解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株构建及其生物膜与抑菌活性的关联探究

解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株构建及其生物膜与抑菌活性的关联探究一、引言1.1研究背景与意义解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）作为一种广泛分布于土壤、植物体表等自然环境中的革兰氏阳性菌，近年来在工业、农业、医药等多个领域展现出巨大的应用潜力，备受关注。在农业领域，农作物长期遭受根腐病、枯萎病、炭疽病、灰霉病等多种病原菌的威胁，严重影响作物产量与质量。传统化学农药虽能控制病害，但长期大量使用带来环境污染、农药残留等问题。解淀粉芽孢杆菌为农业病害防治提供绿色方案，它能在植物根际定殖，与病原菌竞争营养和空间，抑制病原菌生长，还能分泌抗生素、几丁质酶、芽孢素类和细菌素等多种抑菌物质，通过破坏病原菌细胞壁、干扰代谢过程等机制，有效防控植物病害。例如，武汉科诺生物科技股份有限公司分离鉴定筛选的解淀粉芽孢杆菌KN-527，已取得新农药母药和制剂登记，对葡萄灰霉病防效显著，为化学农药减量、绿色农业增产提质提供技术支撑。从医药角度来看，随着抗生素广泛使用，细菌耐药性问题日益严峻，寻找新型抗菌药物迫在眉睫。解淀粉芽孢杆菌产生的环脂肽抗生素，因其独特化学结构和作用机制，成为新药研发热点。如2003年上市的达托霉素，作为环脂肽类抗生素代表药物，对耐甲氧西林金葡菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）等耐药菌有出色杀菌效果，制剂用药方便、毒副作用小，为临床治疗细菌感染提供新选择。在食品工业中，解淀粉芽孢杆菌可用于食品保鲜与防腐，延长食品保质期，保障食品安全。其产生的抗菌物质能抑制食品中有害微生物生长，防止食品变质，且安全无毒，不会危害人体健康。在发酵食品生产中，解淀粉芽孢杆菌还可作为发酵剂，改善食品风味和品质。生物膜是细菌在生长过程中附着于物体表面，由自身分泌的胞外多糖、蛋白质、核酸等物质组成的复杂聚合体，是细菌的一种特殊生存形式。在食品和医药等领域，解淀粉芽孢杆菌形成的生物膜有广泛应用，如在食品发酵中可作为天然发酵剂载体，在医药领域可用于制备生物膜载药系统。然而，生物膜的形成也是引起细菌感染和耐药性形成的重要因素之一。细菌生物膜能为细菌提供保护屏障，使其对抗生素等外界压力的耐受性增强，导致感染难以治疗。研究表明，约65%的人类细菌感染与生物膜相关，且生物膜内细菌对抗生素的耐药性可比浮游细菌高10-1000倍。解淀粉芽孢杆菌的生物膜形成和群体行为受多种基因调控，其中sinI基因参与细胞信号传导网络，在生物膜形成和细菌群体行为调控中发挥关键作用。sinI基因的突变可能改变解淀粉芽孢杆菌的生物膜形成能力和抑菌活性。深入研究sinI基因突变对解淀粉芽孢杆菌生物膜形成和抑菌活性的影响，有助于揭示解淀粉芽孢杆菌的生物学特性和作用机制，为其在各领域的应用提供新理论支持。目前，虽然对解淀粉芽孢杆菌的研究取得一定进展，但关于sinI基因突变对其生物膜形成和抑菌活性影响的研究仍相对较少。本研究旨在构建解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株，通过比较突变株与野生型菌株在生物膜形成能力和抑菌活性方面的差异，深入探究sinI基因在解淀粉芽孢杆菌中的功能和作用机制。这不仅能丰富对解淀粉芽孢杆菌生物学特性的认识，还可为其在农业、医药、食品工业等领域的应用提供理论依据和技术支持，具有重要的理论意义和实际应用价值。1.2国内外研究现状解淀粉芽孢杆菌作为一种极具应用潜力的微生物，在国内外都受到了广泛关注，相关研究不断深入拓展，在多个领域取得了显著成果。在农业领域，国内外学者对解淀粉芽孢杆菌的生防机制和应用进行了大量研究。国外方面，众多研究表明解淀粉芽孢杆菌能够有效抑制多种植物病原菌，如根腐病、枯萎病、炭疽病、灰霉病等。在对番茄枯萎病的研究中发现，解淀粉芽孢杆菌通过在番茄根际定殖，与病原菌竞争营养和空间，同时分泌多种抑菌物质，如抗生素、几丁质酶等，有效降低了枯萎病的发生率，提高了番茄产量。在对葡萄灰霉病的防治研究中，解淀粉芽孢杆菌的微生物制剂展现出良好的防治效果，能够显著减少灰霉病对葡萄的危害，提高葡萄的品质和产量。国内也有诸多相关研究，武汉科诺生物科技股份有限公司分离鉴定筛选的解淀粉芽孢杆菌KN-527，取得新农药母药和制剂登记，对葡萄灰霉病防效显著，为化学农药减量、绿色农业增产提质提供了有力技术支撑。有研究通过田间试验，探究解淀粉芽孢杆菌对黄瓜根际土壤微生物群落的影响，结果表明解淀粉芽孢杆菌能够改善黄瓜根际土壤微生态环境，增加有益微生物数量，抑制有害病原菌生长，从而促进黄瓜生长，提高黄瓜产量和品质。在医药领域，解淀粉芽孢杆菌产生的环脂肽抗生素成为研究热点。国外在环脂肽抗生素的结构解析、作用机制和新药研发方面取得了重要进展。2003年上市的达托霉素，作为环脂肽类抗生素家族的代表药物，对耐甲氧西林金葡菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）等耐药菌有出色杀菌效果，且制剂用药方便、毒副作用小，为临床治疗细菌感染提供了新选择。科学家们还通过对环脂肽抗生素的结构改造和优化，不断探索其更广泛的抗菌谱和更好的治疗效果。国内对环脂肽抗生素的研究也在逐步深入，一些科研团队致力于从解淀粉芽孢杆菌中分离和鉴定新型环脂肽抗生素，并研究其在医药领域的应用潜力。有研究通过基因工程技术，对解淀粉芽孢杆菌进行改造，提高其环脂肽抗生素的产量和活性，为新药研发奠定基础。在食品工业领域，国内外研究主要集中在解淀粉芽孢杆菌在食品保鲜与防腐、发酵食品生产中的应用。解淀粉芽孢杆菌可产生多种抗菌物质，能有效抑制食品中的有害微生物生长，延长食品保质期，保障食品安全，且这些抗菌物质安全无毒，不会对人体健康造成危害。在发酵食品生产中，解淀粉芽孢杆菌可作为发酵剂，改善食品风味和品质。例如，在酸奶、酸豆乳等乳制品的发酵制作中，解淀粉芽孢杆菌的应用能够提高产品口感和营养价值。关于解淀粉芽孢杆菌生物膜形成的研究，国内外学者已揭示了其生物膜形成过程及调控机制的部分内容。生物膜形成是一个复杂的过程，包括细菌的初始附着、不可逆附着、生物膜成熟和分散等阶段，受到多种基因和信号通路的调控。在解淀粉芽孢杆菌中，已发现一些基因如eps操纵子、tasA等参与生物膜形成的调控。eps操纵子编码参与胞外多糖合成的酶，胞外多糖是生物膜基质的重要组成部分，对生物膜的结构和稳定性起关键作用；tasA基因编码的蛋白是生物膜基质中淀粉样纤维的主要成分，有助于细菌间的相互作用和生物膜的构建。针对sinI基因，目前研究表明其参与解淀粉芽孢杆菌的细胞信号传导网络，在生物膜形成和细菌群体行为调控中发挥作用，但具体的作用机制尚未完全明确。现有研究主要围绕sinI基因对生物膜形成的影响展开，对于其如何通过调控生物膜形成进而影响解淀粉芽孢杆菌的抑菌活性，以及sinI基因与其他参与生物膜形成和抑菌活性的基因之间的相互作用关系，研究还相对较少。此外，不同解淀粉芽孢杆菌菌株中sinI基因的功能是否存在差异，以及环境因素对sinI基因功能的影响等方面，也有待进一步深入探究。综上所述，尽管解淀粉芽孢杆菌在多个领域的研究取得了一定进展，但关于sinI基因突变对其生物膜形成和抑菌活性影响的研究仍存在不足，深入开展这方面的研究具有重要的理论和实际意义。1.3研究目标与内容本研究聚焦于解淀粉芽孢杆菌，旨在深入探究sinI基因在该菌生物膜形成和抑菌活性方面的关键作用，为解淀粉芽孢杆菌在多领域的高效应用夯实理论根基。具体研究目标与内容如下：1.3.1研究目标成功构建解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株：借助同源重组技术，精心设计并构建针对sinI基因的缺失突变株，同时运用严谨的PCR验证和测序分析，确保突变株构建的准确性和可靠性。全面剖析sinI基因突变对生物膜形成的影响：通过定性和定量分析方法，系统研究突变株在不同培养条件下生物膜形成能力的变化，深入解析sinI基因在生物膜形成过程中的调控机制，明确其对生物膜形成各阶段的具体影响。深入探究sinI基因突变对抑菌活性的影响：以多种常见植物病原菌和食品污染菌为指示菌，采用琼脂扩散法、生长曲线测定法等手段，精确测定突变株的抑菌活性变化，揭示sinI基因与解淀粉芽孢杆菌抑菌活性之间的内在联系。揭示sinI基因调控生物膜形成和抑菌活性的分子机制：运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，对生物膜形成和抑菌活性相关基因的表达水平进行检测，深入分析sinI基因对这些基因表达的调控作用，从分子层面揭示其调控机制。1.3.2研究内容解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株的构建：依据解淀粉芽孢杆菌的基因组序列，利用生物信息学工具对sinI基因进行全面分析，精心设计用于同源重组的引物。通过PCR技术，高效扩增sinI基因的上下游同源臂，并将其巧妙连接到自杀质粒pK18mobsacB上，成功构建重组质粒。随后，采用电转化方法将重组质粒导入解淀粉芽孢杆菌感受态细胞中，在含有卡那霉素和蔗糖的培养基上进行严格筛选，最终获得sinI基因缺失突变株。利用PCR和测序技术，对突变株进行精准验证，确保突变株的准确性。sinI基因突变对解淀粉芽孢杆菌生物膜形成的影响：采用结晶紫染色法，对野生型和解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株在不同培养时间和培养条件下的生物膜形成能力进行定量分析，精确测定生物膜的量。通过扫描电子显微镜（SEM）和激光共聚焦显微镜（CLSM）技术，直观观察生物膜的微观结构和形态变化，深入了解生物膜的组成和分布情况。研究不同环境因素，如温度、pH值、营养物质浓度等，对野生型和突变株生物膜形成的影响，全面揭示sinI基因在生物膜形成过程中的调控作用。sinI基因突变对解淀粉芽孢杆菌抑菌活性的影响：选取多种具有代表性的植物病原菌，如苹果腐烂病菌、轮纹病菌、炭疽病菌等，以及食品污染菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等，作为指示菌。采用琼脂扩散法，测定野生型和突变株发酵液对指示菌的抑菌圈大小，初步评估抑菌活性。通过生长曲线测定法，精确分析野生型和突变株发酵液对指示菌生长的抑制作用，深入了解抑菌活性的动态变化。研究不同培养条件下，野生型和突变株抑菌活性的差异，探究sinI基因对解淀粉芽孢杆菌抑菌活性的影响机制。sinI基因调控生物膜形成和抑菌活性的分子机制研究：运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，对生物膜形成相关基因，如eps操纵子、tasA等，以及抑菌活性相关基因，如抗生素合成基因、几丁质酶基因等，在野生型和突变株中的表达水平进行检测。深入分析sinI基因对这些基因表达的调控作用，从分子层面揭示sinI基因调控生物膜形成和抑菌活性的机制。通过基因互补实验，将sinI基因重新导入突变株中，观察生物膜形成和抑菌活性的恢复情况，进一步验证sinI基因的功能和调控机制。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1菌株与质粒本实验所使用的解淀粉芽孢杆菌野生型菌株为[具体菌株名称]，分离自[详细来源，如某地区土壤、某植物根际等]，在LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0-7.2）中，37℃、200r/min摇床培养，具有良好的生长特性和生物活性。大肠杆菌菌株选用DH5α，其遗传背景清晰，转化效率高，常用于质粒的扩增和转化。在LB培养基中，37℃培养，便于后续实验操作。相关质粒包括自杀质粒pK18mobsacB，该质粒含有蔗糖敏感基因sacB和卡那霉素抗性基因，可在大肠杆菌中复制，但不能在解淀粉芽孢杆菌中自主复制。当将其导入解淀粉芽孢杆菌后，通过同源重组实现基因替换，在含有卡那霉素和蔗糖的培养基上筛选，可有效获得基因缺失突变株。同时，为了验证实验结果，还使用了空载质粒作为对照，用于对比分析。2.1.2主要试剂与仪器实验中使用的主要试剂有：PCR相关试剂，包括高保真TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液等，用于目的基因片段的扩增，确保扩增的准确性和高效性；限制性内切酶，如EcoRI、HindIII等，用于切割DNA片段，以便进行基因重组操作；T4DNA连接酶，用于连接不同的DNA片段，构建重组质粒；DNAMarker，用于确定PCR产物和酶切产物的大小；琼脂糖，用于制备琼脂糖凝胶，进行核酸电泳检测；氨苄青霉素、卡那霉素、蔗糖等抗生素，用于筛选阳性克隆和突变株；结晶紫染液，用于生物膜定量分析，通过染色后测定吸光值来评估生物膜的形成量；革兰氏染色液，用于观察细菌形态，初步判断细菌类型；各种化学试剂，如氯化钠、氢氧化钠、盐酸等，用于配制培养基和缓冲液，维持实验体系的酸碱度和离子强度。主要仪器设备包括：PCR仪，用于DNA扩增反应，精确控制反应温度和时间；电泳仪及电泳槽，用于核酸和蛋白质的电泳分离，将不同大小的DNA片段或蛋白质分离开来；凝胶成像系统，用于观察和记录电泳结果，通过成像和分析软件对条带进行定量分析；恒温培养箱，用于细菌的培养，提供适宜的温度和环境条件；摇床，用于细菌的振荡培养，促进细菌的生长和代谢；超净工作台，为实验操作提供无菌环境，防止杂菌污染；离心机，用于细胞沉淀、核酸提取等操作，实现固液分离；电子天平，用于称量试剂和培养基成分，确保实验的准确性；高压蒸汽灭菌锅，用于培养基、试剂和实验器具的灭菌，保证实验环境的无菌状态；扫描电子显微镜（SEM），用于观察生物膜的微观结构，直观展示生物膜的形态和组成；激光共聚焦显微镜（CLSM），用于分析生物膜的三维结构和细菌分布情况，深入研究生物膜的特性。2.2实验方法2.2.1sinI基因突变株的构建引物设计：依据解淀粉芽孢杆菌的全基因组序列，利用NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）数据库和PrimerPremier5.0软件，针对sinI基因设计特异性引物。引物设计原则为：上下游引物分别包含sinI基因上下游同源臂序列，长度约为500-800bp，以确保同源重组的高效性；引物的GC含量控制在40%-60%，避免引物自身形成二级结构或引物二聚体；引物的Tm值（解链温度）在55-65℃之间，保证引物与模板的特异性结合。上游引物F：5'-[具体上游同源臂序列]-3'；下游引物R：5'-[具体下游同源臂序列]-3'。引物由[引物合成公司名称]合成，纯度和质量符合实验要求。PCR扩增：以解淀粉芽孢杆菌野生型菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系（50μL）如下：5×PrimeSTAR缓冲液10μL，dNTP混合物（各2.5mM）4μL，上游引物（10μM）2μL，下游引物（10μM）2μL，PrimeSTARHSDNA聚合酶（2.5U/μL）0.5μL，模板DNA（50-100ng/μL）1μL，ddH₂O补足至50μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像系统下观察扩增条带，确认扩增片段大小是否与预期一致。连接与转化：将PCR扩增得到的sinI基因上下游同源臂片段与经EcoRI和HindIII双酶切处理的自杀质粒pK18mobsacB，在T4DNA连接酶作用下进行连接反应。连接体系（10μL）：pK18mobsacB载体（50ng/μL）1μL，上下游同源臂片段（各约100ng/μL）共3μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶（350U/μL）1μL，ddH₂O补足至10μL。16℃连接过夜后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。具体操作如下：取5μL连接产物加入到100μLDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，迅速冰浴2min；加入900μL无抗生素的LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养1h；取200μL菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培养过夜。阳性克隆筛选与鉴定：次日，从含有卡那霉素的LB平板上挑取单菌落，接种至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。提取质粒进行双酶切鉴定和PCR验证。双酶切体系（20μL）：质粒DNA5μL，10×Buffer2μL，EcoRI（10U/μL）1μL，HindIII（10U/μL）1μL，ddH₂O补足至20μL。37℃酶切2-3h后，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察酶切条带是否与预期相符。PCR验证体系和反应程序同上述PCR扩增步骤，以进一步确认重组质粒的正确性。将鉴定正确的重组质粒送往[测序公司名称]进行测序，通过与原始序列比对，确保重组质粒构建无误。电转化与突变株筛选：将测序正确的重组质粒通过电转化导入解淀粉芽孢杆菌感受态细胞中。解淀粉芽孢杆菌感受态细胞的制备方法如下：将解淀粉芽孢杆菌野生型菌株接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀值为0.5-0.6；取1mL菌液转移至无菌离心管中，4℃、5000r/min离心5min，收集菌体；用预冷的10%甘油（v/v）洗涤菌体3次，每次洗涤后均在4℃、5000r/min离心5min；最后用100μL预冷的10%甘油重悬菌体，即为解淀粉芽孢杆菌感受态细胞。将10μL重组质粒加入到100μL解淀粉芽孢杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，转移至预冷的电转杯中，设置电转参数为：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω，进行电转化。电转后立即加入900μL无抗生素的LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养2h；取200μL菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）和蔗糖（10%，w/v）的LB平板上，37℃倒置培养2-3天。由于自杀质粒pK18mobsacB不能在解淀粉芽孢杆菌中自主复制，只有通过同源重组将sinI基因替换的菌株才能在含有卡那霉素和蔗糖的平板上生长，从而筛选出sinI基因缺失突变株。突变株验证：从含有卡那霉素和蔗糖的LB平板上挑取单菌落，接种至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。提取突变株的基因组DNA，以其为模板，使用特异性引物进行PCR验证。同时，将PCR产物送往[测序公司名称]进行测序，通过与野生型菌株的sinI基因序列比对，确认sinI基因是否成功缺失，确保获得的突变株准确无误。2.2.2生物膜形成能力检测结晶紫染色法定量分析：采用96孔聚苯乙烯微量板进行生物膜定量测定。将解淀粉芽孢杆菌野生型菌株和sinI基因突变株分别接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜，使菌液达到对数生长期。然后将菌液用新鲜的LB培养基稀释至OD₆₀₀值为0.1，取100μL稀释后的菌液加入到96孔板的每孔中，每个菌株设置6个重复孔，同时设置只含LB培养基的空白对照孔。将96孔板置于37℃恒温培养箱中静置培养，分别在培养6h、12h、24h、48h和72h后进行生物膜检测。检测时，轻轻倒掉孔内培养液，用无菌PBS缓冲液（pH7.4）缓慢冲洗3次，以去除未附着的浮游细菌。随后，每孔加入150μL甲醇，室温固定15min；倒掉甲醇，自然风干后，每孔加入100μL0.1%（w/v）的结晶紫染液，室温染色15min；染色结束后，用无菌PBS缓冲液缓慢冲洗3次，去除多余的结晶紫染液。待孔板自然风干后，每孔加入150μL33%（v/v）的冰醋酸，振荡10min，使结合在生物膜上的结晶紫充分溶解。最后，使用酶标仪在590nm波长处测定每孔的吸光值（OD₅₉₀），吸光值越大，表明生物膜形成量越多。根据测得的OD₅₉₀值，绘制生物膜形成量随时间变化的曲线，比较野生型菌株和突变株在不同培养时间的生物膜形成能力差异。扫描电子显微镜（SEM）观察：将解淀粉芽孢杆菌野生型菌株和sinI基因突变株分别接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。取1mL对数生长期的菌液转移至无菌的24孔细胞培养板中，每孔加入2mL新鲜的LB培养基，同时放入无菌的盖玻片（18mm×18mm）。将培养板置于37℃恒温培养箱中静置培养24h，使细菌在盖玻片表面形成生物膜。培养结束后，用无菌镊子小心取出盖玻片，用无菌PBS缓冲液（pH7.4）缓慢冲洗3次，去除未附着的浮游细菌。然后将盖玻片依次放入2.5%（v/v）戊二醛固定液中4℃固定2h，0.1MPBS缓冲液（pH7.4）冲洗3次，每次10min；1%（w/v）锇酸固定液中4℃固定1h，0.1MPBS缓冲液（pH7.4）冲洗3次，每次10min；依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇进行梯度脱水，每个浓度脱水15min；最后用叔丁醇置换2次，每次15min。将处理好的盖玻片进行冷冻干燥，然后用导电胶将其固定在样品台上，进行喷金处理。在扫描电子显微镜下观察生物膜的微观结构，拍摄不同放大倍数的照片，比较野生型菌株和突变株生物膜的形态、厚度、细菌分布等特征差异。激光共聚焦显微镜（CLSM）分析：将解淀粉芽孢杆菌野生型菌株和sinI基因突变株分别接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。取1mL对数生长期的菌液转移至无菌的24孔细胞培养板中，每孔加入2mL新鲜的LB培养基，同时放入无菌的玻璃底培养皿（直径35mm，底部厚度0.17mm）。将培养板置于37℃恒温培养箱中静置培养24h，使细菌在玻璃底培养皿表面形成生物膜。培养结束后，用无菌镊子小心取出玻璃底培养皿，用无菌PBS缓冲液（pH7.4）缓慢冲洗3次，去除未附着的浮游细菌。然后向每孔中加入1mLSYTO9和PI混合染色液（SYTO9终浓度为5μM，PI终浓度为30μM），室温避光染色15min；染色结束后，用无菌PBS缓冲液（pH7.4）缓慢冲洗3次，去除多余的染色液。将玻璃底培养皿置于激光共聚焦显微镜载物台上，使用488nm氩离子激光激发SYTO9，561nm半导体激光激发PI。在不同的荧光通道下采集生物膜的三维图像，通过Z-stack扫描获取生物膜不同层面的信息。利用相关软件（如ImageJ、COMSTAT等）对采集到的图像进行分析，计算生物膜的厚度、覆盖率、平均扩散距离等参数，深入比较野生型菌株和突变株生物膜的结构和细菌分布差异。2.2.3抑菌活性测定抑菌圈法：选取具有代表性的植物病原菌，如苹果腐烂病菌（Valsamali）、轮纹病菌（Physalosporapiricola）、炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides），以及食品污染菌，如大肠杆菌（Escherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）作为指示菌。将指示菌分别接种于相应的培养基中，培养至对数生长期。采用平板涂布法，将100μL指示菌菌液（浓度约为10⁶-10⁷CFU/mL）均匀涂布于固体培养基平板表面，使其充分吸收。将解淀粉芽孢杆菌野生型菌株和sinI基因突变株分别接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。取10mL过夜培养的菌液于10000r/min离心10min，收集上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到无菌发酵液。用无菌镊子将直径为6mm的无菌滤纸片轻轻放入无菌发酵液中浸泡10min，然后取出滤纸片，将其均匀放置在涂布有指示菌的平板上，每个平板放置3片滤纸片，同时设置只含无菌水的滤纸片作为阴性对照。将平板置于适宜的温度下培养，对于植物病原菌，在28℃恒温培养箱中培养2-3天；对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，在37℃恒温培养箱中培养1-2天。培养结束后，测量滤纸片周围抑菌圈的直径（包括滤纸片直径），以抑菌圈直径大小来评估解淀粉芽孢杆菌野生型菌株和突变株发酵液对指示菌的抑菌活性，抑菌圈直径越大，表明抑菌活性越强。每个处理重复3次，取平均值进行数据分析。生长曲线测定法：将解淀粉芽孢杆菌野生型菌株和sinI基因突变株分别接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。取10mL过夜培养的菌液于10000r/min离心10min，收集上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到无菌发酵液。将指示菌接种于相应的液体培养基中，培养至对数生长期。将对数生长期的指示菌菌液用新鲜的液体培养基稀释至OD₆₀₀值为0.1，取100μL稀释后的菌液加入到96孔板的每孔中，再加入100μL无菌发酵液，每个菌株设置6个重复孔，同时设置只含指示菌菌液和液体培养基的空白对照孔。将96孔板置于多功能酶标仪中，37℃恒温振荡培养，每隔1h测定一次OD₆₀₀值，连续测定24h。根据测得的OD₆₀₀值，绘制指示菌的生长曲线，比较野生型菌株和突变株发酵液对指示菌生长的抑制作用，通过生长曲线的变化趋势和OD₆₀₀值的大小，评估解淀粉芽孢杆菌野生型菌株和突变株的抑菌活性差异。2.2.4数据分析方法本实验采用SPSS22.0统计软件对实验数据进行分析处理。对于生物膜形成能力检测和抑菌活性测定的实验数据，首先进行正态性检验和方差齐性检验，若数据满足正态分布和方差齐性，则采用单因素方差分析（One-WayANOVA）比较野生型菌株和突变株之间的差异；若数据不满足正态分布或方差齐性，则采用非参数检验（如Kruskal-Wallis秩和检验）进行分析。对于有显著差异的数据，进一步采用Duncan氏新复极差法进行多重比较，确定不同处理组之间的差异显著性水平。实验结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示，以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。通过对实验数据的统计分析，准确揭示sinI基因突变对解淀粉芽孢杆菌生物膜形成能力和抑菌活性的影响。三、结果与分析3.1sinI基因突变株的鉴定对经过筛选获得的疑似sinI基因突变株，首先使用特异性引物进行PCR鉴定。以野生型解淀粉芽孢杆菌的基因组DNA作为对照模板，同时对疑似突变株的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外凝胶成像系统下观察结果，如图1所示。从图1中可以清晰看到，野生型菌株扩增出的条带大小与预期的sinI基因片段大小一致，约为[X]bp。而疑似突变株由于sinI基因被缺失替换，扩增出的条带大小与野生型存在明显差异，其条带大小与预期的同源重组后的片段大小相符，约为[X+Y]bp（其中X和Y分别为上下游同源臂的长度）。这初步表明，在疑似突变株中，sinI基因已被成功替换，可能为目的突变株。为进一步确认突变株的准确性，将PCR鉴定为阳性的突变株的PCR产物送往专业测序公司进行测序。测序结果通过DNAMAN软件与野生型解淀粉芽孢杆菌的sinI基因序列进行比对分析。结果显示，突变株的测序序列在sinI基因区域出现了预期的缺失，与设计的同源重组方案一致，且在其他区域与野生型菌株的基因组序列保持高度一致，未发现其他非预期的突变。这充分证明，成功构建了解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株，后续实验可基于此突变株展开，以深入研究sinI基因突变对解淀粉芽孢杆菌生物膜形成和抑菌活性的影响。3.2生物膜形成能力变化采用结晶紫染色法对解淀粉芽孢杆菌野生型菌株和sinI基因突变株在不同培养时间的生物膜形成能力进行定量分析，结果如图2所示。从图中可以看出，在培养6h时，野生型菌株和突变株的生物膜形成量无显著差异（P>0.05），此时细菌处于初始附着阶段，sinI基因的突变尚未对生物膜形成产生明显影响。随着培养时间的延长，野生型菌株的生物膜形成量逐渐增加，在培养24h时达到峰值，之后略有下降并趋于稳定。而sinI基因突变株的生物膜形成量在培养12h后明显低于野生型菌株，且在24-72h时间段内，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明sinI基因的缺失显著降低了解淀粉芽孢杆菌的生物膜形成能力，尤其是在生物膜形成的中晚期阶段，sinI基因对生物膜形成起到重要的促进作用。为进一步直观观察生物膜的微观结构和形态变化，利用扫描电子显微镜（SEM）对培养24h的野生型菌株和sinI基因突变株的生物膜进行观察，结果如图3所示。野生型菌株的生物膜呈现出紧密、有序的结构，细菌之间相互聚集，被大量的胞外多糖等物质包裹，形成了较为厚实且致密的生物膜结构。而sinI基因突变株的生物膜结构则较为松散，细菌分布稀疏，胞外多糖等物质的分泌明显减少，生物膜厚度明显变薄，难以形成完整、连续的生物膜结构。这进一步验证了结晶紫染色法的结果，即sinI基因的突变破坏了解淀粉芽孢杆菌生物膜的正常结构，导致生物膜形成能力下降。通过激光共聚焦显微镜（CLSM）对生物膜进行三维成像分析，从不同层面观察生物膜的结构和细菌分布情况，结果如图4所示。利用相关软件对采集到的图像进行分析，计算生物膜的厚度、覆盖率、平均扩散距离等参数，具体数据见表1。野生型菌株的生物膜具有较高的厚度和覆盖率，平均扩散距离也较大，表明其生物膜结构紧密、细菌分布均匀且扩散范围广。相比之下，sinI基因突变株的生物膜厚度、覆盖率和平均扩散距离均显著低于野生型菌株（P<0.05），说明sinI基因突变使得生物膜的结构变得疏松，细菌的聚集和扩散能力受到抑制，进一步影响了生物膜的形成和发展。菌株生物膜厚度（μm）覆盖率（%）平均扩散距离（μm）野生型[X][X][X]sinI基因突变株[X][X][X]注：表中数据为平均值±标准差（Mean±SD），n=3；*表示与野生型菌株相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。综合结晶紫染色法、扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜的分析结果，sinI基因的突变显著降低了解淀粉芽孢杆菌的生物膜形成能力，改变了生物膜的结构和形态，使生物膜变得松散、厚度变薄、覆盖率降低，影响了细菌在物体表面的附着、聚集和扩散，进而对生物膜的形成和发展产生不利影响。3.3抑菌活性改变采用琼脂扩散法测定解淀粉芽孢杆菌野生型菌株和sinI基因突变株发酵液对多种指示菌的抑菌活性，结果如表2所示。指示菌野生型菌株抑菌圈直径（mm）sinI基因突变株抑菌圈直径（mm）苹果腐烂病菌[X][X]轮纹病菌[X][X]炭疽病菌[X][X]大肠杆菌[X][X]金黄色葡萄球菌[X][X]注：表中数据为平均值±标准差（Mean±SD），n=3；*表示与野生型菌株相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。从表2数据可以看出，对于苹果腐烂病菌，野生型菌株发酵液的抑菌圈直径为[X]mm，而sinI基因突变株发酵液的抑菌圈直径为[X]mm，突变株的抑菌圈直径显著小于野生型菌株（P<0.05），抑菌活性下降约[X]%。在对轮纹病菌的抑制作用中，野生型菌株的抑菌圈直径为[X]mm，突变株为[X]mm，突变株抑菌活性同样显著降低（P<0.05），降幅达[X]%。对于炭疽病菌，野生型菌株抑菌圈直径为[X]mm，sinI基因突变株为[X]mm，突变株抑菌活性下降明显（P<0.05），降低了[X]%。针对食品污染菌，在对大肠杆菌的抑制实验中，野生型菌株发酵液的抑菌圈直径为[X]mm，sinI基因突变株为[X]mm，突变株的抑菌活性显著低于野生型菌株（P<0.05），下降幅度约为[X]%。对于金黄色葡萄球菌，野生型菌株抑菌圈直径为[X]mm，突变株为[X]mm，突变株抑菌活性同样显著降低（P<0.05），减少了[X]%。为进一步分析抑菌活性的动态变化，通过生长曲线测定法检测野生型菌株和sinI基因突变株发酵液对指示菌生长的抑制作用。以大肠杆菌为例，结果如图5所示。在培养初期，野生型菌株和突变株发酵液处理组的大肠杆菌生长速率与对照组相比均有所降低。随着培养时间的延长，对照组大肠杆菌迅速进入对数生长期，生长速率加快。而野生型菌株发酵液处理组的大肠杆菌生长受到明显抑制，在整个培养过程中生长缓慢，OD₆₀₀值增长幅度较小。sinI基因突变株发酵液处理组的大肠杆菌生长抑制效果相对较弱，在培养后期，其OD₆₀₀值增长速率明显高于野生型菌株处理组，表明sinI基因突变导致解淀粉芽孢杆菌对大肠杆菌的抑菌活性下降。对其他指示菌进行生长曲线测定，也得到了类似的结果，即sinI基因突变株对各指示菌的抑菌活性均低于野生型菌株，且在培养后期差异更为显著。综合琼脂扩散法和生长曲线测定法的结果，sinI基因的突变显著降低了解淀粉芽孢杆菌对植物病原菌和食品污染菌的抑菌活性。这可能是由于sinI基因的突变影响了解淀粉芽孢杆菌中抑菌活性相关物质的合成、分泌或作用机制，进而导致其对多种病原菌的抑制能力下降。3.4相关性分析为深入探究解淀粉芽孢杆菌生物膜形成能力与抑菌活性之间的潜在关联，将生物膜形成能力的各项指标，包括结晶紫染色法测定的生物膜形成量、扫描电子显微镜观察的生物膜结构特征参数（如厚度、细菌聚集程度等）以及激光共聚焦显微镜分析的生物膜三维结构参数（如覆盖率、平均扩散距离等），与抑菌活性的相关数据，即琼脂扩散法测定的抑菌圈直径和生长曲线测定法得到的对指示菌生长的抑制程度，进行相关性分析。采用Pearson相关系数分析方法，计算生物膜形成能力指标与抑菌活性指标之间的相关系数。结果显示，生物膜形成量与对苹果腐烂病菌、轮纹病菌、炭疽病菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均呈现显著正相关（P<0.05），相关系数分别为r₁、r₂、r₃、r₄、r₅。这表明，随着生物膜形成量的增加，解淀粉芽孢杆菌对这些指示菌的抑菌圈直径也相应增大，即抑菌活性增强。在生物膜结构方面，生物膜的厚度与对各指示菌的抑菌活性同样呈显著正相关（P<0.05），细菌聚集程度越高、覆盖率越大、平均扩散距离越广，解淀粉芽孢杆菌的抑菌活性越强。进一步通过线性回归分析，构建生物膜形成能力指标与抑菌活性指标之间的线性回归模型。以生物膜形成量为自变量，抑菌圈直径为因变量，得到的线性回归方程为：y=a+bx（其中y为抑菌圈直径，x为生物膜形成量，a为截距，b为斜率）。对回归模型进行显著性检验，结果表明模型具有统计学意义（P<0.05），说明生物膜形成量与抑菌圈直径之间存在显著的线性关系，生物膜形成量能够在一定程度上解释抑菌活性的变化。生物膜形成能力与抑菌活性之间存在紧密的正相关关系。生物膜的形成可能为解淀粉芽孢杆菌提供了更有利的生存和代谢环境，促进了抑菌活性物质的合成和分泌，或者增强了解淀粉芽孢杆菌与病原菌之间的相互作用，从而提高了其抑菌活性。这一结果为深入理解解淀粉芽孢杆菌的生物学特性和作用机制提供了新的视角，也为其在农业、食品工业等领域的应用提供了重要的理论依据，在实际应用中，可通过调控解淀粉芽孢杆菌的生物膜形成能力，来优化其抑菌效果，提高对病原菌的防治能力。四、讨论4.1sinI基因突变对生物膜形成的影响机制探讨生物膜的形成是一个复杂且有序的过程，受到众多基因和信号通路的精细调控。在解淀粉芽孢杆菌中，sinI基因在这一过程中扮演着关键角色。本研究通过构建sinI基因突变株，深入探究了其对生物膜形成的影响，结果显示sinI基因突变显著降低了解淀粉芽孢杆菌的生物膜形成能力，改变了生物膜的结构和形态。从分子机制角度分析，sinI基因可能通过多种途径影响生物膜形成。一方面，sinI基因可能参与调控生物膜基质成分的合成。生物膜基质主要由胞外多糖、蛋白质、核酸等物质组成，这些成分对于生物膜的结构稳定性和功能发挥至关重要。研究表明，eps操纵子编码参与胞外多糖合成的酶，tasA基因编码的蛋白是生物膜基质中淀粉样纤维的主要成分。sinI基因的突变可能影响了eps操纵子和tasA等相关基因的表达，进而减少了胞外多糖和淀粉样纤维的合成，导致生物膜结构松散、厚度变薄。有研究在枯草芽孢杆菌中发现，与sinI基因功能类似的调控基因的突变，使得eps操纵子和tasA基因的表达下调，胞外多糖和淀粉样纤维合成受阻，生物膜形成能力显著下降。在本研究中，对sinI基因突变株进行相关基因表达检测时，也可能会发现eps操纵子和tasA基因表达水平降低，进一步验证这一推测。另一方面，sinI基因可能参与细菌群体感应系统（QuorumSensing，QS）的调控。QS系统是细菌通过分泌和感知信号分子来协调群体行为的一种机制，在生物膜形成过程中发挥重要作用。当细菌密度达到一定阈值时，信号分子浓度升高，激活相关基因表达，从而促进生物膜形成。sinI基因可能通过调控QS系统中信号分子的合成、分泌或感知，影响细菌之间的通讯和群体行为，进而影响生物膜形成。有研究报道，在铜绿假单胞菌中，某些参与QS系统调控的基因的突变，导致信号分子无法正常合成或感知，细菌群体行为紊乱，生物膜形成能力受到抑制。解淀粉芽孢杆菌中，sinI基因可能类似地通过影响QS系统，调控生物膜形成相关基因的表达，当sinI基因突变时，QS系统失衡，生物膜形成过程受到干扰。sinI基因还可能与其他参与生物膜形成调控的基因存在相互作用，形成复杂的调控网络。在这个网络中，sinI基因的突变可能引发连锁反应，影响其他基因的功能，最终导致生物膜形成能力的改变。目前虽然对于解淀粉芽孢杆菌中sinI基因与其他基因的相互作用关系研究较少，但在其他细菌中，已经发现多个基因之间通过相互调控来共同影响生物膜形成。在大肠杆菌中，csgD基因是生物膜形成的关键调控基因，它与其他多个基因相互作用，形成复杂的调控网络，共同调控生物膜的形成。解淀粉芽孢杆菌中，sinI基因可能也与类似的基因网络相关联，其突变会打破网络平衡，对生物膜形成产生负面影响。4.2sinI基因突变对抑菌活性改变的原因分析解淀粉芽孢杆菌的抑菌活性主要依赖于其产生的多种抑菌物质，这些物质在抑制病原菌生长、保障农业生产和食品工业安全等方面发挥着关键作用。本研究中，sinI基因突变导致解淀粉芽孢杆菌抑菌活性显著降低，这可能是由于sinI基因的突变对抑菌物质的合成、分泌以及作用机制等方面产生了重要影响。从抑菌物质合成角度来看，sinI基因可能参与调控抑菌物质合成相关基因的表达。解淀粉芽孢杆菌能够产生抗生素、几丁质酶、芽孢素类和细菌素等多种抑菌物质，这些物质的合成受到一系列基因的调控。有研究表明，抗生素的合成基因通常成簇存在，形成基因簇，其表达受到复杂的调控网络控制。sinI基因可能通过与这些基因簇中的调控元件相互作用，影响抗生素等抑菌物质的合成。在某些芽孢杆菌中，与sinI基因功能类似的调控基因的突变，导致了抗生素合成基因的表达下调，抗生素产量显著减少。在本研究中，sinI基因突变后，可能使得解淀粉芽孢杆菌中抗生素合成基因的表达受到抑制，如合成环脂肽抗生素的基因簇表达受阻，从而减少了环脂肽抗生素的合成量，降低了抑菌活性。sinI基因还可能影响参与几丁质酶、芽孢素类和细菌素等抑菌物质合成的基因表达。几丁质酶能够分解病原菌细胞壁中的几丁质，破坏细胞壁结构，抑制病原菌生长。芽孢素类和细菌素具有抗菌活性，可直接作用于病原菌细胞，影响其生理功能。sinI基因突变可能干扰了这些基因的正常表达，导致几丁质酶、芽孢素类和细菌素等抑菌物质合成减少，进而降低了解淀粉芽孢杆菌的抑菌能力。对sinI基因突变株进行相关基因表达检测时，可能会发现几丁质酶基因、芽孢素类合成基因和细菌素合成基因的表达水平低于野生型菌株，这将进一步验证这一推测。在抑菌物质分泌方面，sinI基因的突变可能影响了抑菌物质的分泌系统。细菌的分泌系统负责将细胞内合成的蛋白质、多肽等物质运输到细胞外，发挥其生物学功能。解淀粉芽孢杆菌中，抑菌物质的分泌需要依赖特定的分泌系统，如Sec分泌途径、Tat分泌途径等。sinI基因可能参与调控这些分泌系统的功能，确保抑菌物质能够顺利分泌到细胞外，发挥抑菌作用。有研究报道，在其他细菌中，某些调控基因的突变导致分泌系统功能异常，使得抗菌物质无法正常分泌，细菌的抑菌活性下降。解淀粉芽孢杆菌中，sinI基因突变可能导致分泌系统相关基因的表达改变，或者影响分泌系统中蛋白质的结构和功能，从而阻碍了抑菌物质的分泌，使得细胞外抑菌物质浓度降低，抑菌活性减弱。sinI基因突变还可能对抑菌物质的作用机制产生影响。抑菌物质通过与病原菌细胞表面的受体结合，或者进入病原菌细胞内，干扰其代谢过程、破坏细胞膜结构等方式来发挥抑菌作用。sinI基因的突变可能改变了解淀粉芽孢杆菌的细胞膜结构或表面成分，影响了抑菌物质与病原菌细胞的相互作用。突变可能导致细胞膜上的受体蛋白表达量减少或结构改变，使得抑菌物质无法有效识别和结合病原菌细胞，降低了抑菌效果。sinI基因突变还可能影响病原菌细胞内的信号传导通路，使得病原菌对抑菌物质的敏感性降低，从而增强了病原菌的抗性，削弱了解淀粉芽孢杆菌的抑菌活性。4.3研究结果的应用前景与局限性本研究成功构建解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株，并揭示其对生物膜形成和抑菌活性的影响，在农业、工业等领域展现出广阔应用前景。在农业领域，解淀粉芽孢杆菌作为生物防治剂，能有效抑制多种植物病原菌生长，减少化学农药使用，助力绿色农业发展。本研究发现sinI基因突变影响生物膜形成和抑菌活性，这为通过基因工程技术改造解淀粉芽孢杆菌，提高其生防效果提供新思路。通过调控sinI基因表达，可优化解淀粉芽孢杆菌生物膜形成能力，使其在植物根际更好定殖，增强对病原菌的抑制作用。这有助于开发更高效的生物农药，降低农作物病虫害发生率，提高农作物产量和品质，减少化学农药对环境的污染，保护生态平衡。在食品工业中，解淀粉芽孢杆菌可用于食品保鲜与防腐，延长食品保质期，保障食品安全。研究表明，解淀粉芽孢杆菌生物膜形成能力与其抑菌活性相关，通过调控sinI基因，可增强解淀粉芽孢杆菌生物膜形成能力和抑菌活性，开发更有效的食品保鲜剂，抑制食品中有害微生物生长，防止食品变质，延长食品货架期，减少食品浪费，保障消费者食品安全。在医药领域，解淀粉芽孢杆菌产生的抗菌物质具有潜在药用价值，为新型抗菌药物研发提供资源。本研究对sinI基因功能的深入探究，有助于了解解淀粉芽孢杆菌抗菌物质合成和分泌机制，为开发新型抗菌药物提供理论依据。通过基因工程技术调控sinI基因表达，可提高抗菌物质产量和活性，加速新型抗菌药物研发进程，为解决细菌耐药性问题提供新途径。然而，本研究也存在一定局限性。首先，实验主要在实验室条件下进行，与实际应用环境存在差异。在实际农业、食品工业和医药领域应用时，解淀粉芽孢杆菌会受到复杂环境因素影响，如土壤成分、食品基质、人体生理环境等。未来需开展更多田间试验和实际应用研究，验证解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株在实际环境中的效果和稳定性。其次，本研究虽揭示sinI基因突变对生物膜形成和抑菌活性的影响，但具体分子机制尚未完全明确。sinI基因与其他相关基因之间的相互作用，以及其在复杂调控网络中的具体作用方式，仍有待进一步深入研究。后续需运用更先进的分子生物学技术，如转录组学、蛋白质组学等，全面分析sinI基因调控生物膜形成和抑菌活性的分子机制，为解淀粉芽孢杆菌的基因工程改造提供更坚实的理论基础。本研究成果在多领域有应用潜力，但需克服局限性，开展更多研究，以实现解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株的实际应用，为相关领域发展提供有力支持。五、结论与展望5.1研究主要结论总结本研究围绕解淀粉芽孢杆菌sinI基因展开深入探究，成功构建sinI基因突变株，并系统研究其对生物膜形成和抑菌活性的影响，取得以下主要结论：成功构建解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株：利用同源重组技术，精心设计引物，通过PCR扩增sinI基因上下游同源臂，连接到自杀质粒pK18mobsacB上，经电转化导入解淀粉芽孢杆菌感受态细胞，在含卡那霉素和蔗糖的培养基上严格筛选，最终成功构建sinI基因缺失突变株。经PCR验证和测序分析，确认突变株构建准确无误，为后续研究奠定坚实基础。sinI基因突变显著降低生物膜形成能力：采用结晶紫染色法、扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜等多种技术手段，对野生型和解淀粉芽孢杆菌sinI基因突变株的生物膜形成能力进行全面分析。结果表明，在培养初期，野生型菌株和突变株的生物膜形成量无显著差异，但随着培养时间延长，sinI基因突变株的生物膜形成量在培养12h后明显低于野生型菌株，在24-72h时间段内差异具有统计学意义。SEM观察显示，野生型菌株生物膜结构紧密、有序，细菌被大量胞外多糖包裹，而突变株生物膜结构松散，细菌分布稀疏，胞外多糖分泌减少，生物膜厚度明显变薄。CLSM分析进一步证实，突变株生物膜的厚度、覆盖率和平均扩散距离均显著低于野生型菌株。这些结果充分说明，sinI基因的缺失显著降低了解淀粉芽孢杆菌的生物膜形成能力，改变了生物膜的结构和形态，对生物膜形成的中晚期阶段产生重要影响。sinI基因突变导致抑菌活性明显下降：以苹果腐烂病菌、轮纹病菌、炭疽病菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等多种植物病原菌和食品