DB53T 1190-2023 制烟原料鉴别技术规程 DNA分子标记法

2023-10-10实施2023-10-10实施I前言 引言 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 2 2 2 27.1烟叶及片烟 27.2烟梗、再造烟叶、烟末和烟丝 3 38.1基因组DNA提取 38.2PCR扩增 38.3样品对照 48.4非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 4 59鉴别结果判定 510质量控制 511鉴别报告 5 6附录B(规范性)DNA提取试剂配制 7附录C(规范性)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂配制 8 9附录E(资料性)烟草属特异性DNA分子标记引物 附录F(资料性)制烟原料鉴别结果报告 V1仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。用于生产烟草制品的烟叶(含复烤烟叶)、烟梗、烟末、再造烟叶和烟丝(含毛烟丝、梗丝)。成件制烟原料packagedrawmaterialforcigarette-ma外形尺寸、形状、包装形式等相对一致的制烟原料。2dNTPsMix:脱氧核糖核苷酸三磷酸混合液(deoxy-ribonucleosidetriphosphatemix)5仪器5.1PCR扩增仪(控温精度±0.4℃)。5.2电泳系统(50V~600V,10m400mK)5.4分析天平(感量0.0001g)5.5磁力搅拌器(转速0r/min<2000r/min)5.7恒温水浴锅(精度±0.1℃5.8冰箱(-80℃,-20℃,4℃X5.10超纯水器(电阻率18.2MOcm。5.11水平摇床(转速30rpm～250rpm)6试剂6.1常用溶液：按附录A配制。6.2DNA提取试剂：按附录B配制。3待检样品在100件以内按10%～20%取样；超出100件的部分按5%～10%取样，8.2.2.2将合成的引物用1×TE缓冲液(A.4)配置成100μmol/μL的保存液，于-20℃冰箱中保存备用。使用时取部分保存液，用1×TE缓冲液配置成10μmo1/μL使用液，保存液放回-20℃冰箱中保4灭菌双蒸水(ddH₂O)PCR缓冲液(10mMTris-Cl,pH8.4,50mMKCl,1.5mMMgCl₂)正向引物(10mmol/L)反向引物(10mmol/L)TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)DNA模板(50ng/μL)采用下列循环程序进行扩增：a)预变性：95℃5min;b)循环设定：1)变性94℃30s;3)延伸72℃45s;d)后延伸：72℃5min;e)终止反应：4℃。8.4.1凝胶板装配取8%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液(C.2)75mL,摇匀后沿玻璃板边缘轻缓地将凝胶液注入玻璃板缝58.5银染的塑料方盒中，在水平摇床上轻摇动10min～20min,倒掉固定液，用ddH₂O冲洗凝胶2～3次，每次1min,取出凝胶，滤去水分，将凝胶转入硝酸银染色8.5.4拍照记录6 A.1.1乙二胺四乙酸钠。A.2.1准确称量186.1g乙二胺四乙酸钠(A.1.1)溶于800mL超纯水中。A.2.4121℃灭菌15min,49箱电保存，每3个月重新配制A.3Tris-HCI缓冲液(1000mL,pH8.0)A.3.1准确称量121gTris碱立浴于900m超年水中。A.4TE缓冲液(100mL,10mmol/L,pH8.0)A.5.2加2mL0.5mol/L7B.1试剂(规范性)B.2.3加入4mL0.5mol/LEDTAB1.5)(pH80。B.2.4超纯水定容至100mL,4℃冰箱中保存。B.4CTAB沉淀缓冲液(100mL)去B.4.1称取1gCTAB(B.1.1)加入80mL超纯水，磁力搅拌使其溶解。B.5三氯甲烷/异戊醇(24:1,体积分数)8(规范性)C.1试剂C.1.2甲叉双丙烯酰胺。C.1.4蔗糖(400型)。C.2.1称取290g丙烯酰胺(C.1.1)、10g甲叉双丙烯酰胺(C.1.2)加入700mL超纯水，磁力搅拌使其溶C.4溴酚蓝上样缓冲液C.4.1称取蔗糖(400型)(C.1.4)150mg。C.4.2加入1%溴酚蓝(C.1.5)150μL,1%二甲苯青FF(C.1.6)150μL。C.5.3稀释5倍为1×TBE,稀释10倍为0.5×TB。C.62%琼脂9 (规范性)D.1试剂D.4显色液(资料性)表E.1烟草属特异性DNA分子标记引物信息引物名称引物序列(5’→3')退火温度扩增片段长度染色体75caffold位置标记位点/基因R:AACCAAAGCAAGCGAAA或Ntab_scaffold_2697:39912b-40214bpNitab4.50005932:59193bp~59495bp或Nitab4.5_0005266:78237bp~78539bpF:ATTTGGCTTTGGCTATG红以cm2:563777823bp~6377Nitab4.5_0015055:6266bp~6565