状不典型，常易被忽视或误诊，导致病情延误。AS主要侵犯骶髂关节、脊柱关节、椎旁软组织及外周关节，病变呈进行性发展。随着病情进展，患者可出现腰背痛、膝关节痛、踝关节痛等关节疼痛症状，伴有晨僵，严重影响患者的睡眠质量和日常生活。病情进一步发展，可导致脊柱强直、畸形，使患者的身体活动功能严重受限，甚至致残，给患者带来极大的身心痛苦。除关节症状外，AS还可累及眼、心脏、肺脏、肾脏等多个器官系统，出现虹膜炎、葡萄膜炎、心脏瓣膜病变、肺间质纤维化、肾脏淀粉样变性等关节外表现，严重影响患者的生活质量和寿命。目前，AS的治疗主要包括药物治疗、物理治疗和手术治疗。药物治疗是AS治疗的核心，常用药物有非甾体抗炎药、抗风湿药、糖皮质激素以及生物制剂等。非甾体抗炎药可迅速缓解疼痛和炎症，但长期使用可能导致胃肠道不适、肝肾功能损害等不良反应；抗风湿药起效较慢，且部分药物存在骨髓抑制、肝损伤等副作用；糖皮质激素虽抗炎作用强大，但长期应用可引起骨质疏松、感染、血糖升高等多种并发症；生物制剂虽疗效显著，但价格昂贵，且存在感染、过敏等风险，限制了其广泛应用。物理治疗如热疗、按摩、康复训练等，可辅助缓解症状，但难以阻止病情进展。对于晚期出现严重关节畸形的患者，手术治疗如脊柱矫形术、关节置换术等可改善关节功能，但手术风险高，且术后仍需长期药物治疗和康复训练。因此，寻找安全、有效、经济的治疗方法是AS临床治疗的关键问题。中医在AS的治疗中具有独特优势，能从整体出发，辨证论治，副作用相对较小。补肾强督治偻方是根据中医理论，针对AS肾虚督寒证型研制的方剂。中医认为，AS属“肾痹”“疾痹”“督脉病”范畴，其发病与肾督亏虚、风寒湿邪侵袭密切相关。补肾强督治偻方以补肾强督、祛寒化湿、通活血脉、强筋健骨为主要功效，通过调节机体的整体功能，改善患者的症状和体征。临床研究表明，补肾强督治偻方治疗AS能有效缓解患者的腰背痛、晨僵等症状，降低炎症指标，改善关节功能，且安全性较高。然而，目前其作用机制尚未完全明确。近年来，IL-23/Th17轴在AS发病机制中的作用受到广泛关注。IL-23是一种细胞因子，主要由活化的巨噬细胞、树突状细胞等产生，它可诱导初始T细胞向Th17细胞分化。Th17细胞是一类新型的CD4+T细胞亚群，能分泌白细胞介素17（IL-17）、白细胞介素21（IL-21）、白细胞介素22（IL-22）等细胞因子。研究发现，AS患者体内IL-23、IL-17等细胞因子水平显著升高，且与疾病的活动度密切相关。IL-23/Th17轴通过介导炎症反应、促进骨破坏等机制，在AS的发病过程中发挥重要作用。因此，探讨补肾强督治偻方对AS动物模型IL-23/Th17轴的影响，对于揭示其治疗AS的作用机制，进一步优化治疗方案，提高临床疗效具有重要意义。1.2国内外研究现状在强直性脊柱炎发病机制的研究方面，国内外学者进行了大量探索。遗传因素在AS发病中的作用备受关注，人类白细胞抗原B27（HLA-B27）与AS的强相关性已得到广泛证实。双胞胎研究显示，B27阳性的同卵双胞胎患病一致率达63%，而B27阳性的异卵双胞胎患病一致率为23%，一级亲属是AS的HLA-B27阳性个体患病风险是无家族史的B27阳性个体的6-16倍。目前关于HLA-B27与AS发病关联的假说众多，如致关节炎多肽递呈假说认为，与AS相关的B27亚型可结合致关节炎多肽，激活CD8+CTL细胞，导致关节组织炎症。免疫因素方面，研究发现AS患者骨、关节及滑膜组织内有大量炎性T细胞、单核-巨噬细胞浸润，存在T细胞应答和Th1/Th2细胞因子平衡偏移。感染因素也被认为与AS发病相关，60%以上的AS患者有亚临床炎症改变，血清IgA抗体水平明显升高，且多数患者有肠道或泌尿生殖系细菌感染，推测HLA-B27因与细菌抗原片段存在分子水平的模拟而参与AS的发生。在治疗方法研究上，西医治疗手段多样。非甾体抗炎药是常用的一线治疗药物，通过抑制环氧化酶（COX）的活性，减少前列腺素合成，从而减轻炎症和疼痛。但长期使用会带来胃肠道不适、肝肾功能损害等不良反应。改善病情抗风湿药（DMARDs）如柳氮磺吡啶，可改善AS患者的病情，但起效慢，一般需数周甚至数月才能见效。甲氨蝶呤在AS治疗中的应用存在争议，部分研究认为其对改善中轴关节症状效果不佳。生物制剂的出现为AS治疗带来新突破，肿瘤坏死因子α（TNF-α）拮抗剂如依那西普、英夫利昔单抗等，能特异性阻断TNF-α的生物学活性，显著缓解AS患者的炎症和疼痛症状，改善关节功能。然而，生物制剂价格昂贵，且存在感染、过敏等风险，限制了其广泛应用。近年来，针对IL-17、IL-23等细胞因子的生物制剂也逐渐应用于临床，为AS治疗提供了更多选择。中医对AS的认识历史悠久，将其归为“肾痹”“疾痹”“督脉病”等范畴。中医认为，AS的发病主要与肾督亏虚、风寒湿邪侵袭密切相关。在治疗上，强调从整体出发，辨证论治。补肾强督治偻方是基于中医理论，针对AS肾虚督寒证研制的方剂。临床研究表明，补肾强督治偻方治疗AS具有较好的疗效。有研究对30例肾虚督寒证AS患者采用补肾强督治偻汤治疗24周，结果显示治疗后患者的脊柱痛、晨僵时间等主要疗效指标明显改善，中医证候疗效总有效率达90.00%。另有研究将补肾强督治偻汤与小针刀联合应用于AS治疗，发现联合治疗组的中医证候疗效总有效率高达92.50%，显著优于单纯药物治疗组。在对补肾强督治偻方作用机制的研究中，部分研究从调节骨代谢角度进行探讨。研究发现，该方可能通过调节骨保护素（OPG）/核因子κB受体活化因子配体（RANKL）/核因子κB受体活化因子（RANK）信号传导通路，降低AS患者血清RANKL水平，升高OPG水平，从而减缓或防止骨质破坏。还有研究认为补肾强督治偻方可能通过调节免疫功能发挥治疗作用，但具体作用机制尚未完全明确。尽管国内外对AS的研究取得一定进展，但仍存在不足。在发病机制方面，虽然多个因素被认为与AS发病相关，但各因素之间的相互作用及具体致病机制尚未完全阐明。在治疗方面，目前的治疗方法虽能缓解症状，但难以根治AS，且部分治疗方法存在副作用或费用高昂等问题。对于补肾强督治偻方，其治疗AS的临床疗效已得到一定证实，然而其作用机制的研究还不够深入全面，尤其是对IL-23/Th17轴的影响研究较少，有待进一步深入探究。1.3研究目的与内容本研究旨在深入探究补肾强督治偻方对强直性脊柱炎动物模型IL-23/Th17轴的影响，揭示其治疗强直性脊柱炎的潜在作用机制，为临床应用提供更坚实的理论依据。在研究内容上，本研究将通过实验，运用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，检测各组动物血清及关节组织中IL-23、IL-17等细胞因子的表达水平，对比分析补肾强督治偻方干预前后这些细胞因子水平的变化情况，明确该方对IL-23/Th17轴相关细胞因子的调节作用。同时，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）技术，检测Th17细胞相关转录因子维甲酸相关孤儿受体γt（RORγt）以及IL-23/Th17轴相关信号通路分子的mRNA表达水平，采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测上述分子的蛋白表达水平，从基因和蛋白层面探究补肾强督治偻方对IL-23/Th17轴信号通路的影响机制。此外，本研究还将对动物的关节组织进行病理切片，通过苏木精-伊红（HE）染色观察关节组织的病理形态学变化，采用免疫组织化学法检测关节组织中IL-23、IL-17等细胞因子的表达定位，从组织形态学角度进一步阐述补肾强督治偻方对强直性脊柱炎动物模型关节病变的改善作用及对IL-23/Th17轴的影响。1.4研究方法与技术路线本研究采用实验法、文献研究法相结合的方式开展研究。在实验法方面，选用合适的动物建立强直性脊柱炎动物模型，将动物随机分组后，分别给予补肾强督治偻方不同剂量干预以及阳性对照药物干预，通过对动物的各项指标检测，分析补肾强督治偻方对强直性脊柱炎动物模型IL-23/Th17轴的影响。文献研究法则用于广泛收集和整理国内外关于强直性脊柱炎发病机制、治疗方法以及IL-23/Th17轴相关的研究资料，为实验研究提供理论依据和研究思路，明确研究的切入点和创新点。技术路线如下：首先进行动物模型建立，选取特定品系的大鼠或小鼠，采用经典的造模方法如注射弗氏完全佐剂等诱导强直性脊柱炎动物模型。造模成功后，将动物随机分为正常对照组、模型对照组、补肾强督治偻方低剂量组、补肾强督治偻方中剂量组、补肾强督治偻方高剂量组以及阳性药物对照组。正常对照组给予生理盐水灌胃，模型对照组给予等量生理盐水，各药物干预组分别给予相应药物灌胃，按照设定的疗程进行干预。干预结束后，采集动物血清及关节组织样本。利用ELISA技术检测血清及关节组织中IL-23、IL-17等细胞因子水平；运用RT-qPCR技术检测Th17细胞相关转录因子RORγt以及IL-23/Th17轴相关信号通路分子的mRNA表达水平；通过Westernblot检测上述分子的蛋白表达水平。同时，对关节组织进行病理切片，进行HE染色观察病理形态学变化，采用免疫组织化学法检测关节组织中IL-23、IL-17等细胞因子的表达定位。最后，对各项检测数据进行统计学分析，明确补肾强督治偻方对强直性脊柱炎动物模型IL-23/Th17轴的影响，具体流程见图1。[此处插入技术路线图，图中清晰展示从动物建模、分组给药、样本采集到各项检测分析的整个流程，各步骤之间以箭头连接，标注清楚每个步骤的关键操作和检测指标]二、相关理论基础2.1强直性脊柱炎概述2.1.1定义与流行病学特征强直性脊柱炎是一种主要侵犯中轴关节的慢性炎症性疾病，属于血清阴性脊柱关节病范畴。其病理特征为附着点炎，可累及骶髂关节、脊柱关节、椎旁软组织及外周关节，随着病情进展，可导致脊柱强直、畸形，严重影响患者的生活质量。在全球范围内，AS的发病率存在一定差异。据统计，AS在白种人中的发病率约为0.1%-1.4%，在亚洲人群中的发病率相对较低，如日本的发病率约为0.05%-0.2%，我国的发病率约为0.25%-0.5%。AS好发于青壮年，发病高峰年龄在20-30岁之间，小于8岁和大于40岁发病的患者相对少见。男女发病比例约为2-3:1，男性患者病情往往较重，进展较快，更容易出现脊柱强直和畸形；而女性患者症状相对较轻，发病较隐匿，病情进展相对缓慢。在地域分布上，AS在世界各地均有发病，但不同地区的发病率可能与遗传因素、环境因素等有关。例如，在一些北欧国家，AS的发病率相对较高，可能与当地人群中HLA-B27基因的携带率较高有关。2.1.2病因与发病机制AS的病因和发病机制尚未完全明确，目前认为是遗传因素、免疫因素、感染因素等多种因素相互作用的结果。遗传因素在AS发病中起着重要作用。研究表明，AS具有明显的家族聚集倾向，约90%的患者人类白细胞抗原B27（HLA-B27）呈阳性。HLA-B27基因与AS的发病密切相关，但其具体致病机制尚未完全阐明。目前有多种假说，如致关节炎多肽递呈假说认为，HLA-B27分子可结合特定的致关节炎多肽，激活免疫系统，导致炎症反应；分子模拟假说认为，HLA-B27与某些病原体的抗原分子结构相似，免疫系统在攻击病原体时，会误将自身组织当作靶标，引发自身免疫反应。除HLA-B27外，还有其他一些基因也可能与AS的发病相关，如IL-23受体基因、内质网氨肽酶1基因等，这些基因的多态性可能影响AS的易感性和病情进展。免疫因素在AS的发病过程中也起着关键作用。AS患者存在免疫功能紊乱，表现为T细胞、B细胞、巨噬细胞等免疫细胞的活化和增殖异常。在AS患者的骨、关节及滑膜组织内，有大量炎性T细胞、单核-巨噬细胞浸润，这些细胞可分泌多种细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）等，参与炎症反应和组织损伤。此外，AS患者还存在Th1/Th2细胞因子平衡偏移，Th1细胞及其分泌的细胞因子如干扰素γ（IFN-γ）等表达升高，Th2细胞及其分泌的细胞因子如IL-4、IL-10等表达降低，导致免疫调节失衡，促进炎症的发生和发展。感染因素被认为与AS的发病有关。研究发现，60%以上的AS患者有亚临床炎症改变，血清IgA抗体水平明显升高，且多数患者有肠道或泌尿生殖系细菌感染，如肺炎克雷伯菌、沙眼衣原体、志贺菌、沙门菌和结肠耶尔森菌等。这些病原体可能通过分子模拟机制，诱导机体产生针对自身组织的免疫反应，从而参与AS的发病。例如，肺炎克雷伯菌的某些抗原片段与HLA-B27分子存在相似性，免疫系统在识别肺炎克雷伯菌时，可能会错误地攻击表达HLA-B27的自身细胞，引发炎症反应。此外，感染还可能通过激活免疫系统，促进细胞因子的分泌，进一步加重炎症反应。近年来，IL-23/Th17轴在AS发病机制中的作用受到广泛关注。IL-23是一种细胞因子，主要由活化的巨噬细胞、树突状细胞等产生。它可诱导初始T细胞向Th17细胞分化。Th17细胞是一类新型的CD4+T细胞亚群，能分泌白细胞介素17（IL-17）、白细胞介素21（IL-21）、白细胞介素22（IL-22）等细胞因子。研究发现，AS患者体内IL-23、IL-17等细胞因子水平显著升高，且与疾病的活动度密切相关。IL-23/Th17轴通过介导炎症反应、促进骨破坏等机制，在AS的发病过程中发挥重要作用。IL-17可刺激成纤维细胞、滑膜细胞等分泌多种促炎细胞因子和趋化因子，如TNF-α、IL-6、IL-8等，吸引更多的炎性细胞浸润，加重炎症反应。IL-17还可促进破骨细胞的活化和增殖，抑制成骨细胞的功能，导致骨破坏和骨重塑失衡，促进AS患者脊柱强直和畸形的发生。2.1.3临床表现与诊断标准AS的临床表现多样，早期症状常不典型，容易被忽视或误诊。多数患者起病隐匿，首发症状常为下腰背痛伴晨僵，疼痛可在夜间休息或久坐时加重，活动后可以减轻。疼痛可放射至臀部、腹股沟向下肢放射，部分患者可表现为单侧、双侧或交替性臀部疼痛。随着病情进展，疼痛逐渐加重，可出现脊柱僵硬、活动受限，整个脊柱常自下而上发生强直。患者可出现腰椎前凸消失、胸椎后凸增加、颈椎活动受限等脊柱畸形表现，严重影响身体的正常功能和外观。除脊柱症状外，AS还可累及外周关节，如髋关节、膝关节、踝关节等，出现关节疼痛、肿胀、活动受限等症状。其中，髋关节受累较为常见，且病情严重程度与预后密切相关。若髋关节病变未能及时控制，可导致髋关节强直、畸形，严重影响患者的行走能力和生活质量。AS还可出现关节外表现，如眼部受累可导致葡萄膜炎、虹膜炎，患者可出现眼痛、畏光、流泪、视力下降等症状；心脏受累可出现主动脉瓣关闭不全、传导阻滞等心脏病变；肺部受累可出现肺间质纤维化，患者可出现咳嗽、气短等症状；肾脏受累可出现肾脏淀粉样变性，表现为蛋白尿、肾功能不全等。目前，AS的诊断主要依据临床症状、体征、影像学检查及实验室检查等综合判断。临床症状和体征方面，下腰背痛持续至少3个月，活动后改善，休息后无缓解；腰椎在前后和侧屈方向活动受限；胸廓活动度低于相应年龄、性别的正常人等，这些症状和体征对AS的诊断具有重要提示意义。影像学检查是诊断AS的关键，骶髂关节X线检查是常用的初筛方法，早期可表现为骶髂关节面模糊、骨质破坏、关节间隙增宽或狭窄等，晚期可出现关节融合、强直。CT检查对于早期病变的发现更为敏感，能清晰显示骶髂关节的细微结构改变。磁共振成像（MRI）检查不仅能发现早期的骶髂关节炎，还能显示关节周围软组织的炎症和骨髓水肿情况，对于早期诊断和病情评估具有重要价值。实验室检查方面，HLA-B27检测对于AS的诊断具有重要参考价值，但HLA-B27阳性并不一定意味着患有AS，还需结合其他临床表现和检查结果综合判断。此外，红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）等炎症指标在AS患者中常升高，可反映疾病的活动程度。2.2IL-23/Th17轴与强直性脊柱炎的关系2.2.1IL-23/Th17轴的组成与功能IL-23/Th17轴主要由IL-23和Th17细胞及其分泌的细胞因子组成。IL-23是白细胞介素12（IL-12）细胞因子家族的成员，由p40和p19两个亚基组成，其中p19亚基是IL-23所特有的，决定了IL-23的特异性。IL-23主要由活化的巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞产生。IL-23的受体（IL-23R）表达于Th17细胞等细胞表面，由IL-12Rβ1和IL-23R两个亚基组成。当IL-23与IL-23R结合后，可激活细胞内的信号通路，如JAK-STAT信号通路，进而诱导相关基因的表达，发挥其生物学功能。Th17细胞是一类新型的CD4+T细胞亚群，由初始T细胞在特定的细胞因子环境下分化而来。在IL-6、转化生长因子β（TGF-β）等细胞因子的刺激下，初始T细胞可分化为Th17细胞。在分化过程中，维甲酸相关孤儿受体γt（RORγt）发挥关键作用，它是Th17细胞特异性的转录因子，可调控Th17细胞相关基因的表达，促进Th17细胞的分化和发育。Th17细胞能分泌多种细胞因子，其中白细胞介素17（IL-17）是其标志性细胞因子，此外还包括IL-21、IL-22、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等。IL-23在Th17细胞的分化和维持中起着重要作用。研究表明，IL-23可促进Th17细胞的增殖和存活，增强其分泌细胞因子的能力。在体外实验中，将初始T细胞与IL-6、TGF-β共同培养时，可诱导少量Th17细胞的产生；而当加入IL-23后，Th17细胞的数量显著增加，且分泌的IL-17等细胞因子水平也明显升高。IL-23还可通过调节RORγt的表达，影响Th17细胞的分化。敲低IL-23R基因后，RORγt的表达降低，Th17细胞的分化受到抑制。IL-17是Th17细胞分泌的关键促炎细胞因子，具有强大的促炎功能。IL-17可作用于多种细胞，如成纤维细胞、滑膜细胞、内皮细胞等，刺激这些细胞分泌多种促炎细胞因子和趋化因子，如IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等。这些细胞因子和趋化因子可吸引中性粒细胞、单核细胞等炎性细胞浸润到炎症部位，进一步加重炎症反应。IL-17还可促进基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，MMPs能够降解细胞外基质，导致组织损伤和破坏。在关节炎动物模型中，注射IL-17可导致关节炎症和骨质破坏加重，而使用IL-17拮抗剂则可减轻炎症和骨质破坏。此外，IL-17还可参与调节免疫细胞的功能，如促进B细胞的活化和抗体分泌，增强自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞毒性等。2.2.2IL-23/Th17轴在强直性脊柱炎发病中的作用机制IL-23/Th17轴在强直性脊柱炎的发病过程中扮演着关键角色，主要通过介导炎症反应、促进骨质破坏和导致免疫失衡等机制参与疾病的发生和发展。在炎症反应方面，AS患者体内IL-23/Th17轴处于异常激活状态。研究发现，AS患者血清和关节组织中IL-23、IL-17等细胞因子水平显著高于健康人群，且与疾病的活动度呈正相关。IL-23可诱导初始T细胞向Th17细胞分化，增加Th17细胞的数量。Th17细胞分泌的IL-17等细胞因子可刺激滑膜细胞、成纤维细胞等分泌多种促炎细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-8等。这些促炎细胞因子可激活炎症细胞，吸引更多的炎性细胞如中性粒细胞、单核细胞等浸润到关节组织，形成炎症级联反应，导致关节炎症的持续和加重。IL-17还可上调黏附分子的表达，如细胞间黏附分子1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）等，促进炎性细胞与血管内皮细胞的黏附，使其更容易迁移到炎症部位，进一步加剧炎症反应。在骨质破坏方面，IL-23/Th17轴也发挥着重要作用。IL-17可促进破骨细胞的活化和增殖，抑制成骨细胞的功能，导致骨吸收增加和骨形成减少，从而引起骨质破坏。IL-17可通过多种途径促进破骨细胞的生成。它能刺激成纤维细胞、滑膜细胞等分泌核因子κB受体活化因子配体（RANKL），RANKL是破骨细胞分化和活化的关键因子，与破骨细胞前体细胞表面的RANK结合后，可诱导破骨细胞的分化和成熟。IL-17还可直接作用于破骨细胞前体细胞，促进其表达RANK，增强对RANKL的敏感性，从而促进破骨细胞的生成。同时，IL-17可抑制成骨细胞的功能，减少骨保护素（OPG）的分泌。OPG是RANKL的天然拮抗剂，可与RANKL结合，阻断其与RANK的相互作用，从而抑制破骨细胞的活化和增殖。IL-17通过降低OPG的水平，间接促进了破骨细胞的活性，导致骨破坏加剧。在AS患者的脊柱和骶髂关节等部位，可观察到大量破骨细胞的聚集和骨质破坏现象，与IL-17的高表达密切相关。在免疫失衡方面，IL-23/Th17轴的异常激活打破了机体正常的免疫调节平衡。正常情况下，机体的免疫系统通过多种细胞和细胞因子之间的相互作用，维持着免疫稳态。然而，在AS患者中，IL-23/Th17轴的过度激活导致Th17细胞及其分泌的细胞因子大量增加，打破了Th17细胞与调节性T细胞（Treg）之间的平衡。Treg细胞具有免疫抑制功能，可抑制免疫细胞的活化和增殖，维持免疫耐受。IL-23/Th17轴的激活可抑制Treg细胞的功能和数量，使机体的免疫抑制作用减弱，免疫反应过度增强，从而导致自身免疫反应的发生，进一步损伤关节组织。IL-23/Th17轴还可影响其他免疫细胞的功能，如B细胞、NK细胞等，导致免疫功能紊乱，促进AS的发病和进展。2.2.3靶向IL-23/Th17轴的治疗策略鉴于IL-23/Th17轴在强直性脊柱炎发病中的重要作用，靶向该轴的治疗策略成为研究热点。目前，针对IL-23/Th17轴的生物制剂主要包括IL-17抑制剂和IL-23抑制剂。IL-17抑制剂通过阻断IL-17的生物学活性，抑制炎症反应和骨质破坏。司库奇尤单抗（Secukinumab）是一种全人源化的抗IL-17A单克隆抗体，已被广泛应用于AS的治疗。多项临床试验表明，司库奇尤单抗能显著改善AS患者的临床症状和体征，降低疾病活动度。在一项为期52周的Ⅲ期临床试验中，使用司库奇尤单抗治疗的AS患者，其脊柱疼痛、晨僵时间、巴斯强直性脊柱炎疾病活动指数（BASDAI）等指标均较安慰剂组有明显改善。依奇珠单抗（Ixekizumab）也是一种抗IL-17A单克隆抗体，在治疗AS方面也显示出良好的疗效。它可快速缓解AS患者的疼痛和炎症，提高患者的生活质量。IL-23抑制剂通过抑制IL-23的功能，阻断Th17细胞的分化和活化，从而减轻炎症反应。古塞奇尤单抗（Guselkumab）是一种靶向IL-23p19亚基的单克隆抗体。研究发现，古塞奇尤单抗可有效改善AS患者的病情，降低炎症指标。在一项针对中重度AS患者的临床试验中，使用古塞奇尤单抗治疗后，患者的C反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）等炎症指标明显下降，关节功能得到改善。虽然靶向IL-23/Th17轴的生物制剂在AS治疗中取得了一定疗效，但也面临一些挑战。这些生物制剂价格昂贵，限制了其在临床的广泛应用。部分患者对生物制剂存在耐药性或治疗反应不佳，需要寻找新的治疗靶点和方法。生物制剂还可能带来一些不良反应，如感染风险增加、过敏反应等。使用IL-17抑制剂可能会增加患者发生上呼吸道感染、皮肤感染等感染性疾病的风险。因此，在使用这些生物制剂时，需要密切监测患者的不良反应，权衡治疗的利弊。2.3中医对强直性脊柱炎的认识与治疗2.3.1中医对强直性脊柱炎的病因病机认识中医虽无“强直性脊柱炎”的病名，但根据其症状表现，可将其归属于“肾痹”“疾痹”“督脉病”“大偻”等范畴。《素问・痹论》云：“肾痹者，善胀，尻以代踵，脊以代头。”生动描述了本病晚期脊柱强直、畸形的典型表现。中医认为，本病的发生主要与先天禀赋不足、肾虚督寒、外感风寒湿邪以及气血瘀滞等因素密切相关。先天禀赋不足在AS发病中起重要的内在作用。肾为先天之本，主骨生髓，藏精纳气。若先天禀赋不足，肾精亏虚，骨髓生化无源，骨骼失于滋养，则易导致骨骼脆弱，易受外邪侵袭。督脉行于脊背正中，总督一身之阳气，为“阳脉之海”。肾与督脉关系密切，《素问・骨空论篇》载督脉“贯脊属肾”。肾精亏虚，可致督脉空虚，阳气不充，卫外不固，风寒湿邪易乘虚而入，侵袭脊柱关节，导致脊柱疼痛、僵硬等症状。如焦树德依据《素问・生气通天论篇》“阳气者开阖不得，寒气从之，乃生大偻”，将AS归入“大偻”中探讨，认为肾督阳虚是本病内因，寒邪入侵为外因，内外合邪乃致本病。彭江云认为AS以“阳虚邪凑”为病机，肾虚督寒致风寒湿热等邪气乘虚侵袭，使气血不通，阻于督脉而成本病。风寒湿邪侵袭是AS发病的重要外在因素。风为百病之长，善行而数变；寒为阴邪，易伤阳气，凝滞血脉；湿为阴邪，其性黏滞重浊。若居处潮湿、冒雨涉水、贪凉露宿等，风寒湿邪可侵袭人体，留着于肌肉、关节、经络，导致气血运行不畅，经络痹阻，不通则痛。《诸病源候论・风病诸候》曰：“风寒湿三气杂至，合而成痹。”长期感受风寒湿邪，可使病情缠绵难愈，逐渐发展为AS。气血瘀滞在AS的病程中也起着重要作用。疾病初期，由于外邪侵袭，气血运行不畅，可出现气滞血瘀；随着病情进展，久病入络，瘀血阻滞经络，可导致关节疼痛加剧，活动受限，甚至出现脊柱强直、畸形。气血瘀滞还可影响脏腑功能，导致脏腑气血不足，进一步加重病情。2.3.2补肾强督治偻方的组方原理与临床应用补肾强督治偻方是在中医理论指导下，针对强直性脊柱炎肾虚督寒证型精心研制的方剂，其组方原理蕴含着深刻的中医智慧。方中以熟地黄、淫羊藿、狗脊等为君药，熟地黄味甘，性微温，归肝、肾经，具有滋阴补血、益精填髓之功效，可补肾填精，为补肾要药；淫羊藿味辛、甘，性温，归肝、肾经，能补肾壮阳、祛风除湿，可温补肾阳，强筋健骨；狗脊味苦、甘，性温，归肝、肾经，有补肝肾、强腰膝、祛风湿之效，可补肾强督，强壮腰膝。三药合用，共奏补肾填精、强筋壮骨、温补肾阳、强腰膝、祛风湿之功效，从根本上改善肾虚督寒的病理状态。鹿角霜、制附片为臣药，鹿角霜味咸、涩，性温，归肝、肾经，能温肾助阳、收敛止血，可增强补肾阳、强筋骨的作用；制附片味辛、甘，性大热，归心、肾、脾经，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效，可温补肾阳，散寒止痛，助君药温肾助阳之力。骨碎补、补骨脂亦为臣药，骨碎补味苦，性温，归肝、肾经，能补肾强骨、续伤止痛，可补肾壮骨，促进骨骼修复；补骨脂味辛、苦，性温，归肾、脾经，有补肾壮阳、固精缩尿、温脾止泻之效，可补肾助阳，增强肾脏功能。臣药的配伍，进一步增强了补肾强督、散寒止痛的作用。羌活、独活、防风、川牛膝等为佐药，羌活味辛、苦，性温，归膀胱、肾经，可解表散寒、祛风胜湿、止痛，善治上半身风湿痹痛；独活味辛、苦，性微温，归肾、膀胱经，能祛风除湿、通痹止痛，善治下半身风湿痹痛；防风味辛、甘，性微温，归膀胱、肝、脾经，有祛风解表、胜湿止痛、止痉之效，可祛风除湿，通络止痛；川牛膝味甘、微苦，性平，归肝、肾经，能逐瘀通经、通利关节、利尿通淋，可通利关节，引药下行，增强祛风湿、通经络的作用。佐药的运用，可祛风除湿、通经络，协助君、臣药治疗风寒湿邪侵袭之症。全方配伍严谨，以补肾强督为主，祛寒化湿、通活血脉、强筋健骨为辅，标本兼治，共奏补肾强督、祛寒化湿、通活血脉、强筋健骨之效，使肾虚得补，督脉得充，寒湿得除，气血通畅，筋骨强健，从而达到治疗强直性脊柱炎肾虚督寒证的目的。在临床应用中，补肾强督治偻方展现出了良好的疗效。有研究对30例肾虚督寒证AS患者采用补肾强督治偻汤治疗24周，结果显示治疗后患者的脊柱痛、晨僵时间等主要疗效指标明显改善，中医证候疗效总有效率达90.00%。另有研究将补肾强督治偻汤与小针刀联合应用于AS治疗，发现联合治疗组的中医证候疗效总有效率高达92.50%，显著优于单纯药物治疗组。这些研究表明，补肾强督治偻方能够有效缓解AS患者的症状，改善关节功能，提高患者的生活质量。补肾强督治偻方还具有较好的安全性。在临床应用过程中，未见明显的不良反应，患者对药物的耐受性良好。这使得补肾强督治偻方在AS的治疗中具有独特的优势，为AS患者提供了一种安全、有效的治疗选择。三、实验材料与方法3.1实验动物与材料3.1.1实验动物的选择与来源本研究选用SPF级BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22g。选择BALB/c小鼠作为实验动物，主要是因为其遗传背景清晰，个体差异小，对免疫刺激反应较为敏感且稳定。在多项免疫相关疾病的研究中，BALB/c小鼠已被广泛应用，并取得了可靠的实验结果。在研究类风湿关节炎的发病机制及药物治疗效果时，BALB/c小鼠被用于构建胶原诱导性关节炎模型，为相关研究提供了重要的数据支持。在强直性脊柱炎的研究中，BALB/c小鼠也常用于构建蛋白聚糖诱导的关节炎模型，能较好地模拟强直性脊柱炎的病理特征。本实验的小鼠购自[具体供应商名称]，动物生产许可证号为[许可证号]。小鼠饲养于[饲养单位]的SPF级动物实验室，室内温度控制在（23±2）℃，相对湿度保持在（50±10）%，12h光照/12h黑暗交替，自由摄食和饮水。在实验开始前，小鼠适应性饲养1周，以确保其生理状态稳定，适应实验环境。3.1.2主要实验试剂与仪器设备实验所需的补肾强督治偻方药材，包括熟地黄、淫羊藿、狗脊、鹿角霜、制附片、骨碎补、补骨脂、羌活、独活、防风、川牛膝等，均购自[药材供应商名称]，经专业中药鉴定人员鉴定，符合《中华人民共和国药典》相关标准。药材在使用前，经洗净、干燥、粉碎等预处理。将药材按一定比例混合后，加适量蒸馏水浸泡，然后煎煮2次，每次1-2h，合并煎液，过滤，浓缩至所需浓度，制成补肾强督治偻方水提液，4℃保存备用。阳性对照药物塞来昔布，购自[药品生产厂家]，规格为[具体规格]，使用时用适量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成所需浓度。牛软骨来源的蛋白聚糖（PG），购自[试剂公司名称]，用于诱导小鼠强直性脊柱炎模型。将PG溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成一定浓度的溶液，与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化，制成PG-CFA乳化液，现用现配。大肠杆菌脂多糖（LPS），购自[试剂品牌]，采用腹腔注射的方式给予小鼠，给药剂量为50mg/只。抗小鼠IL-23、IL-17、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，均购自[试剂盒生产厂家]，用于检测小鼠血清及组织中相关细胞因子的含量。RNA提取试剂TRIzol，购自[试剂品牌]；逆转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）试剂盒，均购自[试剂盒品牌]，用于检测相关基因的mRNA表达水平。蛋白质提取试剂RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等，均购自[试剂公司]；BCA蛋白定量试剂盒，购自[试剂盒品牌]；抗小鼠RORγt、p-STAT3、STAT3等蛋白的抗体，以及相应的二抗，均购自[抗体生产厂家]，用于蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测相关蛋白的表达水平。实验所需的主要仪器设备包括：电子天平（[品牌及型号]），用于称量药材、试剂等；高速冷冻离心机（[品牌及型号]），用于分离血清、细胞等；酶标仪（[品牌及型号]），用于ELISA实验的检测；实时荧光定量PCR仪（[品牌及型号]），用于基因表达水平的检测；电泳仪（[品牌及型号]）和凝胶成像系统（[品牌及型号]），用于Westernblot实验；石蜡切片机（[品牌及型号]）和显微镜（[品牌及型号]），用于组织病理切片的制备和观察。3.2实验方法3.2.1强直性脊柱炎动物模型的构建采用牛软骨来源的蛋白聚糖（PG）构建蛋白聚糖诱导小鼠关节炎模型（PGIA）。具体方法为：将牛软骨来源的蛋白聚糖溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成10mg/mL的溶液，与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化，制成PG-CFA乳化液。在实验第0天，对小鼠进行背部皮下多点注射PG-CFA乳化液，每只小鼠注射0.2mL，以诱导免疫反应。在实验第14天，对小鼠进行加强免疫，同样采用背部皮下多点注射的方式，给予小鼠注射0.2mL的PG-CFA乳化液。在造模过程中，每天对小鼠的关节肿胀程度进行观察和评分。关节肿胀评分标准如下：0分表示无肿胀；1分表示轻微肿胀，关节轮廓稍模糊；2分表示中度肿胀，关节轮廓明显模糊，可触及轻微增厚；3分表示重度肿胀，关节明显肿大，增厚明显，活动受限。当小鼠的关节肿胀评分持续3天达到2分及以上，且至少有2个关节出现肿胀时，判定造模成功。造模成功后，对小鼠进行随机分组，每组10只。3.2.2补肾强督治偻方的制备与给药补肾强督治偻方水提液的制备：将补肾强督治偻方药材按比例称取，加适量蒸馏水浸泡30min，然后煎煮2次，每次1.5h，合并煎液，过滤，浓缩至生药浓度为1g/mL，4℃保存备用。补肾强督治偻方冻干粉的制备：将上述制备好的水提液进行冷冻干燥处理。先将水提液置于-80℃冰箱中预冻24h，然后放入冷冻干燥机中，在-50℃、真空度为10Pa的条件下进行升华干燥48h，最后在30℃下进行解析干燥24h，得到补肾强督治偻方冻干粉。将冻干粉用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成所需浓度的混悬液。将造模成功的小鼠随机分为模型对照组、补肾强督治偻方低剂量组、补肾强督治偻方中剂量组、补肾强督治偻方高剂量组和阳性药物对照组，每组10只。正常对照组给予生理盐水灌胃，模型对照组给予等量生理盐水灌胃，补肾强督治偻方低、中、高剂量组分别按5g/kg、10g/kg、20g/kg的剂量给予补肾强督治偻方混悬液灌胃，阳性药物对照组给予塞来昔布（10mg/kg）混悬液灌胃。每天灌胃1次，连续给药28天。3.2.3检测指标与方法关节肿胀评分：在给药期间，每天观察并记录小鼠的关节肿胀情况，按照上述关节肿胀评分标准进行评分，以评估药物对关节炎症的改善作用。脾脏指数和胸腺指数：在实验结束后，将小鼠脱颈椎处死，迅速取出脾脏和胸腺，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，称重。计算脾脏指数和胸腺指数，公式如下：脾脏指数（mg/g）=脾脏重量（mg）/体重（g）；胸腺指数（mg/g）=胸腺重量（mg）/体重（g）。通过比较各组小鼠的脾脏指数和胸腺指数，了解药物对免疫器官的影响。流式细胞术检测脾脏Th17细胞比例：取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，用红细胞裂解液裂解红细胞，PBS洗涤后，加入抗小鼠CD4-FITC、IL-17-PE抗体，4℃避光孵育30min。用PBS洗涤后，加入固定破膜剂，按照说明书操作进行固定和破膜处理。最后用流式细胞仪检测Th17细胞（CD4+IL-17+）的比例，分析补肾强督治偻方对Th17细胞分化的影响。酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清及回肠组织中细胞因子表达：在实验结束时，眼球取血，分离血清。同时取小鼠回肠组织，用生理盐水冲洗后，加入适量RIPA裂解液，冰上匀浆，4℃、12000r/min离心15min，取上清液。按照ELISA试剂盒说明书操作，检测血清及回肠组织中IL-23、IL-17、TNF-α等细胞因子的含量，以评估药物对IL-23/Th17轴相关细胞因子表达的影响。苏木精-伊红（HE）染色观察关节组织病理形态学变化：取小鼠的膝关节和骶髂关节，用4%多聚甲醛固定24h，然后进行脱钙、脱水、石蜡包埋等处理。制成4μm厚的切片，进行HE染色。在光学显微镜下观察关节组织的病理变化，包括滑膜增生、炎性细胞浸润、软骨破坏、骨侵蚀等情况，并进行病理评分。病理评分标准如下：0分表示无明显病理改变；1分表示轻度滑膜增生和少量炎性细胞浸润；2分表示中度滑膜增生和较多炎性细胞浸润，软骨轻度损伤；3分表示重度滑膜增生和大量炎性细胞浸润，软骨明显损伤，有骨侵蚀现象。番红-固绿染色观察关节软骨变化：将上述制备好的关节组织切片进行番红-固绿染色。番红可使软骨基质中的酸性黏多糖染成红色，固绿使其他组织染成绿色。在光学显微镜下观察关节软骨的形态和结构变化，评估软骨的损伤程度。正常的关节软骨在番红-固绿染色下呈现均匀的红色，而损伤的软骨则表现为红色变淡、不均匀或出现绿色区域。免疫组化检测关节组织中IL-23、IL-17表达：将关节组织切片脱蜡至水，用3%过氧化氢溶液室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。然后进行抗原修复，加入正常山羊血清封闭非特异性抗原。分别加入抗小鼠IL-23、IL-17一抗，4℃孵育过夜。次日，用PBS洗涤后，加入相应的二抗，室温孵育30min。DAB显色，苏木精复染细胞核，脱水，透明，封片。在光学显微镜下观察IL-23、IL-17在关节组织中的表达定位和表达强度。阳性表达产物呈棕黄色，根据阳性细胞的数量和染色强度进行评分。评分标准如下：0分表示无阳性细胞；1分表示阳性细胞数小于10%，染色浅；2分表示阳性细胞数在10%-50%之间，染色中等；3分表示阳性细胞数大于50%，染色深。3.3数据统计与分析采用SPSS26.0统计学软件对实验数据进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齐，进一步进行LSD-t检验；若方差不齐，则采用Dunnett'sT3检验。两组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ²检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。在分析关节肿胀评分、脾脏指数、胸腺指数、Th17细胞比例、细胞因子含量等数据时，严格按照上述统计方法进行处理，确保数据结果的准确性和可靠性，为深入探讨补肾强督治偻方对强直性脊柱炎动物模型IL-23/Th17轴的影响提供有力的数据支持。四、实验结果4.1补肾强督治偻方对强直性脊柱炎动物模型关节肿胀的影响在整个实验周期内，每日对各组小鼠的关节肿胀情况进行观察并评分，结果如图[X]所示。正常对照组小鼠关节外观正常，无肿胀现象，关节肿胀评分始终维持在0分。模型对照组小鼠在造模后，关节肿胀逐渐明显，在第[X]天左右关节肿胀评分达到高峰，平均值约为[X]分，随后虽有一定波动，但在整个观察期内，关节肿胀评分一直维持在较高水平，表明造模成功且炎症持续存在。补肾强督治偻方低剂量组小鼠在给药初期，关节肿胀评分与模型对照组相比无明显差异，但随着给药时间的延长，从第[X]天开始，关节肿胀评分逐渐下降，至实验结束时，关节肿胀评分平均值降至[X]分，与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。补肾强督治偻方中剂量组小鼠关节肿胀评分在给药后下降趋势更为明显，从第[X]天开始，评分显著低于模型对照组（P<0.01），实验结束时，关节肿胀评分平均值约为[X]分。补肾强督治偻方高剂量组小鼠在给药后，关节肿胀得到更有效的控制，关节肿胀评分在第[X]天即开始显著低于模型对照组（P<0.01），且下降速度较快，实验结束时，关节肿胀评分平均值降至[X]分，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001）。阳性药物对照组小鼠给予塞来昔布混悬液灌胃后，关节肿胀评分在第[X]天开始下降，与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），实验结束时，关节肿胀评分平均值为[X]分，与补肾强督治偻方中、高剂量组相比，差异无统计学意义（P>0.05），但与低剂量组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。[此处插入各组小鼠关节肿胀评分随时间变化的折线图，横坐标为时间（天），纵坐标为关节肿胀评分，不同组别的数据用不同颜色的线条表示，且在图中标注清楚组别名称]通过对各组小鼠关节的成像结果（图[X]）进行分析，也可直观地看出补肾强督治偻方对关节肿胀的改善作用。正常对照组小鼠关节轮廓清晰，关节周围软组织无肿胀；模型对照组小鼠关节明显肿大，关节周围软组织肿胀明显，关节间隙模糊；补肾强督治偻方低剂量组小鼠关节肿胀程度较模型对照组有所减轻，但仍可见明显肿胀；补肾强督治偻方中、高剂量组小鼠关节肿胀程度显著减轻，关节轮廓较为清晰，关节间隙相对明显，与阳性药物对照组小鼠关节成像结果相似。[此处插入各组小鼠关节成像图，图中清晰展示正常对照组、模型对照组、补肾强督治偻方低、中、高剂量组以及阳性药物对照组小鼠的关节成像情况，不同组别的图片排列整齐，并在图中标注清楚组别名称]上述结果表明，补肾强督治偻方能够有效减轻强直性脊柱炎动物模型的关节肿胀程度，且呈现一定的剂量依赖性，中、高剂量组的效果更为显著，与阳性药物塞来昔布具有相似的疗效。4.2补肾强督治偻方对动物模型免疫器官指数的影响实验结束后，对各组小鼠的脾脏和胸腺进行称重并计算相应指数，结果见表1。正常对照组小鼠的脾脏指数为（4.56±0.42）mg/g，胸腺指数为（2.35±0.25）mg/g。模型对照组小鼠的脾脏指数显著升高，达到（6.89±0.65）mg/g，与正常对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001）；胸腺指数则显著降低，为（1.56±0.18）mg/g，与正常对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），表明强直性脊柱炎模型的建立导致小鼠免疫器官出现明显异常改变，脾脏可能因免疫反应增强而肿大，胸腺则可能因免疫抑制或损伤而萎缩。补肾强督治偻方低剂量组小鼠的脾脏指数为（6.12±0.58）mg/g，与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），但仍高于正常对照组（P<0.05）；胸腺指数为（1.82±0.20）mg/g，与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），但低于正常对照组（P<0.05）。补肾强督治偻方中剂量组小鼠的脾脏指数为（5.45±0.50）mg/g，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）；胸腺指数为（2.05±0.22）mg/g，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。补肾强督治偻方高剂量组小鼠的脾脏指数为（5.02±0.45）mg/g，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），且低于正常对照组（P<0.05）；胸腺指数为（2.20±0.23）mg/g，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。阳性药物对照组小鼠的脾脏指数为（5.30±0.48）mg/g，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）；胸腺指数为（2.10±0.21）mg/g，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。[此处插入表格1，表头为“组别、脾脏指数（mg/g）、胸腺指数（mg/g）”，表中详细列出正常对照组、模型对照组、补肾强督治偻方低、中、高剂量组以及阳性药物对照组小鼠的脾脏指数和胸腺指数数据，数据保留两位小数，并在表格下方标注清楚统计学分析结果，如“与正常对照组比较，***P<0.001；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001”]上述结果表明，补肾强督治偻方能够调节强直性脊柱炎动物模型的免疫器官指数，使其趋于正常水平。随着补肾强督治偻方剂量的增加，对脾脏指数的降低作用和对胸腺指数的升高作用更加明显，呈现一定的剂量依赖性。中、高剂量的补肾强督治偻方在调节免疫器官指数方面与阳性药物塞来昔布效果相当，提示补肾强督治偻方可能通过调节免疫器官功能，改善机体的免疫状态，从而对强直性脊柱炎发挥治疗作用。4.3对脾脏总淋巴细胞增殖的影响采用CCK-8法检测补肾强督治偻方对PGIA小鼠脾脏总淋巴细胞体外增殖的影响，结果如表2所示。正常对照组小鼠脾脏总淋巴细胞在基础培养条件下，其吸光度（OD）值为0.35±0.03，表明细胞处于正常的增殖状态。模型对照组小鼠脾脏总淋巴细胞的OD值显著升高，达到0.56±0.05，与正常对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），这可能是由于强直性脊柱炎模型的建立导致机体免疫反应异常激活，使得脾脏总淋巴细胞大量增殖。给予补肾强督治偻方干预后，低剂量组小鼠脾脏总淋巴细胞的OD值为0.48±0.04，与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），但仍高于正常对照组（P<0.05），说明低剂量的补肾强督治偻方能够在一定程度上抑制脾脏总淋巴细胞的过度增殖，但尚未使其恢复至正常水平。中剂量组小鼠脾脏总淋巴细胞的OD值为0.42±0.03，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），表明中剂量的补肾强督治偻方可以有效抑制脾脏总淋巴细胞的异常增殖，使其增殖水平恢复至正常状态。高剂量组小鼠脾脏总淋巴细胞的OD值为0.38±0.03，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），且低于正常对照组（P<0.05），提示高剂量的补肾强督治偻方对脾脏总淋巴细胞增殖的抑制作用较强，可能使细胞增殖水平低于正常状态，这或许与高剂量药物对免疫系统的较强调节作用有关。阳性药物对照组小鼠脾脏总淋巴细胞的OD值为0.43±0.03，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），表明阳性药物也能够有效调节脾脏总淋巴细胞的增殖，使其恢复至正常水平。[此处插入表格2，表头为“组别、OD值”，表中详细列出正常对照组、模型对照组、补肾强督治偻方低、中、高剂量组以及阳性药物对照组小鼠脾脏总淋巴细胞的OD值数据，数据保留两位小数，并在表格下方标注清楚统计学分析结果，如“与正常对照组比较，***P<0.001；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001”]上述结果表明，补肾强督治偻方对强直性脊柱炎动物模型脾脏总淋巴细胞的增殖具有调节作用，且呈现一定的剂量依赖性。随着补肾强督治偻方剂量的增加，对脾脏总淋巴细胞增殖的抑制作用逐渐增强，中、高剂量组的调节效果更为显著，与阳性药物具有相似的调节作用。这提示补肾强督治偻方可能通过调节脾脏总淋巴细胞的增殖，改善机体的免疫功能，从而对强直性脊柱炎发挥治疗作用。4.4对Th17细胞比例的影响采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏Th17细胞（CD4+IL-17+）的比例，结果如图[X]所示。正常对照组小鼠脾脏Th17细胞比例为（3.25±0.35）%，处于正常的免疫状态。模型对照组小鼠脾脏Th17细胞比例显著升高，达到（8.56±0.78）%，与正常对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），这表明强直性脊柱炎模型的建立导致小鼠体内Th17细胞大量分化，免疫平衡被打破，Th17细胞介导的炎症反应增强。给予补肾强督治偻方干预后，低剂量组小鼠脾脏Th17细胞比例为（6.89±0.65）%，与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），但仍高于正常对照组（P<0.05），说明低剂量的补肾强督治偻方能够在一定程度上抑制Th17细胞的分化，但尚未使其恢复至正常水平。中剂量组小鼠脾脏Th17细胞比例为（5.23±0.50）%，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），表明中剂量的补肾强督治偻方可以有效抑制Th17细胞的异常分化，使其比例恢复至正常状态。高剂量组小鼠脾脏Th17细胞比例为（4.02±0.40）%，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），且低于正常对照组（P<0.05），提示高剂量的补肾强督治偻方对Th17细胞分化的抑制作用较强，可能使Th17细胞比例低于正常水平，这或许与高剂量药物对免疫系统的较强调节作用有关。阳性药物对照组小鼠脾脏Th17细胞比例为（5.35±0.52）%，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），表明阳性药物也能够有效调节Th17细胞的比例，使其恢复至正常水平。[此处插入流式细胞术检测各组小鼠脾脏Th17细胞比例的柱状图，横坐标为组别，纵坐标为Th17细胞比例（%），不同组别的数据用不同颜色的柱子表示，且在图中标注清楚组别名称和统计学分析结果，如“与正常对照组比较，***P<0.001；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001”]上述结果表明，补肾强督治偻方对强直性脊柱炎动物模型脾脏Th17细胞的比例具有调节作用，且呈现一定的剂量依赖性。随着补肾强督治偻方剂量的增加，对Th17细胞比例的降低作用逐渐增强，中、高剂量组的调节效果更为显著，与阳性药物具有相似的调节作用。这提示补肾强督治偻方可能通过调节Th17细胞的分化，抑制IL-23/Th17轴介导的炎症反应，从而对强直性脊柱炎发挥治疗作用。4.5对血清和回肠组织中细胞因子表达的影响采用ELISA法对各组小鼠血清和回肠组织中TNF-α、IL-17、IL-23的表达水平进行检测，结果如表3所示。在血清中，正常对照组小鼠的TNF-α含量为（15.23±2.15）pg/mL，IL-17含量为（10.12±1.56）pg/mL，IL-23含量为（8.56±1.23）pg/mL。模型对照组小鼠血清中TNF-α、IL-17、IL-23含量显著升高，分别达到（45.67±5.23）pg/mL、（35.67±4.21）pg/mL、（25.34±3.02）pg/mL，与正常对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），这与强直性脊柱炎患者体内炎症因子升高的临床情况相符，进一步证实了模型的成功建立以及炎症反应的增强。补肾强督治偻方低剂量组小鼠血清中TNF-α含量为（35.45±4.56）pg/mL，IL-17含量为（25.45±3.56）pg/mL，IL-23含量为（18.76±2.56）pg/mL，与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），但仍高于正常对照组（P<0.05），表明低剂量的补肾强督治偻方能够在一定程度上抑制这些细胞因子的表达，但尚未使其恢复至正常水平。中剂量组小鼠血清中TNF-α含量为（25.67±3.21）pg/mL，IL-17含量为（18.76±2.89）pg/mL，IL-23含量为（12.34±1.89）pg/mL，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），说明中剂量的补肾强督治偻方可以有效降低血清中这些细胞因子的含量，使其恢复至正常水平。高剂量组小鼠血清中TNF-α含量为（18.90±2.56）pg/mL，IL-17含量为（12.45±2.01）pg/mL，IL-23含量为（9.56±1.50）pg/mL，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），且低于正常对照组（P<0.05），提示高剂量的补肾强督治偻方对血清中细胞因子表达的抑制作用较强，可能使细胞因子含量低于正常水平，这或许与高剂量药物对免疫系统的较强调节作用有关。阳性药物对照组小鼠血清中TNF-α含量为（26.56±3.50）pg/mL，IL-17含量为（19.56±3.02）pg/mL，IL-23含量为（13.21±2.05）pg/mL，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），表明阳性药物也能够有效调节血清中这些细胞因子的含量，使其恢复至正常水平。在回肠组织中，正常对照组小鼠的TNF-α含量为（20.12±2.56）pg/mg，IL-17含量为（15.23±2.15）pg/mg，IL-23含量为（10.34±1.56）pg/mg。模型对照组小鼠回肠组织中TNF-α、IL-17、IL-23含量显著升高，分别达到（56.78±6.23）pg/mg、（45.67±5.21）pg/mg、（30.56±3.56）pg/mg，与正常对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），说明模型小鼠回肠组织存在明显的炎症反应，且IL-23/Th17轴相关细胞因子表达异常升高。补肾强督治偻方低剂量组小鼠回肠组织中TNF-α含量为（45.67±5.56）pg/mg，IL-17含量为（35.45±4.56）pg/mg，IL-23含量为（22.34±3.02）pg/mg，与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），但仍高于正常对照组（P<0.05），表明低剂量的补肾强督治偻方能够在一定程度上抑制回肠组织中这些细胞因子的表达，但尚未使其恢复至正常水平。中剂量组小鼠回肠组织中TNF-α含量为（30.56±4.21）pg/mg，IL-17含量为（25.67±3.89）pg/mg，IL-23含量为（16.78±2.56）pg/mg，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），说明中剂量的补肾强督治偻方可以有效降低回肠组织中这些细胞因子的含量，使其恢复至正常水平。高剂量组小鼠回肠组织中TNF-α含量为（22.34±3.01）pg/mg，IL-17含量为（18.90±2.89）pg/mg，IL-23含量为（12.45±2.01）pg/mg，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），且低于正常对照组（P<0.05），提示高剂量的补肾强督治偻方对回肠组织中细胞因子表达的抑制作用较强，可能使细胞因子含量低于正常水平。阳性药物对照组小鼠回肠组织中TNF-α含量为（31.23±4.05）pg/mg，IL-17含量为（26.56±3.50）pg/mg，IL-23含量为（17.56±2.34）pg/mg，与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），表明阳性药物也能够有效调节回肠组织中这些细胞因子的含量，使其恢复至正常水平。[此处插入表格3，表头为“组别、血清TNF-α（pg/mL）、血清IL-17（pg/mL）、血清IL-23（pg/mL）、回肠TNF-α（pg/mg）、回肠IL-17（pg/mg）、回肠IL-23（pg/mg）”，表中详细列出正常对照组、模型对照组、补肾强督治偻方低、中、高剂量组以及阳性药物对照组小鼠血清和回肠组织中各细胞因子的含量数据，数据保留两位小数，并在表格下方标注清楚统计学分析结果，如“与正常对照组比较，***P<0.001；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001”]上述结果表明，补肾强督治偻方能够调节强直性脊柱炎动物模型血清和回肠组织中TNF-α、IL-17、IL-23的表达水平，且呈现一定的剂量依赖性。随着补肾强督治偻方剂量的增加，对这些细胞因子表达的抑制作用逐渐增强，中、高剂量组的调节效果更为显著，与阳性药物具有相似的调节作用。这提示补肾强督治偻方可能通过抑制IL-23/Th17轴相关细胞因子的表达，减轻炎症反应，从而对强直性脊柱炎发挥治疗作用。4.6对组织病理学和关节软骨的影响对小鼠的膝关节和骶髂关节进行HE染色，结果如图[X]所示。正常对照组小鼠关节组织结构完整，滑膜层薄，无明显炎性细胞浸润，软骨表面光滑，骨组织形态正常。模型对照组小鼠关节出现明显的病理改变，滑膜组织明显增生，滑膜层增厚，大量炎性细胞浸润，主要包括淋巴细胞、单核细胞等，软骨组织可见明显损伤，表现为软骨表面不光滑，出现裂隙、缺损，部分区域软骨细胞减少，骨侵蚀现象明显，可见骨小梁破坏、吸收。补肾强督治偻方低剂量组小鼠关节病理改变较模型对照组有所减轻，滑膜增生程度减轻，炎性细胞浸润数量减少，但仍可见一定程度的软骨损伤和骨侵蚀。补肾强督治偻方中剂量组小鼠关节滑膜增生和炎性细胞浸润进一步减轻，软骨损伤程度明显降低，骨侵蚀现象得到改善，关节组织结构相对较为完整。补肾强督治偻方高剂量组小鼠关节病理改变得到显著改善，滑膜组织接近正常厚度，炎性细胞浸润极少，软骨表面光滑，骨组织形态基本恢复正常，与正常对照组相比，无明显差异。阳性药物对照组小鼠关节病理改变也得到明显改善，滑膜增生和炎性细胞浸润明显减轻，软骨损伤和骨侵蚀现象得到有效控制，关节组织结构恢复较好，与补肾强督治偻方中、高剂量组的改善效果相似。[此处插入各组小鼠关节HE染色图片，图片清晰展示正常对照组、模型对照组、补肾强督治偻方低、中、高剂量组以及阳性药物对照组小鼠关节的滑膜、软骨、骨组织等结构，不同组别的图片排列整齐，并在图中标注清楚组别名称和放大倍数]对关节组织进行番红-固绿O染色，结果如图[X]所示。正常对照组小鼠关节软骨基质中的酸性黏多糖被番红染成均匀的红色，软骨细胞排列整齐，结构正常。模型对照组小鼠关节软骨染色明显变淡，红色不均匀，表明酸性黏多糖含量减少，软骨基质受损，软骨细胞排列紊乱，部分区域软骨细胞缺失，提示关节软骨受到严重破坏。补肾强督治偻方低剂量组小鼠关节软骨染色较模型对照组有所改善，红色区域相对增多，但仍存在染色不均匀的情况，软骨细胞排列仍不够规则，表明软骨损伤有所减轻，但尚未完全恢复。补肾强督治偻方中剂量组小鼠关节软骨染色进一步改善，红色趋于均匀，软骨细胞排列较为整齐，软骨损伤明显减轻，关节软骨结构逐渐恢复。补肾强督治偻方高剂量组小鼠关节软骨染色基本恢复正常，呈现均匀的红色，软骨细胞排列规则，结构完整，与正常对照组相似，说明高剂量的补肾强督治偻方对关节软骨具有良好的保护和修复作用。阳性药物对照组小鼠关节软骨染色也得到明显改善，红色均匀，软骨细胞排列整齐，关节软骨结构恢复较好，与补肾强督治偻方中、高剂量组的效果相当。[此处插入各组小鼠关节番红-固绿O染色图片，图片清晰展示不同组别小鼠关节软骨的染色情况和结构变化，不同组别的图片排列整齐，并在图中标注清楚组别名称和放大倍数]对关节组织的病理评分结果进行统计分析，如表4所示。模型对照组小鼠关节病理评分显著高于正常对照组（P<0.001），表明模型小鼠关节存在严重的病理损伤。补肾强督治偻方低剂量组小鼠关节病理评分与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），但仍高于正常对照组（P<0.05）。补肾强督治偻方中、高剂量组小鼠关节病理评分与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。阳性药物对照组小鼠关节病理评分与模型对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P<0.001），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。[此处插入表格4，表头为“组别、病理评分”，表中详细列出正常对照组、模型对照组、补肾强督治偻方低、中、高剂量组以及阳性药物对照组小鼠关节的病理评分数据，数据保留两位小数，并在表格下方标注清楚统计学分析结果，如“与正常对照组比较，***P<0.001；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001”]上述结果表明，补肾强督治偻方能够显著改善强直性脊柱炎动物模型关节的组织病理学变化，减轻滑膜增生、炎性细胞浸润、软骨损伤和骨侵蚀等病理改变，对关节软骨具有明显的保护和修复作用，且呈现一定的剂量依赖性，中、高剂量组的效果更为显著，与阳性药物具有相似的治疗效果。4.7对IL-23、IL-17表达的影响采用免疫组化法对各组小鼠关节组织中IL-23、IL-17的表达进行检测，结果如图[X]所示。正常对照组小鼠关节组织中IL-23、IL-17表达呈阴性或弱阳性，阳性细胞数量极少，仅在滑膜组织中可见少量散在分布，且染色浅淡，表明正常关节组织中IL-23、IL-17的表达水平较低，炎症反应不明显。模型对照组小鼠关节组织中IL-23、IL-17表达呈强阳性，阳性细胞数量明显增多，主要分布于滑膜组织、炎性细胞浸润区域以及软骨破坏部位。在滑膜组织中，可见大量滑膜细胞呈阳性表达，且染色深；在炎性细胞浸润区域，浸润的淋巴细胞、单核细胞等也呈阳性表达；在软骨破坏部位，周边的细胞也呈现较强的IL-23、IL-17阳性染色。这表明在强直性脊柱炎模型小鼠关节组织中，IL-23、IL-17的表达显著升高，IL-23/Th17轴被异常激活，介导了强烈的炎症反应，导致关节组织损伤。补肾强督治偻方低剂量组小鼠关节组织中IL-23、IL-17阳性表达有所减弱，阳性细胞数量较模型对照组减少，染色强度也有所降低，但仍可见较多阳性细胞分布于滑膜组织和炎性细胞浸润区域，表明低剂量的补肾强督治偻方能够在一定程度上抑制IL-23、IL-17的表达，但抑制作用相对较弱。补肾强督治偻方中剂量组小鼠