生鱼肉中药物残留孔雀石绿的快速测定

生鱼肉中药物残留孔雀石绿的快速测定摘要：以近红外发光微球作为标记探针，成功制备出荧光免疫层析试纸条，构建了一种用于水产品中孔雀石绿定量检测的高灵敏免疫层析新方法。对试纸条的制备条件展开系统优化，包括标记微球与抗体的偶联比例、偶联pH值等。采用T/C比值法构建定量检测孔雀石绿的标准曲线，对该方法进行性能评估。结果显示，该方法定量检测水产品中孔雀石绿灵敏度较高，线性范围为0.1～1.0μg/kg，最低检出限为0.05μg/kg。对不同加标水平（0、0.10、0.40、0.60、0.80、1.00μg/kg）的水产品样本进行检测，平均回收率在91.78%～117.50%，变异系数（CoefficientofVariation，CV）介于1.62%～9.34%（n=4），表明该方法具有良好的准确性和精密度。本研究成功建立的近红外发光微球免疫层析试纸条定量检测方法，为水产品中孔雀石绿的快速筛查和定量分析提供了有力的技术支持。关键词：荧光微球;孔雀石绿;免疫层析方法RapidDeterminationoftheDrugResidueMalachiteGreeninRawFishMeatAbstract：Usingnear-infraredluminescentmicrospheresasthelabelingprobe,fluorescentimmunochromatographicteststripsweresuccessfullyprepared,andanewhighlysensitiveimmunochromatographicmethodwasconstructedforthequantitativedetectionofmalachitegreeninaquaticproducts.Thepreparationconditionsoftheteststripsweresystematicallyoptimized,includingthecouplingratioofthelabeledmicrospherestotheantibodyandthecouplingpHvalue.ThestandardcurveforthequantitativedetectionofmalachitegreenwasconstructedusingtheT/Cratiomethod,andtheperformanceofthemethodwasevaluated.Theresultsshowedthatthemethodwassensitiveforthequantitativedeterminationofmalachitegreeninaquaticproducts,withthelinearrangeof0.1-1.0μg/kgandthelowestdetectionlimitof0.05μg/kg.Theaveragerecoveriesofaquaticsamplesspikedwithdifferentspikedlevels(0,0.10,0.40,0.60,0.80,1.00μg/kg)werebetween91.78%and117.50%.Theaveragerecoveriesrangedfrom91.78%to117.50%,andthecoefficientsofvariation(CV)rangedfrom1.62%to9.34%(n=4),indicatingthatthemethodhasgoodaccuracyandprecision.ThequantitativedetectionmethodofNIR-luminescentmicrosphereimmunochromatographicteststripssuccessfullyestablishedinthisstudyprovidesapowerfultechnicalsupportfortherapidscreeningandquantitativeanalysisofmalachitegreeninaquaticproducts.Keywords:Fluorescentmicrosphere;Malachitegreen;Immunochromatographicmethod目录1.引言 ]2.3.9免疫层析试纸条性能评价线性范围和检出限向阴性黑鱼样本提取液中加入浓度分别为0、0.1、0.4、0.6、0.8、1.0μg/kg的孔雀石绿标准品,每个浓度梯度设置3组平行实验,以孔雀石绿的浓度为横坐标（X轴）,检测线（T线）和质控线（C线）的荧光信号强度比值（T/C值）为纵坐标（Y轴）绘制标准曲线。回收率和CV值采用阴性黑鱼样本进行加标前处理实验，加标浓度分别为0.1、0.5、1.0μg/kg,每组实验重复4次（n=4）。利用荧光分析仪对试纸条进行检测，计算回收率和变异系数(CoefficientofVariation,CV)。计算公式：回收率=实测浓度值/加标浓度值×100%CV=标准偏差（SD）/平均值（Mean）×100%3.结果与分析3.1孔雀石绿抗原-抗体对的筛选结果表4孔雀石绿抗原-抗体对筛选结果Table4Malachitegreenantigen-antibodypairscreeningresults组合MG浓度ug/KgTCDr标记：抗体1包被：抗原10119.06178.5911.5150.185.49376.3751.11919.27474.7120.124标记：抗体1包被：抗原200.37674.8600.0050.10.44470.9530.00610.40763.7520.006标记：抗体1包被：抗原300.46651.5180.0090.10.46462.3070.00710.46562.2220.007标记：抗体2包被：抗原106.16457.1760.1080.15.83850.6510.11515.71454.8740.104标记：抗体2包被：抗原201.85655.2710.0340.11.78767.1660.02711.63758.5200.028标记：抗体2包被：抗原302.96880.7900.0370.12.56483.5520.03112.39479.5890.03标记：抗体3包被：抗原10042.42000.1041.78101040.6050标记：抗体3包被：抗原20084.03400.1081.39901079.9660标记：抗体3包被：抗原30068.51300.1069.53201067.9320标记：抗原1包被：抗体102.85355.5210.0510.12.92352.2750.05612.34447.8950.049标记：抗原1包被：抗体200.76269.080.0110.10.8869.0230.01310.91669.4010.013标记：抗原1包被：抗体302.13286.1940.0250.12.12677.0680.02812.18776.1010.029标记：抗原2包被：抗体1037.749000.123.0790.57140.388130.86600表4孔雀石绿抗原-抗体对筛选结果（续）Table4Malachitegreenantigen-antibodypairscreeningresults(continued)组合MG浓度ug/KgTCDr标记：抗原2包被：抗体20036.04200.128.12718.2011.545125.61317.8971.431标记：抗原2包被：抗体30058.26300.1043.56901061.6990标记：抗原3包被：抗体101.45956.1720.0260.11.3250.4920.02611.3354.4040.024标记：抗原3包被：抗体200.39265.0910.0060.10.64464.7110.0110.4470.0720.006标记：抗原3包被：抗体302.28278.7490.0290.12.11178.6140.02711.94879.2370.025测试结果表明，抗体1-抗原1组合在所有浓度下表现最优，Dr值分别为1.515(0ug/Kg)、1.119(0.1ug/Kg)和0.124(1ug/Kg)。故选用厂家1的孔雀石绿单克隆抗体为标记抗体，孔雀石绿抗原为包被抗原，制备免疫层析试纸条。3.2偶联pH值的优化结果通过比较缓冲体系的不同pH值下的检测线(T线)和质控线(C线)的信号强度比值(T/C值)来确定偶联所需环境的最适pH值。由图1可知，pH6.0时Dr值最高，表明此条件下偶联效率最佳。图1不同pH值下的T/C值Figure1T/CvaluesatdifferentpHvalues3.3抗体最佳用量的优化结果通过比较不同抗体标记量下检测线(T线)和质控线(C线)的信号强度比值(T/C值)来确定最优抗体标记量。由图2可知，当抗体标记量达到30μg时，T/C值达到最高，表明此条件下偶联效率最佳。图2不同抗体标记量的测定结果Figure2Theresultsofthedeterminationofdifferentamountsofantibodylabeling3.4线性范围和检出限在阴性黑鱼样本提取液中添加不同浓度的的孔雀石绿标准品，评价其荧光响应信号值。以孔雀石绿的浓度为横坐标（X轴）,检测线（T线）和质控线（C线）的荧光信号强度比值（T/C值）为纵坐标（Y轴）通过四参数拟合的数学方法构建标准曲线。如图3所示,标准曲线的拟合方程为Y=（1.77994+0.18629）/[1+X/(0.1656/0.27478)^1.20120]-0.18629,R^2=0.99940,以及其相应的线性范围(0.1～1.0μg/kg)；经计算检出限（LOD）为0.05μg/kg。上述结果表明,孔雀石绿的高灵敏检测可以通过构建基质标准曲线来实现。图3基质定量标准曲线Figure3Calibrationcurveofmatrixquantitative3.5回收率和CV值为评估检测方法的准确性和精密度，通过阴性样本加标实验来检测加标回收率及CV值，测试结果见表1。经检测，样本加标回收率分别为117.50%、101.63%和91.78%，不同浓度点下，CV值分别为9.34%、4.52%和1.62%,方法的准确度和精密度符合方法学要求，具有可行性。表5水产样本中孔雀石绿加标回收实验(n=4)Table1.Recoveryexperimentsofmalachitegreenspikedinaquaticproducts(n=4).样本加标浓度/(μg/kg)检测值/(μg/kg)检测平均值/(μg/kg)回收率/%变异系数/%阴性黑鱼样本2117.50%9.34%10.50.530.51101.63%4.52%0.50.520.4810.910.9291.78%1.62%0.930.930.9参考文献罗凯,张威,刘文娟,等.聚集诱导发光微球免疫层析试纸条定量检测水产品中孔雀石绿[J].食品安全质量检测学报,2024,15(06):83-92.DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.20231225009.张艺蓓,岳田利,乔海鸥,等.超高效液相色谱-串联质谱法检测鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物[J].食品科学,2014,35(10):179-184.李永夫,高华鹏,姚芳,等.高效液相色谱法检测鳗鱼中孔雀石绿及其代谢物残留[J].安徽农业科学,2009,37(01):31-33.DOI:10.13989/ki.0517-6611.2009.01.197.FengW,HongW,YudongS,etal.BispecificMonoclonalAntibody-basedMulti-analyteELISAforFuraltadoneMetabolite,MalachiteGreenandLeucomalachiteGreeninAquaticProducts.[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry,2016,山珊,彭涛,杨万春,等.胶体金免疫层析法定量检测孔雀石绿[J].食品科学,2013,34(16):160-163.全国水产标准化技术委员会.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法:GB/T20361-2006[S].中国标准出版社,2006.全国水产标准化技术委员会.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定:GB/T19857-2005[S].中国标准出版社,2005.宋妍灵,翟璐,李因来,等.基于Eu3+荧光微球的丁香酚时间分辨荧光免疫层析技术的建立[J].农业生物技术学报,2024,32(09):2190-2202.姚南南,刘芳,高会群,等.基于荧光微球的多菌灵残留快速检测试纸条的研制[J].食品科技,2024,49(01):344-350.DOI:10.13684/ki.spkj.2024.01.042.高海岗.孔雀石绿纳米抗体的制备及其免疫层析检测方法的建立与应用[D].扬州大学,2021.DOI:10.27441/ki.gyzdu.2021.001969.张梓涵,赵志慧,张苑怡,等.新型银包铜纳米线的制备及在检测罗非鱼中孔雀石绿残留中的应用[J].食品工业科技,2019,40(16):212-217.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2019.16.036.吴焕乐,唐建设,方娟,等.P