基因治疗产品稳定性研究技术指南（试行）

基因治疗产品稳定性研究技术指南（试行）1目的与适用范围为规范基因治疗产品的稳定性研究，科学评估产品在生产、贮藏、运输、使用全过程中的质量变化规律，明确产品有效期与贮藏条件，保障基因治疗产品临床使用的安全性和有效性，制定本指南。本指南适用于以核酸为活性成分、经基因修饰的细胞为活性成分的各类基因治疗产品，包括但不限于：体内递送的非病毒核酸类产品（质粒DNA、mRNA、小核酸等）、病毒载体类基因治疗产品（腺相关病毒AAV、慢病毒、腺病毒、溶瘤病毒等）、体外基因修饰的细胞治疗产品（CAR-T、CAR-NK、基因修饰干细胞、基因编辑T细胞等）、基因编辑工具产品等。本指南不适用于未经过基因修饰的体细胞治疗产品、预防性核酸疫苗、常规病毒疫苗。2总体研究原则2.1分阶段递进原则稳定性研究贯穿产品研发全生命周期，随研发进展逐步完善研究内容、积累数据，从早期研发到临床试验、上市申请、上市后持续研究逐步细化，满足不同阶段的注册和临床需求。2.2风险导向原则基于产品结构、剂型、递送系统、生产工艺特性，识别影响产品稳定性的关键风险点，针对性设计研究方案，重点考察高风险质量属性的变化：例如mRNA产品重点考察核酸降解与LNP颗粒聚集，活细胞产品重点考察细胞活率与表型稳定性，病毒载体重点考察滴度下降与衣壳聚集。2.3产品特性适配原则基因治疗产品类型多样，结构与活性成分差异大，稳定性研究设计无需一刀切，应根据产品自身的不稳定性特征调整考察项目、检测频率与研究周期：例如冻存产品无需照搬常温产品的试验条件，活细胞产品可适当缩短考察周期、加密检测点。2.4可比性评价原则发生生产工艺放大、处方变更、包装变更、产地变更等产品变更时，应开展变更前后产品的稳定性比对研究，桥接变更前后的质量，证明变更不影响产品的稳定性与有效期。2.5质量源于设计原则稳定性研究应早期介入处方工艺开发，通过强制降解试验筛选稳定处方与工艺参数，提前识别降解途径，在产品开发阶段就保证产品的固有稳定性，而非仅在注册阶段开展验证性研究。3影响基因治疗产品稳定性的关键因素3.1活性成分固有不稳定性核酸类活性成分易发生磷酸二酯键断裂、脱氨基、碱基修饰丢失、序列突变，mRNA易发生5'帽结构水解、polyA尾缩短，导致活性完全丧失；病毒载体活性成分易发生衣壳蛋白变性、病毒基因组断裂降解、衣壳聚集、空衣壳比例升高，导致感染性滴度快速下降；基因修饰细胞活性成分易发生细胞凋亡、活率下降、表型改变、干性丢失、目的基因沉默或整合位点改变，导致功能丧失。3.2剂型处方相关不稳定性非病毒递送系统如脂质纳米粒（LNP）易发生脂质过氧化、颗粒融合、粒径增大、包封率下降，阳离子聚合物易发生聚集体形成；液体制剂pH值改变可加速核酸降解、蛋白变性；冻干制剂若水分控制不当，可引发活性成分降解，储存过程中水分升高会显著降低产品稳定性。3.3生产工艺相关不稳定性生产过程中的反复冻融、机械剪切、高温处理可诱导病毒衣壳聚集、核酸断裂、LNP颗粒破坏；残留的生产过程杂质如核酸酶、蛋白酶、宿主细胞蛋白可促进活性成分降解，杂质含量越高，产品稳定性越差。3.4容器密封系统相互作用部分基因治疗产品如AAV易吸附于普通塑料容器表面，导致活性成分含量下降；包装材料中的浸出物可催化脂质过氧化、核酸降解；不同材质容器对产品稳定性的影响差异较大，需针对性考察。3.5外界环境因素温度波动、光照、氧化、震荡均可加速产品降解，例如mRNA对光照和高温敏感，常温放置数小时即可发生显著降解；冻存产品反复冻融可诱导病毒聚集、细胞破碎，活率下降幅度可达30%以上。4分阶段稳定性研究要求4.1临床早期研发阶段本阶段研究目的为初步筛选稳定处方、确定初步贮藏条件，支持早期临床试验样品的存储与使用。研究要求：开展初步影响因素试验，考察核心质量属性的变化，可根据样品量适当减少检测点，至少获得3~6个月的初步长期稳定性数据，即可支持早期临床样品的有效期拟定，后续随研发进展逐步更新数据。4.2临床试验阶段本阶段研究目的为确认处方工艺的稳定性，支持临床试验样品的贮藏运输，明确使用过程中的稳定性要求。研究要求：完成完整的影响因素试验、加速稳定性试验与长期稳定性试验，开展使用过程稳定性考察，积累至少12个月的长期稳定性数据，根据临床试验周期确定临床样品的有效期，为后续上市申报积累数据。4.3上市申请阶段本阶段研究目的为确定商业化产品的贮藏条件、有效期与包装，满足注册申报要求。研究要求：采用至少3批代表性商业化规模生产的注册批样品，试验方案符合本指南要求，获得至少12个月以上的长期稳定性数据，拟定有效期时保留足够的安全空间，所有数据符合质量标准要求。4.4上市后持续稳定性研究本阶段研究目的为验证上市产品的稳定性，更新有效期，监控产品质量变化。研究要求：上市后按照拟定的稳定性考察方案持续开展长期稳定性研究，直至拟定有效期；发生重大变更时开展桥接稳定性研究；每年对稳定性数据进行汇总分析，必要时调整有效期或贮藏条件。5具体稳定性研究试验设计5.1基本要求（样品与批次）用于稳定性研究的样品应符合拟定的质量标准，生产工艺应与对应阶段产品工艺一致；注册申报阶段要求至少3批样品，批次应能代表商业化生产的工艺水平与质量波动；样品量应满足整个考察周期所有检测项目的需求，每个检测点应有足够的平行样品保证检测准确性。5.2影响因素试验（强制降解试验）目的为识别产品降解途径，筛选稳定处方与包装，验证分析方法的稳定性指示能力，为长期稳定性研究设计提供依据。研究要求：（1）光照试验：将样品除去外包装后置于光照箱中，控制温度为25℃±2℃，总照度不低于1.2×10^6lx·h，近紫外能量不低于200W·h/m²，分别于第5天、第10天取样检测，考察指标变化；对光敏性产品（如mRNA）应加密检测点，考察短时间光照的影响。（2）温度与湿度试验：分别考察高温（40℃±2℃、60℃±2℃）、高湿（75%RH±5%RH、92.5%RH±5%RH）条件，分别于第5天、第10天取样检测，评估温湿度对稳定性的影响。（3）冻融试验：针对冷冻贮藏的产品，按照临床使用与生产过程中可能遇到的冻融次数，开展至少3次、最多5次冻融循环试验，每次循环从贮藏温度完全融化至室温（或25℃），再冷冻至原贮藏温度，完成设定次数后取样检测，考察冻融对产品质量的影响。（4）其他强制降解试验：根据产品特性增加pH梯度降解试验、氧化降解试验、剪切降解试验等，例如针对递送系统考察搅拌剪切对颗粒稳定性的影响，针对核酸考察不同pH下的降解速率；强制降解试验一般控制活性成分降解率在5%~20%之间，避免过度降解，以便准确识别降解途径。5.3加速稳定性试验目的为考察短期温度波动对产品质量的影响，支持长期有效期的确定，评估产品运输过程中的稳定性。试验条件根据产品长期贮藏条件确定：长期贮藏于-80℃的产品，加速条件可设为-20℃±5℃，考察周期6个月；长期贮藏于-20℃的产品，加速条件可设为2℃~8℃，考察周期6个月；长期贮藏于2℃~8℃的产品，加速条件可设为25℃±2℃/60%RH±5%RH，考察周期6个月；长期贮藏于室温（15℃~25℃）的产品，加速条件可设为40℃±2℃/75%RH±5%RH，考察周期6个月。检测点一般设置为0、1、2、3、6个月，可根据产品特性调整。5.4长期稳定性试验目的为确定产品有效期与贮藏条件，是确定有效期的核心依据。试验条件采用产品拟定的实际贮藏条件，常用条件为：-80℃±10℃、-20℃±5℃、2℃~8℃、15℃~25℃，可根据产品特性确定；检测点设置一般为：第一年每3个月1次，第二年每6个月1次，第二年之后每年1次，考察周期应超过拟定的有效期，注册申报时至少提供12个月的长期稳定性数据，上市后继续考察至拟定有效期。5.5使用过程稳定性研究目的为明确产品临床使用过程中的质量稳定性，确定开瓶后、复溶后、稀释后、输注过程中的放置时限。研究要求：模拟临床实际使用场景，考察产品复溶后、稀释后、开瓶后在室温或冷藏条件下放置不同时间的质量变化，重点考察活性、降解产物、微生物污染等指标，确定临床使用的最长放置时限；对于多剂量产品，还需考察多次开瓶使用过程中的稳定性。5.6运输稳定性考察目的为验证产品在运输过程中经受温度波动、震荡后的质量稳定性，需模拟实际运输的最长时间、温度波动范围与振动条件，运输完成后取样检测所有关键质量属性，确认符合质量标准要求。5.7容器密封系统稳定性考察目的为考察包装容器与产品的相容性，以及贮藏过程中容器的密封性。研究内容包括：考察容器对活性成分的吸附作用，检测不同贮藏时间活性成分含量变化，评估吸附的影响；检测包装材料的浸出物，评估浸出物对产品质量与安全性的影响；考察贮藏过程中容器的密封性，确认无泄漏，保证产品无菌性；对于冻干产品，额外考察贮藏过程中水分含量的变化。6关键考察项目与质量属性要求6.1通用考察项目（适用于所有类型基因治疗产品）（1）外观性状：考察颜色、澄清度、可见异物、有无聚集沉淀，细胞产品考察细胞形态、有无结团、变色；（2）pH值与渗透压：液体制剂均需考察，pH变化反映制剂降解，渗透压变化影响细胞活性与临床使用安全性；（3）无菌与内毒素：所有基因治疗产品均需考察，贮藏过程中需保持无菌，内毒素符合限度要求；（4）含量与活性：含量包括核酸浓度、总病毒颗粒数、细胞计数等，活性包括感染性滴度、转导效率、目的基因表达水平、细胞活率、功能活性（如杀瘤活性、编辑效率）等，是核心考察指标，每个检测点均需检测；（5）纯度与杂质：包括产品纯度、宿主细胞蛋白残留、宿主DNA残留、工艺残留杂质（核酸酶、蛋白酶、佐剂残留）等，考察贮藏过程中杂质含量的变化；（6）产品相关杂质：包括降解产物、聚集物、空衣壳、失活活性成分等，考察贮藏过程中产品相关杂质是否升高。6.2不同类型产品的特殊考察项目（1）非病毒核酸类产品（质粒DNA、mRNA、小核酸、LNP递送产品等）：额外考察核酸完整性、核酸序列一致性、mRNA加帽效率、polyA尾长度、修饰碱基保留率、递送系统粒径、多分散性指数（PDI）、zeta电位、包封率、脂质过氧化程度；（2）病毒载体类基因治疗产品（AAV、慢病毒、腺病毒等）：额外考察感染性滴度、病毒基因组完整性、目的基因序列一致性、衣壳蛋白完整性、衣壳聚集率、空衣壳比例、复制型病毒含量；（3）体外基因修饰细胞产品（CAR-T、CAR-NK、基因编辑细胞、基因修饰干细胞等）：额外考察细胞活率、细胞计数、细胞表型（目标阳性细胞比例）、目的基因拷贝数、目的基因表达水平、细胞功能活性（细胞因子分泌、杀瘤活性、干性）、支原体、微生物污染、核型分析、插入位点分布稳定性；（4）基因编辑产品（CRISPR-Cas9RNP、碱基编辑器等）：额外考察编辑工具完整性、酶活性、gRNA完整性、编辑效率、脱靶效率稳定性。7稳定性数据分析与有效期确定7.1数据分析要求对所有稳定性数据进行趋势分析，针对有明显趋势变化的关键质量属性（如滴度、活率、活性），采用回归分析方法（一般为线性回归）计算降解速率，结合95%置信区间预测指标下降至合格限的时间；针对无明显趋势变化的指标（如pH、内毒素）采用描述性统计分析；评估不同批次、不同包装产品的稳定性一致性，分析批间差异对有效期的影响。7.2有效期确定原则（1）有效期必须基于长期稳定性研究数据确定，加速稳定性数据仅作为支持性数据，不得单独基于加速数据确定有效期；（2）所有关键质量属性在整个有效期内均必须符合预先设定的质量标准，任意关键指标超出合格限的时间即为有效期的截止时间；（3）拟定有效期需预留足够的安全空间，例如长期研究获得3年合格数据，拟定有效期一般不超过2年，避免临床使用过程中出现质量不合格；（4）临床早期样品的有效期可基于初步稳定性数据拟定，后续积累数据后逐步延长，活细胞产品有效期一般根据临床使用要求确定，通常为数小时至数周；（5）需明确特殊贮藏要求，如禁止反复冻融、避光等，在说明书中明确标注。8特殊考虑事项8.1联合使用产品的稳定性对于需要临用前混合的联合治疗产品（如基因编辑产品联合载体、基因治疗产品联合化疗药物），需考察混合后在临床使用条件下的稳定性，确定混合后的最长放置时限，明确混合过程中是否发生相互作用导致质量下降。8.2冻干制