基因治疗产品非临床研究技术指南（试行）

基因治疗产品非临床研究技术指南（试行）1范围本指南适用于旨在通过修饰、替换、敲除或激活人体基因组序列发挥预防、治疗作用的基因治疗产品非临床研究设计与评价，包括体内直接给药的基因治疗产品、体外基因修饰后回输的细胞类基因治疗产品、基因编辑产品。本指南不适用于预防性基因工程疫苗、生殖细胞基因编辑产品、体细胞基因工程改造的非治疗性产品。由于基因治疗产品异质性强，本指南为通用性技术指导原则，研发过程中需结合产品特点具体调整研究内容。2一般基本原则2.1风险分层原则根据产品的载体类型、整合特性、给药途径、靶组织、适用人群，分层开展非临床研究，整合风险越高、临床暴露时间越长、用于儿童/育龄人群的产品，需开展更全面的安全性研究，在控制研究风险的前提下支持临床试验推进。2.2循序渐进原则非临床研究需分阶段推进，早期临床试验阶段需完成核心安全性与有效性研究，支持人体试验起始剂量与方案设计；确证性临床试验阶段需补充完成长期毒性、致癌性等迟发风险研究；上市后变更需根据变更程度补充桥接研究。2.3具体问题具体分析原则鼓励基于产品机制特点采用创新研究模型与评价方法，对于罕见病等没有合适动物模型的适应症，可结合体外研究、人源化模型数据、已有公开研究数据进行综合评价，无需强制要求完整的动物疾病模型药效研究。3非临床研究核心基础要求3.1受试物要求3.1.1质量一致性要求非临床研究所用受试物的质量属性需与临床试验拟用产品一致，需明确受试物的制备工艺、质量控制指标，包括载体滴度、基因序列正确性、转导/编辑效率、纯度、杂质水平（复制型病毒RCV、宿主细胞DNA残留、宿主蛋白残留、工艺杂质残留）等。早期临床试验可采用中试规模制备的受试物，但其质量标准不得低于商业化产品的要求，工艺发生重大变更后需开展头对头比对研究，证明变更前后产品的药效与安全性特征可比。3.1.2特殊受试物要求体外基因修饰细胞产品的受试物需为终制备产品，即经过基因修饰、纯化、制备后的最终回输产物，不得采用未经终处理的中间细胞作为受试物；对于联合给药的产品，需同时考察联合递送系统、佐剂的影响，所用赋形剂需与临床配方一致。3.2动物模型选择要求3.2.1物种选择要求安全性研究需同时结合啮齿类与非啮齿类大动物开展，优先选择对载体、转基因产物的免疫原性反应、代谢特征与人类更接近的物种：例如AAV载体研究推荐采用非人灵长类（NHP）开展长期毒性研究，其预存抗体特征、免疫反应与人类高度相似；若目的基因产物仅在人类有功能，啮齿类同源基因无交叉反应，需采用人源化动物模型。3.2.2模型适用性要求药效学研究需选择能够模拟人类疾病发病机制、临床症状的疾病模型，包括自发疾病模型、基因编辑修饰的同源疾病模型、诱发性疾病模型、人源肿瘤异种移植模型（抗肿瘤基因治疗）；对于罕见单基因遗传病，无合适大动物疾病模型的，可在正常动物验证靶组织转导效率与表达水平，结合体外细胞功能验证数据支持临床开发。3.2.3免疫状态匹配要求需根据临床适用人群的免疫状态选择匹配的动物模型：用于免疫缺陷患者的产品需采用免疫缺陷动物模型；用于免疫正常人群的产品需采用免疫功能完整的动物模型；基因修饰细胞回输产品需根据细胞来源选择合适的免疫状态，避免不必要的移植物抗宿主反应干扰结果判断。4药效学研究4.1作用机制验证需首先明确产品的作用机制：验证目的基因是否能够正确进入靶细胞、实现预期的基因修饰（整合、敲除、表达等），目的基因产物是否具有预期的生物学活性；基因编辑产品需体外验证靶点识别、切割、编辑的正确性，初步验证编辑效率；溶瘤病毒需验证对肿瘤细胞的选择性裂解能力与免疫激活活性。4.2体外药效学研究需开展系统的体外药效研究，包括：①不同细胞类型的转导/编辑效率，明确对靶细胞的转导特异性；②目的基因的表达水平与持续时间，验证产物活性；③基因修饰后靶细胞的功能改变，例如地中海贫血基因编辑产品需验证编辑后造血干细胞的β珠蛋白表达水平、红细胞携氧功能；④剂量-效应关系，明确不同浓度下的效应强度，获得半有效浓度（EC50）等参数；⑤初步筛选潜在的毒性风险，例如对正常细胞的杀伤作用。4.3体内药效学研究在合适的疾病模型中开展体内药效研究，内容包括：①验证临床拟用给药途径、给药方案下的药效，明确目的基因在靶组织的转导/编辑效率、表达水平；②考察对疾病相关症状、生化指标、组织病理学改变的改善作用，抗肿瘤产品需考察对肿瘤生长、转移的抑制作用以及对生存期的延长，单基因遗传病需考察对应缺陷蛋白的补充与生理功能的恢复；③开展完整的剂量-效应关系研究，明确最低有效剂量、最大效应剂量、未观察到药效增加的最高剂量，为临床给药剂量设计提供核心依据；④考察药效的持续时间，评估是否需要重复给药，明确给药间隔。5药代动力学研究基因治疗产品的药代动力学研究需关注基因水平的分布、存续与清除，不同于小分子药物的暴露量评价，核心内容包括：5.1生物分布研究所有基因治疗产品均需开展定量生物分布研究，采用微滴数字PCR（ddPCR）、定量qPCR等特异性定量方法，检测给药后不同时间点（包括早期：给药后数小时、1天、3天；中期：1周、2周、1个月；晚期：3个月、6个月、12个月）所有主要组织器官（靶组织、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、脊髓、性腺、淋巴结、骨髓等）的载体基因组或目的基因拷贝数，明确产品的分布特征：①是否主要富集于靶组织，非靶组织的分布水平；②非靶组织中载体的动态变化，是否存在持续滞留；③性腺组织的载体水平，评估生殖系传递风险。体外基因修饰细胞产品需额外检测修饰后细胞的体内归巢效率、在不同组织的分布比例、长期存续能力。5.2表达动力学研究检测不同时间点各组织中目的基因的mRNA水平与蛋白水平，明确目的基因表达的起始时间、达峰时间、峰浓度、表达持续时间，评估是否存在表达沉默，考察表达水平与药效、毒性的相关性，为临床给药方案设计提供依据。5.3清除与排泄研究检测给药后不同时间点尿液、粪便、唾液等排泄物中的载体拷贝数，明确载体的主要排泄途径、清除动力学，评估是否存在持续排毒，评估RCV等活性杂质的传播风险。5.4基因编辑产品特殊药代要求额外检测不同组织中编辑后基因的比例，考察编辑细胞的克隆分布与长期扩增情况，明确编辑效率的长期稳定性。6安全性研究6.1一般毒性研究根据临床拟用给药方案设计毒性研究：单次给药产品仅需开展单次给药的长期毒性研究，重复给药产品需开展对应给药频率的重复给药毒性研究；试验设计需设置低、中、高三个剂量组，高剂量需保证足够的暴露量，能够暴露潜在毒性，低剂量接近临床拟用剂量；观察周期需根据产品特性确定：瞬时表达产品观察周期至少3个月，长期表达产品观察周期至少6个月，整合型产品需延长至12个月以上；观察指标需包括：一般临床指标（体重、摄食、生命体征、心电图）、血液学、血清生化学、尿液分析、全面的组织病理学检查，重点关注靶组织与高分布组织的病理改变；局部给药产品需额外考察局部毒性，例如眼内给药需开展眼科专科检查，鞘内给药需开展神经功能学检查。需明确给出最大耐受剂量（MTD）与未观察到不良反应的剂量水平（NOAEL），为临床起始剂量提供依据。6.2免疫原性与炎症毒性研究免疫反应是基因治疗最常见的不良反应，需开展系统评价：①检测动物体内针对载体的中和抗体、结合抗体的产生动力学与滴度，检测针对转基因产物的抗体与细胞免疫反应；②评估免疫反应对转导效率、转基因表达的影响，是否会导致转导细胞被清除、表达下调；③检测给药后不同时间点血清炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ等）水平，观察是否发生细胞因子释放综合征（CRS），评估全身炎症对重要脏器的损伤；④局部给药需评估局部炎症反应对靶组织功能的影响，例如肝内给药评估肝细胞损伤，脑内给药评估神经炎症。对于临床拟用免疫抑制方案的产品，可非临床评估不同方案对免疫反应的抑制效果，支持临床方案设计。6.3插入突变与致癌/致瘤性风险评估插入突变导致的致癌是基因治疗最核心的迟发风险，需根据载体整合特性分层评估：6.3.1整合型载体（逆转录病毒、慢病毒、转座子系统等）：需首先开展全基因组插入位点测序，体外与体内分别分析插入位点的分布特征，明确是否存在插入癌基因、抑癌基因区域的偏好性；长期观察中监测不同时间点插入克隆的扩增情况，若出现携带癌基因插入的克隆优势扩增，提示明确致癌风险；体外基因修饰细胞产品需开展软琼脂克隆形成试验检测体外转化，回输后在免疫缺陷动物中长期观察至少12个月，监测肿瘤发生情况，开展全面的组织病理学检查。6.3.2非整合型载体（AAV、腺病毒、非病毒mRNA载体等）：整体整合风险较低，但需采用全基因组测序检测低频整合事件，明确整合频率与位点分布；若靶组织为增殖活跃的组织（肝脏、造血组织），且产品为终身表达，需延长观察周期评估迟发肿瘤风险。6.3.3基因编辑产品特殊致瘤风险：需重点评估基因编辑导致的染色体结构异常（大片段缺失、重复、易位），若编辑位点靠近癌基因或抑癌基因，需充分评估编辑对基因功能的影响，明确致癌风险。6.4脱靶效应评估（基因编辑产品专用）所有基因编辑产品均需开展全基因组范围的脱靶效应评估：首先通过生物信息学预测潜在脱靶位点，再采用GUIDE-seq、Digenome-seq、CIRCLE-seq等无偏好的全基因组检测方法，在体外靶细胞、体内靶组织中验证脱靶编辑，明确脱靶位点的位置与编辑频率；重点分析脱靶位点是否位于功能基因区域（尤其是癌基因、抑癌基因），评估脱靶的致癌风险；若脱靶编辑频率高于0.01%，且位于功能基因区域，需充分评估风险；需采用长读长测序检测脱靶导致的大片段染色体结构异常，评估其风险。6.5生殖发育毒性与遗传毒性拟用于育龄人群的产品均需开展生殖发育毒性研究：若生物分布研究显示性腺组织无可检测到的载体或编辑事件，可适当减免研究；若性腺存在可检测的暴露，需依次开展生育力与早期胚胎发育毒性试验、胚胎-胎仔发育毒性试验、围产期发育毒性试验，评估对生育力、胚胎发育、出生后发育的影响，明确致畸风险。整合型载体与基因编辑产品需开展遗传毒性试验，包括体内微核试验、染色体畸变分析，评估对基因组稳定性的影响。6.6特殊安全性研究针对不同产品的特性开展额外的安全性研究：①病毒载体产品需开展复制型病毒（RCV/RCR）监测，长期观察RCV在体内的复制、排毒与致病性；②非病毒递送系统（如LNP）需评估递送材料本身的毒性，包括全身炎症反应、脏器损伤；③溶瘤病毒需评估对正常组织的感染与损伤，明确肿瘤选择性；④基因修饰免疫细胞产品需评估细胞因子释放综合征、免疫相关不良事件（如神经毒性）的风险。7不同类型产品的特殊考虑7.1体内基因治疗产品：静脉给药的大剂量产品需重点评估肝毒性、血栓风险、全身免疫反应，需开展非人灵长类长期毒性研究；局部给药产品（如眼内、脑内、肿瘤内）需重点评估局部毒性，同时评估全身暴露的安全性；需开展不同预存抗体滴度下的转导效率与安全性研究，支持临床患者入组标准设计。7.2体外基因修饰细胞产品：需重点评估基因修饰过程中产生的转化细胞的致瘤风险，开展体外转化试验与体内致瘤试验；需评估修饰后细胞回输后的归巢、存续与克隆稳定性，监测异常克隆扩增；免疫细胞产品需重点评估细胞因子释放与免疫相关毒性。7.3基因编辑产品：体外编