生血宝合剂改善失眠的作用及机制研究

生血宝合剂改善失眠的作用及机制研究摘要目的：探讨生血宝合剂对失眠大鼠的改善作用及机制。方法：为建立失眠动物模型，本研究采用腹腔注射对氯苯丙氨酸的给药方式对大鼠进行处理，并通过ELISA法测定大鼠血清中5羟色胺（5-HT）的水平判断造模是否成功。本研究采用Morris水迷宫测试评估大鼠空间学习记忆能力，结合戊巴比妥钠诱导的协同睡眠实验分析大鼠睡眠相关指标，同时运用苏木精-伊红（HE）染色技术，对各组大鼠下丘脑与海马组织进行病理学观察，以探究相关组织在不同处理条件下的病理改变情况；检测大鼠血清样本中炎症因子的水平，包括白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、脑源性神经营养因子（BDNF）、γ氨基丁酸（GABA）和5羟色胺（5-HT）；实时荧光PCR和蛋白质免疫印记法分别检测大鼠下丘脑和海马组织中的脑源性神经营养因子（BDNF）、γ氨基丁酸（GABA）、5羟色胺（5-HT）mRNA的表达水平。结果：实验数据显示，相较于空白对照组，模型组实验大鼠表现出明显的神经递质水平异常，具体表现为血清5-羟色胺、γ-氨基丁酸以及脑源性神经营养因子浓度均显著下降，同时其睡眠行为学参数发生显著改变，包括睡眠总时长明显减少及入睡潜伏期显著延长；在Morris水迷宫实验中发现，模型组大鼠穿越平台的次数较其他各组减少，逃逸潜伏期较长；在检测大鼠血清中白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量时，我们发现模型组的炎症因子水平相较于空白组显著升高；与模型组相比，生血宝合剂与地西泮在改善失眠模型大鼠的睡眠障碍方面均表现出显著疗效，具体表现为：有效缓解实验动物的整体状态异常，显著降低由失眠引发的记忆功能损害，同时能够缩短睡眠潜伏期并延长睡眠持续时间，提高失眠大鼠血清中神经递质5-HT、GABA和BDNF的水平，该干预措施能够显著抑制血清炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平，同时有效上调失眠模型大鼠脑组织内5-HT1AR、GABAARα1及BDNF基因的mRNA转录与蛋白合成。结论：生血宝合剂对失眠大鼠具有一定的改善作用，其作用机制可能与降低炎症因子水平、改善脑组织神经细胞凋亡以及上调神经递质5-HT1AR、GABAARα1和BDNF的基因及蛋白的表达量相关。关键词：失眠；生血宝合剂；作用机制；神经递质；炎症因子正文1.引言失眠症（insomnia）是一种以入睡困难或难以保持睡眠为特征的常见睡眠障碍，主要表现为个体主观感知的睡眠时长不足或质量不达标[1]。其导致原因多种：疾病刺激、心理因素、环境因素等影响，这些因素均可能会出现失眠症状，表现为睡眠时间短、睡眠浅、入睡困难等症状[2]。随着当代社会生活方式变革所导致的工作压力加剧及多重环境因素共同作用，睡眠障碍特别是失眠症的患病率在近年间持续攀升。流行病学调查揭示，根据2021年的流行病学调查数据，我国约有3亿人口存在不同程度的睡眠障碍问题，其中成年人群的失眠患病率高达38%，这一现象凸显了睡眠健康问题的严峻性，而64%的人报告睡眠质量欠佳。老年人的失眠症患病率更是高达30%-60%，这严重地影响了现代人的生活质量[3]。在当下临床治疗失眠症的用药方案中，苯二氮䓬类药物与非苯二氮䓬类药物占据着主流地位，是临床治疗时常用的药物类别[4]。上述药物副作用较大，长期服用该药物不仅可能导致生理依赖性和药物耐受性的形成，还可能引发一系列不良反应。因此不适合长期服用，需要寻找开发安全有效的治疗药物至关重要[5]。生血宝合剂（Shenxuebaomixture）是2020版中国药典收载的补益类中成药大品种，由制何首乌、女贞子、桑葚、墨旱莲、白芍、黄芪、狗脊制成的中成药，具有滋养肝肾、益气生血的作用，主要用于气血亏虚证，临床应用发现其在升高白细胞、增进造血方面疗效显著，且安全性较好[6]。通过查阅文献发现，传统中医学将失眠归于“阴阳不平衡”[7]，现代药理学研究提出采用苯二氮䓬类和非苯二氮䓬类通过增强GABA的抑制作用改善睡眠。目前生血宝合剂作为临床滋养类中成药，其相关研究仅局限于滋养肝肾、益气生血方面。本研究创新性地提出生血宝合剂是否对失眠由治疗作用，构建了PCPA诱导的失眠大鼠模型[8]，开展对生血宝合剂在改善失眠症状方面的作用效果以及潜在作用机制的研究工作，旨在为该药物在临床治疗失眠领域的应用提供坚实的理论支撑。。2.材料2.1实验药物实验药物见表1。表1实验药物药物名称生产公司批号生血宝合剂清华德人西安幸福制药有限公司JX2411674-氯-DL-苯基丙氨酸（PCPA）上海源叶生物科技有限公司JS254515地西泮片山东信谊制药有限公司202401052.2实验动物本实验采用体重为g的SPF级雄性SD大鼠作为研究对象，实验动物由具备SCXK(川)2020-0030合格证资质的成都达硕实验动物中心提供，同时实验过程中所使用的专用饲料亦采购自成都达硕实验动物有限公司。饲养期间，大鼠可自由摄食与饮水，饲养环境温度控制于（21±3）℃，相对湿度维持在50%±5%，照明时长设定为12h。动物实验室许可编号为SYXK(陕)2022-008。在本方案所涉及的各项动物实验操作环节，均已顺利获得陕西中医药大学实验动物委员会的审批许可（伦理批准号：SUCMDL20250103001），并严格遵循《实验动物管理和使用指南》的相关规定。2.3实验试剂实验试剂见表2。表2实验试剂试剂名称生产公司货号5羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）Elisa检测试剂盒酶免生物科技有限公司MM-0442R1γ氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）Elisa检测试剂盒酶免生物科技有限公司MM-0441R1脑源行神经营养因子（brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）Elisa检测试剂盒酶免生物科技有限公司MM-0209R1肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα，TNF-α）Elisa检测试剂盒酶免生物科技有限公司MM-010R1续表2白细胞介素6（interleukin6，IL-6）Elisa检测试剂盒酶免生物科技有限公司MM-0190R14%组织固定液陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司BB1116一抗5-HT1AR江苏亲科生物研究中心有限公司AF5453一抗GABAARα1南京安研生物科技有限公司NY-200573M一抗BDNF武汉三鹰生物技术有限公司28205-1-AP兔二抗武汉三鹰生物技术有限公司200002582.4实验仪器实验仪器见表3。表3实验仪器仪器名称生产公司ME204/02型电子天平梅特勒托利多有限公司Micro17R型微量冷冻离心机美国赛默飞世尔科技公司Forma900Series-80℃型超低温冰箱美国赛默飞世尔科技公司NanoDropOne超微量紫外可见分光光度计美国赛默飞世尔科技公司SynergyH1全功能酶标仪美国伯腾仪器有限公司GelDocXR型伯乐凝胶成像仪器伯乐生命医学产品有限公司QTower2.2型荧光定量PCR仪德国耶拿分析仪器股份公司3.方法3.1实验动物分组选择健康成年雄性SD大鼠60只（体重200±20g），采用随机数字表法将其分为6组（n=10/组），包括：空白对照组、疾病模型组、地西泮阳性对照组、生血宝低剂量组、生血宝中剂量组及生血宝高剂量组。3.2失眠大鼠的给药及造模生血宝合剂临床使用剂量：15mL*3（次/天）/70kg（人平均体重）=0.64mL/kg。换算为大鼠用药剂量：0.64mL/kg*6.25=4mL/kg。因此在本实验中，选择2mL/kg、4mL/kg和8mL/kg作为低、中、高剂量。取地西泮4.5片（2.5mg/片），加纯水31.25mL配成混悬液0.36mg/mL，用于地西泮阳性药组的灌胃给药。PCPA注射液配置：称取4.0gPCPA粉末加入1mL吐温80，后加入生理盐水至50mL，涡旋加热。为建立失眠动物模型，在完成为期7天的适应性饲养后，除空白对照组外，其余实验组大鼠均接受连续3天的腹腔注射PCPA处理。之后，大鼠眼眶采血，用ELISA试剂盒测定5-HT的水平确定造模是否成功。造模成功后连续给药7天，各组按对应试剂或药物灌胃处理。在末次给药完成24小时之际，实验人员对各组大鼠实施舒泰50麻醉处理，随后通过腹主动脉采血，并采用3000转/分钟的高速离心机进行10分钟离心以分离血清；同时从各组随机选取4只大鼠，分别采集其脑组织、下丘脑及海马组织样本，立即置于4%多聚甲醛溶液中进行固定处理，剩余组织于-80°C冰箱保存。3.3Morris水迷宫实验在给药的第三天，对实验用大鼠实施适应性训练。将实验站台安置于第2象限，确保站台高于水面2厘米。分别自两个象限的入水点，使大鼠保持面壁姿态放入水中，每次入水时间设定为60秒，目的是让大鼠适应水迷宫的实验环境。定位航行实验：于给药的第四天，把专为大鼠设计的站台设置在第2象限，向实验水池内注入清水，站台高度控制为低于水面约2厘米，水温恒定维持在25℃。通过抓取大鼠尾巴，调整其头部朝向池壁，然后分别从第2、第3象限将大鼠放入水池，每次在水中的时长为60秒。若大鼠在60秒的规定时间内未能寻找到站台，实验人员则引导其站上平台，并将此次潜伏期记录为60秒。以两次潜伏期成绩的平均值作为当天该大鼠的最终实验成绩。每次实验结束后，使用毛巾将大鼠体表水分擦干，随后将其放回饲养笼中，此实验流程连续执行3天。空间探索实验：在给药的第七天，为开展行为学数据分析，本研究采用标准水迷宫测试程序，首先将实验平台从水池中移出，随后以统一朝向将各组实验大鼠置于池壁固定位置。在60秒的观察期内，系统记录啮齿类动物的游泳路径轨迹，并精确统计其穿越原平台所在象限的次数，所有行为学数据均通过专业软件进行采集与处理。3.4戊巴比妥钠翻正实验给药第7天，灌胃结束30分钟后，对各组大鼠腹腔注射阈上剂量的戊巴比妥钠（35mg/kg）来诱导睡眠。详细记录各组大鼠的睡眠潜伏时间与睡眠持续时间，将翻正反射消失（持续超过1分钟判定为进入睡眠状态）作为入睡的判断标准，以翻正反射重新出现作为睡眠结束的标志。3.5大鼠血清TNF-α、IL-6、5-HT、GABA和BDNF含量测定取大鼠上层血清，按照ELISA试剂盒的实验方法，对相关炎症因子：TNF-α、IL-6、5-HT、GABA和BDNF的水平进行检测，使用多功能酶标仪测定其在450nm处的吸光度，进行定量分析。3.6大鼠脑组织切片染色观察采用苏木精-伊红（HE）染色观察各组大鼠下丘脑组织和海马组织病理水平的变化。采用原位末端标记法（TUNEL）观察大鼠下丘脑组织和海马组织神经元凋亡情况。3.7RT-qPCR分析大鼠脑组织中mRNA表达水平分别获取各组大鼠的下丘脑组织与海马组织，用生理盐水仔细清洗以去除残留血液，采用滤纸吸除组织表面残余水分后，于相同解剖部位精确称取25mg组织样本，通过Trizol试剂法进行滑膜组织总RNA的提取。随后采用NanoDropOne超微量分光光度计对提取的总RNA实施浓度与纯度检测，继而完成逆转录反应合成cDNA并进行聚合酶链式扩增。实验以GAPDH为内参基因，基于2−△△CT相对定量法对5-HT1AR、GABA及GABAARα1等靶基因的mRNA表达水平进行系统分析。引物序列见表4。表4引物序列引物名称上游下游BDNFGCCCATGAAAGAAGTAAACGTCCAGTGTCAGCCAGTGATGTCGTC5-HT1ARACTCCACTTTCGGCGCTTTCGGCTGACCATTCAGGCTCTTCGABAARα1CCAAGTCTCCTTCTGGCTCAACCTTTTCTGGAACCACGCTTTTG3.8蛋白质免疫印迹法（Western-Blot）检测大鼠脑组织蛋白质表达水平将大鼠下丘脑组织用PBS清洗，置于2mL离心管中，加小钢珠2颗，分别加RIPA裂解液400μL、蛋白酶抑制剂8μL和磷酸酶抑制剂8μL，使用碾磨机将组织充分碾磨进行蛋白质裂解，所有操作均在冰上进行，12000r/min冷冻离心15min（离心半径为6cm），在收集上清液后，取适量的蛋白质样本，利用BCA蛋白定量检测试剂盒进行精确的定量分析。定量分析完成后，进行样品的上样操作，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术对样品进行分离，然后将分离后的样品转移至PVDF膜上。接着，仔细清洗膜，使用5%脱脂奶粉在室温下封闭2小时，之后依次孵育相应的第一抗体。：5-HT1AR（1：1000）、GABAARα1（1：500）、BDNF（1：4000）、β-actin（1：5000），4°C过夜。洗膜后，兔二抗（1：5000）室温孵育1h，再次洗膜，使用ECL进行显影，凝胶成像仪分析蛋白质的表达情况。3.9统计学分析本研究采用SPSS19.0统计软件进行数据分析处理，所有计量资料均以均数±标准差形式表示。对于两组数据的差异性比较，本研究选用独立样本t检验方法；针对多组数据间的差异分析，则采用单因素方差分析进行统计学检验。根据统计学标准，当检验结果P值小于0.05时，可判定组间差异具有统计学显著性。4.结果4.1失眠大鼠造模成功结果本研究实验流程如图1所示。连续造模3天后，对80只造模大鼠眼眶采血，用试剂盒测定5-HT的水平确定造模是否成功。以血清5-HT浓度小于200ng/mL判定造模成功，造模成功50只，造模成功率为62.5%。图1实验流程图4.2生血宝合剂对失眠大鼠体重、一般行为的影响实验期间记录各组大鼠的体重变化，结果见图2，与空白组相比，模型组大鼠第2天起，体重增长出现减缓，与模型组相比，生血宝合剂各剂量给药组对大鼠的体重增长有改善作用。Morris水迷宫实验的结果展示在图3和图4中，图3A揭示，相较于空白组，模型组的逃避潜伏期呈现上升趋势；而与模型组相比，生血宝合剂低剂量组和高剂量组在第2天和第3天的逃避潜伏期均有所减少。图3B显示，相较于空白组，模型组大鼠穿越平台的次数明显减少（P<0.01）；与模型组相比，生血宝合剂各剂量组的大鼠穿越平台次数呈现上升趋势。图4呈现了Morris水迷宫中各组大鼠的行为轨迹图。这些结果表明，生血宝合剂能够改善失眠大鼠的一般状态和自发活动。图2各组失眠大鼠的体重变化结果（n=10）图3Morris水迷宫实验逃避潜伏期与大鼠穿越平台次数结果（n=6）#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，vs空白组；*P<0.5，**P<0.01，***P<0.001，vs模型组图4Morris水迷宫各组大鼠的行为轨迹图示意图4.3生血宝合剂对失眠大鼠睡眠质量的影响利用戊巴比妥钠翻正实验评估生血宝合剂对失眠大鼠睡眠质量的影响。实验结果展示于图5。图5A显示，相较于空白组，模型组的睡眠潜伏期明显增长（P＜0.001）；而与模型组对比，生血宝合剂的各个剂量组均能显著减少失眠大鼠的睡眠潜伏期（P＜0.05）。图5B揭示，相较于空白组，模型组的睡眠持续时间显著降低（P＜0.001）；与模型组相比，生血宝合剂的各个剂量组均能显著提升失眠大鼠的睡眠持续时间（P＜0.05）。这些发现表明生血宝合剂能够显著改善失眠大鼠的睡眠质量。图5生血宝对PCPA失眠模型大鼠睡眠潜伏期与睡眠持续时间的影响（n=6）#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，vs空白组；*P<0.5，**P<0.01，***P<0.001，vs模型组4.4生血宝合剂对失眠大鼠血清中相关炎症因子和神经性因子的影响通过ELISA试剂盒测定生血宝合剂对失眠大鼠血清中相关炎症因子和神经性因子表达水平的影响。如图6所示，与空白组比较，模型组的TNF-α和IL-6水平明显上升（P＜0.001）；而与模型组对比，生血宝合剂高剂量组大鼠血清中的TNF-α水平明显降低（P＜0.05），生血宝合剂低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠血清中IL-6含量均显著降低（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.001）。如图7所示，相较于空白组，模型组大鼠血清中的5-HT、GABA以及BDNF含量均显著下降（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，生血宝合剂高剂量组大鼠血清中的5-HT含量显著增加（P＜0.01），而生血宝合剂低剂量组大鼠血清中的GABA含量显著增加（P＜0.01）。此外，研究结果显示，采用高剂量生血宝合剂干预的大鼠，其血清中脑源性神经营养因子（BDNF）的水平呈现出显著上升趋势（P＜0.05）。此结果表明了生血宝合剂改善失眠大鼠的作用可能与减少失眠大鼠血清中炎症细胞因子TNF-α和IL-6表达水平，及上调血清中神经递质5-HT、GABA和BDNF的含量有关。图6生血宝对PCPA失眠模型大鼠血清中TNF-α、IL-6的影响（n=6）#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，vs空白组；*P<0.5，**P<0.01，***P<0.001，vs模型组图7生血宝对PCPA失眠模型大鼠血清中5-HT、GABA和BDNF的影响（n=6）#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，vs空白组；*P<0.5，**P<0.01，***P<0.001，vs模型组4.5生血宝合剂对失眠大鼠脑组织病理改变及凋亡的影响大鼠脑组织病理染色结果见图8，与空白组比较，模型组下丘脑和海马组织细胞间隙增加，细胞核皱缩，胞质疏松淡染，神经元形态不规整，数量减少。与模型组比较，生血宝合剂中剂量组和高剂量染色较清晰，下丘脑和海马组织可见神经元胞核皱缩情况有所改善，神经元数量增多，间隙减小，排列相对密集。此结果表明生血宝合剂对失眠大鼠脑组织细胞间隙增加、核皱缩等病理改变具有改善作用。TUNEL染色结果如图9所示，与空白组比较，模型组下丘脑和海马组织神经元红色染色区域明显增加，细胞核形态不规整，提示神经元凋亡显著增加；与模型组相比较，生血宝合剂各给药组的下丘脑和海马组织可见红色区域减少，显示神经元凋亡数量减少，形态相对完整。此结果表明生血宝合剂对失眠大鼠脑组织海马、下丘脑神经元凋亡具有明显改善作用。图8大鼠下丘脑组织和海马组织病理染色（HE，×20、×2、×20）图9大鼠下丘脑组织和海马组织凋亡染色（TUNEL，×20、×2、×20）4.6生血宝合剂对失眠大鼠脑组织中神经递质5-HT1AR、GABAARα1和BDNF的mRNA表达水平的影响通过RT-qPCR检测各组大鼠下丘脑组织中神经递质5-HT1AR、GABAARα1和BDNF的mRNA表达水平。研究结果呈现于图10。相较于空白组，模型组大鼠下丘脑组织内5-HT1AR、GABAARα1以及BDNF的mRNA表达水平均显著下降（P＜0.001）。而与模型组相比，生血宝合剂中剂量组大鼠下丘脑组织中5-HT1AR的mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），生血宝合剂高剂量组大鼠下丘脑组织中5-HT1AR、GABAARα1和BDNFmRNA的表达均显著升高（P＜0.001）。同时，本研究还检测了各组大鼠海马组织中神经递质5-HT1AR、GABAARα1和BDNF的mRNA表达水平。如图11所示，与空白组相比，模型组大鼠海马组织中5-HT1AR、GABAARα1和BDNF中mRNA的表达水平均显著降低（P＜0.001）；与模型组相比，生血宝合剂中剂量组大鼠海马组织中5-HT1AR、GABAARα1和BDNFmRNA的表达均升高（P＜0.01），生血宝合剂高剂量组大鼠海马组织中5-HT1AR、GABAARα1和BDNFmRNA的表达均升高（P＜0.001）。这些结果表明了生血宝合剂改善失眠大鼠的作用可能与上调失眠大鼠脑组织中神经递质5-HT1AR、GABAARα1和BDNF的基因表达水平有关。图10大鼠下丘脑组织中5-HT1AR、GABAARα1和BDNFmRNA表达情况（n=6）#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，vs空白组；*P<0.5，**P<0.01，***P<0.001，vs模型组图11大鼠海马组织中5-HT1AR、GABAARα1和BDNFmRNA表达情况（n=6）#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，vs空白组；*P<0.5，**P<0.01，***P<0.001，vs模型组4.7生血宝合剂对失眠大鼠脑组织神经递质5-HT1AR、GABAARα1和BDNF的蛋白表达水平的影响采用Western-Blot检测各组大鼠下丘脑组织中神经递质5-HT1AR、GABAARα1和BDNF的蛋白表达水平。实验结果见图12。与空白组相比，模型组脑组织中5-HT1AR、GABAARα1、BDNF的蛋白表达显著下调（P＜0.01），与模型组对比，生血宝合剂中剂量组可显著上调GABAARα1、BDNF的蛋白表达（P＜0.05），生血宝合剂高剂量组可显著上调5-HT1AR、GABAARα1、BDNF的蛋白表达（P＜0.01）。此结果表明了生血宝合剂改善失眠大鼠的作用可能与上调失眠大鼠脑组织中神经递质5-HT1AR、GABAARα1和BDNF的蛋白表达水平有关。图12大鼠脑组织中5-HT1AR、GABAARα1和BDNF蛋白表达情况（n=6）#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，vs空白组；*P<0.5，**P<0.01，***P<0.001，vs模型组5.讨论生血宝合剂（Shenxuebaomixture）是2020版中国药典收载的补益类中成药大品种该中成药以制何首乌、女贞子、桑葚、墨旱莲、白芍、黄芪、狗脊为组方原料配伍制成。从功效上看，其具备滋养肝肾、补益气血生血之效。在临床适应证方面，主要用于调治气血亏虚证，同时针对因肝肾亏虚、气血两虚所引发的神疲体倦、腰膝酸软、头目眩晕、耳鸣作响、心悸不安、呼吸短促、睡眠障碍、咽喉干涩、纳食不佳等一系列症状，具有较好的治疗作用[9]。中医理论认为，失眠与肝肾亏损、气血不足存在密切关联，二者常互为因果，形成“精血亏虚-阴阳失衡-心神失养”的病理链条[10]。生血宝合剂中何首乌归肝、肾经，可补益肝肾、滋阴养血；女贞子归肾心、肝经，且在中药分类中属补虚药中的补阴药，尤擅滋养肝肾之阴，适用于阴虚内热证[11]；桑葚归肝、肾经，可滋阴补血、补肝益肾、润肠通便、明目乌发[12]；墨旱莲归于肝、肾经络，具有滋补肝肾、凉血止血的功效[13]；白芍归肝经和脾经，可养血调经、平抑肝阳、敛阴止汗、柔肝止痛等功效[14]；黄芪归脾、肺经，具有补气升阳、利水消肿、托毒生肌、固表止汗的功效[15]；狗脊归肝、肾经，可用于补肝肾、强腰膝、祛风湿、利关节以及止血生肌[16]。七味药物配伍即可产生滋养肝肾、益气生血之效。目前生血宝合剂对失眠的防治作用和其相关机制尚不明确，因此我们构建了PCPA诱导的失眠大鼠模型，在此同时，采用ELISA法检测大鼠血清（5-HT）水平进行模型验证，实验数据显示模型组5-HT表达量相较于对照组呈显著降低；且模型组睡眠潜伏期显著增加，睡眠持续时间呈显著下降趋势，表明失眠模型构建成功[17]。随后通过Morris水迷宫和新物体识别实验系统评估大鼠认知功能，行为学分析显示模型组在空间记忆测试中表现出显著延长的逃避潜伏期和明显减少的平台区域穿越频次，证实其学习记忆能力存在多维损伤[18]。现代医学研究表明，失眠与炎症因子TNF-α和IL-6的异常表达存在显著关联[19]，二者通过神经内分泌-免疫网络调控睡眠-觉醒周期，并参与失眠的病理生理过程。TNF-α和IL-6通过激活下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）和交感神经系统（SNS）[20]，促进皮质醇、去甲肾上腺素等觉醒相关激素的释放，抑制非快速眼动睡眠（NREM）的深度睡眠阶段[21]。朱寅捷在探究疏肝解郁方治疗气郁痰阻型失眠伴轻中度抑郁的疗效及其对睡眠质量、负性情绪、血清炎症因子水平的影响中发现经治疗后失眠患者血清中的TNF-α、IL-6明显降低，从而有效缓解失眠症状[22]。本研究结果同样显示，失眠大鼠造模成功后血清中炎症细胞因子TNF-α和IL-6表达水平提高，生血宝合剂给药后能明显降低失眠大鼠血清中炎症细胞因子TNF-α和IL-6表达水平。现代医学认为，大脑中的内源性神经递质，如BDNF、GABA、5-HT在睡眠机制中具有重要的作用[23]。GABA作为抑制性神经递质，通过抑制觉醒中枢来促进睡眠，但失眠患者通常GABA水平较低，导致抑制作用减弱[24]。与此同时BDNF通路在神经可塑性维护、神经元存活保障及突触传递优化等方面发挥着至关重要的作用，这为失眠治疗提供了的潜在靶点[25]。5-HT通过激活5-HT1A受体抑制觉醒脑区（如丘脑皮层网络），促进慢波睡眠。临床研究显示，失眠患者脑脊液中5-HT浓度显著下降，导致入睡困难及睡眠碎片化[26]。衡依然等研究证明酸枣仁总皂苷可改善患者的临床症状，并通过上调海马组织中GABA水平防治失眠症[27]，刘佳敏等发现黑逍遥散可通过海马组织，升高BDNF水平达到治疗失眠症的目的[28]。本研究结果同样显示，失眠大鼠造模成功后，出现大鼠体重增长缓慢，睡眠潜伏期显著增加、睡眠持续时间呈显著下降；血清中神经递质5-HT、GABA和BDNF的含量降低的现象。生血宝合剂给药后能明显改善失眠大鼠的大鼠体重增长缓慢，使得睡眠潜伏期显著缩短、睡眠持续时间呈显著增加，同时显著增加血清中神经递质5-HT、GABA和BDNF的含量，提示生血宝合剂可能通过增加神经递质5-HT、GABA和BDNF的含量发挥对失眠症的防治作用。从HE染色切片结果来看，生血宝合剂给药后，失眠大鼠下丘脑和海马组织可见红色区域减少，显示神经元凋亡数量减少形态相对完整，一定程度上缓解失眠症[29]。通过实时荧光PCR研究发现，生血宝合剂给药后失眠大鼠海马组织中5-HT1AR、GABAARα1和BDNFmRNA的表达均升高，提示生血宝合剂改善失眠大鼠的作用可能与上调失眠大鼠脑组织中神经递质5-HT1AR、GABAARα1和BDNF的基因表达水平有关[30]。从Western-Blot实验结果来看，生血宝合剂给药后，失眠大鼠脑组织中神经递质5-HT1AR、GABAARα1和BDNF的蛋白表达上调，促进大脑中的内源性神经递质表达，从而使其含量增加，防治失眠症[31]。综上所述，本文通过动物实验揭示了生血宝合剂是通过增加神经递质5-HT、GABA和BDNF的含量、上调脑组织中神经递质5-HT1AR、GABAARα1、BDNF的基因和蛋白表达水平为主要策略去发挥抗失眠症的作用，并且可能是通过降低血清中炎症细胞因子TNF-α和IL-6表达水平来达到治疗失眠症效果。6.结论生血宝合剂可显著改善PCPA诱导的失眠大鼠体重、一般状态和自发活动，改善失眠大鼠的睡眠质量和记忆功能，进一步研究结果提示其改善失眠的作用机制可能与抑制血清中炎症因子TNF-α、IL-6的含量、促进血清中神经递质5-HT、GABA和BDNF的水平、改善脑组织神经元凋亡以及上调脑组织中神经递质5-HT1AR、GABAARα1、BDNF的基因和蛋白表达水平有关。参考文献ADDINEN.REFLIST[1]中华医学会神经病学分会，中华医学会神经病学分会睡眠障碍学组.中国成人失眠诊断与治疗指南（2017版）[J].中华神经科杂志，2018，51（5）:324-335.[2]芦玥,贾跃进,柴智,等.枢机安神汤对氯苯丙氨酸失眠大鼠神经递质和焦虑的影响[J].世界中医药,2024,19(02):185-190.[3]郭兮恒.2022中国国民健康睡眠白皮书[R].北京:中国睡眠研究会,2022.[4]中华医学会神经病学分会睡眠障碍学组.中国成人失眠诊断与治疗指南(2023版)[J].中华神经科杂志,2024,57(06):560-584.[5]SmidAKK,MlakarA,TukovnikV.Toxicityofbenzodiazepinesinthetreatmentofinsomniadisordersinolderadults:asystematicliteraturereview[J].CroatianMedicalJournal,2024,65(2):10.[6]ZouCJ,JiaLX,WangXH,etal.ComparativeefficacyandsafetyofChinesepatentmedicinesofirondeficiencyanemiaduringpregnancy:Anetworkmeta-analysis.[J].Worldjournalofclinicalcases,2024,12(18):3515-3528.[7]BaoY,ZhouH,FuY,etal.ZhumianGranulesimprovesPCPA-inducedinsomniabyregulatingtheexpressionlevelofneurotransmittersandreducingneuronalapoptosis[J].JournalofEthnopharmacology,327[2025-04-15].[8]WangL,QiX,WangS,etal.Banxia-YiyirenalleviatesinsomniaandanxietybyregulatingthegutmicrobiotaandmetabolitesofPCPA-inducedinsomniamodelrats[J].FrontiersinMicrobiology,2024,151405566-1405566.[9]陈晓峰,张一妙,朱丽红.生血宝合剂的临床应用进展[J].中成药,2024,46(05):1589-1593.[10]李子恒,刘鑫,王平,等.酸枣仁汤通过影响脑、心、肝脏腑功能治疗失眠的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(16):59-66.[11]刘美红,邹峥嵘.女贞子化学成分、药理作用及药动学研究进展[J].热带亚热带植物学报,2022,30(03):446-60.[12]刘莹,覃骊兰,蓝毓营.桑葚化学成分、药理作用及质量标志物研究进展[J].重庆医学,2021,50(06):1063-7.[13] 张代亮,王杰琼,马艳妮,etal.墨旱莲化学成分及药理作用研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2023,25(08):140-4.[14] 王秋艳,王世新,隋方宇,etal.白芍活性成分、药理作用及成分变化的影响因素研究进展[J].中草药,2025,56(05):1817-29.[15] 付慧婕,雷根平,董盛,etal.黄芪的现代药理作用及研究进展[J].河北中医,2025,47(04):695-9+704.[16] 郭忠静,李恩念,赵志敏,etal.狗脊化学成分、药理作用及质量控制的研究进展[J].中药新药与临床药理,2024,35(01):152-7.[17]徐波,叶子靖,王平,等.安寐丹调控cGAS/STING信号通路介导免疫炎症改善失眠大鼠学习记忆机制[J].中国实验方剂学杂志,2025,31(10):27-35.DOI:10.13422/ki.syfjx.20250442.[18]陈燕,许晓丽,陈亚萍,等.半夏秫米汤对失眠大鼠下丘脑5-HT介导的cAMP/CREB/BDNF通路的影响[J].中药药理与临床,2024,40(10):10-14.DOI:10.13412/ki.zyyl.20241015.002.[19] 张梦杰,王雅静,刘艳蕊,etal.基于网络药理学及实验验证探究双夏汤治疗失眠的作用机制[J].中国现代应用药学,2025,42(02):226-39.[20] AANV,BGPC.Sleep,thehypothalamic–pituitary–adrenalaxis,andcytokines:multipleinteractionsanddisturbancesinsleepdisorders[J].Endocrinolo