表达犬γ干扰素重组乳酸球菌的构建及体外抗病毒活性检测

表达犬γ干扰素重组乳酸球菌的构建及体外抗病毒活性检测一、引言犬γ干扰素（Canineinterferon-γ，CaIFN-γ）在犬的免疫调节和抗病毒防御中发挥着核心作用。传统的蛋白表达系统存在成本高、工艺复杂等弊端。乳酸球菌作为一种安全、易于培养且具有良好免疫原性的宿主菌，为CaIFN-γ的表达提供了新途径。构建能够高效表达CaIFN-γ的重组乳酸球菌，并检测其体外抗病毒活性，对于开发新型、高效的犬用抗病毒制剂具有重要意义。二、材料与方法（一）材料菌株与质粒：乳酸球菌NZ9000、含有CaIFN-γ基因的质粒pMD18-T-CaIFN-γ、表达载体pNZ8148。工具酶与试剂：限制性内切酶NcoI、XhoI，T4DNA连接酶，DNAMarker，蛋白Marker，IPTG，MRS培养基，细胞培养基（DMEM），胎牛血清，犬肾细胞系（MDCK），犬瘟热病毒（CDV）等。仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、恒温摇床、离心机、CO₂培养箱、酶标仪等。（二）方法CaIFN-γ基因的扩增以pMD18-T-CaIFN-γ为模板，设计特异性引物，引物两端分别引入NcoI和XhoI酶切位点。通过PCR扩增CaIFN-γ基因，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收。重组表达载体的构建将回收的CaIFN-γ基因片段和pNZ8148载体分别用NcoI和XhoI进行双酶切。酶切产物经凝胶回收后，用T4DNA连接酶进行连接反应，16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含氯霉素的LB平板上，37℃培养12-16h。挑取单菌落进行PCR鉴定和双酶切鉴定，阳性克隆送测序。重组乳酸球菌的构建将测序正确的重组质粒pNZ8148-CaIFN-γ通过电转化法导入乳酸球菌NZ9000感受态细胞。电转化条件为：电压2.5kV，电阻400Ω，电容25μF。转化后的细胞涂布于含氯霉素的MRS平板上，30℃培养48h。挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性重组乳酸球菌。重组乳酸球菌中CaIFN-γ的表达将阳性重组乳酸球菌接种于含氯霉素的MRS培养基中，30℃振荡培养至OD600为0.5-0.6。加入终浓度为10ng/mL的nisin进行诱导表达，继续培养6-8h。离心收集菌体，超声破碎后，取上清进行SDS-PAGE分析，检测CaIFN-γ的表达情况。重组CaIFN-γ体外抗病毒活性检测MDCK细胞培养：将MDCK细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5%CO₂培养箱中培养至对数生长期。病毒感染：将培养好的MDCK细胞分为实验组、对照组和病毒对照组。实验组加入重组乳酸球菌表达的CaIFN-γ上清液预处理1h，然后接种CDV；对照组只接种CDV；病毒对照组不做任何处理。细胞病变观察：接种病毒后，每天在显微镜下观察细胞病变情况（CPE）。MTT法检测细胞活力：接种病毒48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4h。弃上清，加入150μLDMSO，振荡10min，用酶标仪在570nm波长处检测吸光度（OD值），计算细胞存活率。根据细胞存活率计算重组CaIFN-γ对CDV的抑制率。抑制率（%）=（1-实验组OD值/病毒对照组OD值）×100%。三、结果（一）CaIFN-γ基因的扩增PCR扩增得到约500bp的特异性条带，与预期的CaIFN-γ基因大小一致，经测序分析，基因序列正确。（二）重组表达载体的鉴定PCR鉴定和双酶切鉴定结果显示，重组质粒pNZ8148-CaIFN-γ构建成功，测序结果与预期序列完全一致。（三）重组乳酸球菌的鉴定PCR鉴定结果表明，CaIFN-γ基因已成功导入乳酸球菌NZ9000中，获得阳性重组乳酸球菌。（四）重组CaIFN-γ的表达SDS-PAGE分析结果显示，在相对分子质量约20kDa处出现特异性条带，与预期的CaIFN-γ蛋白大小相符，表明重组乳酸球菌能够成功表达CaIFN-γ。（五）重组CaIFN-γ体外抗病毒活性显微镜下观察发现，病毒对照组细胞出现明显的病变，细胞变圆、脱落；对照组细胞病变程度相似；而实验组细胞病变程度明显减轻。MTT法检测结果显示，实验组细胞存活率显著高于病毒对照组和对照组，重组CaIFN-γ对CDV的抑制率可达60%以上。四、讨论本研究成功构建了表达犬γ干扰素的重组乳酸球菌，并验证了其体外抗病毒活性。乳酸球菌作为表达宿主，具有安全性高、易于大规模培养等优势，为犬γ干扰素的生产提供了一种经济、可行的方法。重组CaIFN-γ在体外能够有效抑制犬瘟热病毒的感染，为进一步开发犬用抗病毒生物制剂奠定了基础。然而，目前重组CaIFN-γ的表达量还有提升空间，后续可通过优化诱导条件、调整基因密码子等方式提高表达水平。同时，对于重组CaIFN